बी सेल प्रतिरक्षा Synapse में Actin और Microtubule Cytoskeletons visualizing प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी का उपयोग
Summary
हम एक साथ STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान छवि actin संरचनाओं, microtubules, और microtubule प्लस बी कोशिकाओं है कि बी सेल रिसेप्टर, प्रारंभिक चरण के लिए एक मॉडल के लिए एंटीबॉडी के साथ लेपित coverslips पर फैल गया है में अंत बंधन प्रोटीन प्रतिरक्षा synapse गठन की ।
Abstract
बी कोशिकाओं है कि झिल्ली के लिए बाध्य प्रतिजनों (उदाहरण के लिए, एक प्रतिजन प्रस्तुत कक्ष की सतह पर) एक प्रतिरक्षा synapse, एक विशेष सेलुलर संरचना है कि बी-सेल रिसेप्टर (BCR) संकेतन और BCR मध्यस्थता प्रतिजन अधिग्रहण का अनुकूलन के रूप में। actin cytoskeleton और प्रतिजन संपर्क साइट की दिशा में microtubule नेटवर्क के पुनर्अभिविन्यास के दोनों remodeling प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए आवश्यक हैं । एफ-actin के एक घने परिधीय अंगूठी में actin cytoskeleton के remodeling microtubule के ध्रुवीकरण के साथ है-प्रतिरक्षा synapse की ओर केंद्र का आयोजन । Microtubule प्लस अंत बंधन प्रोटीन, साथ ही cortical प्लस अंत पर कब्जा प्रोटीन actin और Microtubule cytoskeletons, जो उंहें एक समंवित तरीके से पुनर्गठित किया जा करने की अनुमति के बीच शारीरिक बातचीत मध्यस्थता । Elucidating तंत्र है कि नियंत्रण इस cytoskeletal पुनर्गठन, साथ ही साथ समझ कैसे इन cytoskeletal संरचनाओं आकार प्रतिरक्षा synapse गठन और BCR संकेतन, बी सेल सक्रियण में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यह सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण है कि cytoskeletal नेटवर्क संगठन के नए विवरण प्रकट के विकास के द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है । हम यहां का वर्णन एक विधि का उपयोग करने के लिए प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी करने के लिए एक साथ छवि actin संरचनाओं, microtubules, और transfected GFP-टैग microtubule प्लस-बी कोशिकाओं में बंधन प्रोटीन अंत । प्रतिरक्षा synapse गठन में जल्दी घटनाओं मॉडल, हम बी कोशिकाओं विरोधी immunoglobulin (विरोधी ़) एंटीबॉडी, जो BCR संकेतन और cytoskeleton remodeling आरंभ के साथ लेपित coverslips पर प्रसार करने के लिए अनुमति देते हैं । हम A20 बी-लिंफोमा कोशिकाओं में GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विरोधी के लिए-़ प्रेरित सेल प्रसार, और बाद में सेल निर्धारण, Immunostaining, छवि अधिग्रहण, और छवि deconvolution कदम के लिए । इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त उच्च संकल्प छवियों को एक साथ एक साथ actin संरचनाओं, microtubules कल्पना, और microtubule प्लस अंत बाध्यकारी प्रोटीन है कि इन दो cytoskeletal नेटवर्क को लिंक कर सकते हैं ।
Introduction
जब बी कोशिकाओं प्रतिजनों के ध्रुवीकरण arrays के लिए बाइंड (उदा, antigen-पेश कोशिकाओं (APCs) की सतह पर प्रदर्शित), जिसके परिणामस्वरूप बी-सेल रिसेप्टर (BCR) संकेत एक क्लासिक प्रतिरक्षा synapse संरचना है, जो पहले में वर्णित किया गया था के गठन ड्राइव टी कोशिकाओं1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. प्रारंभ में, microclusters की परिधि में antigen-बाउंड BCRs प्रपत्र का B कक्ष: APC संपर्क साइट । ये microclusters तब antigen संपर्क साइट के केंद्र की ओर ले जाएं, जहां वे एक केंद्रीय supramolecular सक्रियण क्लस्टर (cSMAC) जो प्रतिरक्षा synapse के मूल रूपों में एक साथ जुड़ते हैं । प्रतिरक्षा synapse गठन BCR संकेतन का अनुकूलन और APC झिल्ली से BCR-मध्यस्थता प्रतिजन निष्कर्षण की सुविधा14. यह antigen प्राप्ति, जो BCR-मध्यस्थ antigen internalization और क्रमिक antigen संसाधन के बाद है, B कक्ष पेप्टाइड को पेश करने के लिए अनुमति देता है: MHC द्वितीय के लिए टी कोशिकाओं और बटोरना टी सेल सहायता14। क्योंकि प्रतिरक्षा synapse गठन को बढ़ावा देता है बी सेल सक्रियण, elucidating तंत्र है कि रिसेप्टर संगठन के इस कार्यात्मक पैटर्न की स्थापना कैसे विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है शुरू की और विनियमित रहे हैं ।
दोनों actin और microtubule cytoskeletons के पुनर्गठन प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए आवश्यक है । स्थानीयकृत BCR संकेतन प्रतिजनों की एक विशेष रूप से-ध्रुवीय सरणी द्वारा उत्तेजित actin cytoskeleton1,15के तेजी से और नाटकीय remodeling लाती है । बी सेल की परिधि में वृक्ष actin संरचनाओं के गठन प्लाज्मा झिल्ली पर बलों धक्का डालती है और बी सेल प्रसार को बढ़ावा देता है । यह B कक्ष antigen-असर सतह का एक बड़ा क्षेत्र को स्कैन करने के लिए अनुमति देता है, और BCRs की संख्या को बढ़ाता है जो antigen बाइंड और BCR संकेतन मार्ग को सक्रिय करें । एक ही समय में, MTOC और microtubule नेटवर्क antigen संपर्क की साइट की ओर reओरिएंटेड हैं । के रूप में MTOC प्रतिजन संपर्क साइट दृष्टिकोण, MTOC से निकल microtubules बी सेल और प्रतिजन-असर सतह16,17के बीच इंटरफेस पर प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी चेहरे के साथ विस्तार । इन juxtamembrane microtubules तो dynein के मध्यस्थ गड़बडिय़ों आंदोलन के लिए पटरियों के रूप में कार्य कर सकते हैं प्रतिजन बाध्य BCR microclusters18, एक cSMAC के गठन के लिए अग्रणी.
पुनर्अभिविन्यास और प्रतिरक्षा synapse की ओर MTOC के ध्रुवीकरण बरकरार actin और microtubule cytoskeletons की आवश्यकता है, और अक्सर cortical actin नेटवर्क और microtubules के बीच बातचीत पर निर्भर करता है,17, 19,20. Cortical actin-बंधन प्रोटीन, IQGAP1 के रूप में, microtubule प्लस-समाप्त होता है कि सजाने प्रोटीन परिसरों के साथ बातचीत के द्वारा microtubules कब्जा कर सकते हैं21. प्लस अंत बाध्यकारी प्रोटीन के इन गतिशील परिसरों EB1 और क्लिप 170, जो सामूहिक रूप से microtubule प्लस अंत ट्रैकिंग प्रोटीन (+ टिप्स)21,22के रूप में जाना जाता है शामिल हैं । + microtubules के सिरों पर सुझाव है कि या तो प्लाज्मा झिल्ली या cortical actin cytoskeleton के साथ जुड़े रहे है प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते हैं । यह बल-तंत्र पैदा करने की अनुमति देता है (जैसे, शूंय से अंत cortically-लंगर dynein microtubules के साथ आंदोलन का निर्देश दिया) microtubules पर खींच बलों लागू है, और इस तरह MTOC की स्थिति । CLIP-170 actin-जुड़े मचान प्रोटीन IQGAP123के लिए बाध्य कर सकते हैं, और हमें पता चला है कि इन दोनों प्रोटीन के प्रतिरक्षा synapse17के प्रति BCR प्रेरित MTOC ध्रुवीकरण के लिए आवश्यक हैं । इस IQGAP1-CLIP-170 बातचीत बी सेल प्रतिरक्षा synapse में microtubule नेटवर्क की स्थिति के साथ actin cytoskeleton के remodeling समंवय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।
पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी बी के दौरान actin और microtubule cytoskeletons के नाटकीय पुनर्गठन से पता चला है कोशिका प्रतिरक्षा synapse गठन2। हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रकाश की विवर्तन सीमा के कारण विस्तार में छोटे सेलुलर संरचनाओं को हल नहीं कर सकते, जो, अब्बे कानून के अनुसार, के लिए नमूना रोशन और उद्देश्य24के एपर्चर इस्तेमाल किया प्रकाश की तरंग दैर्ध्य पर निर्भर है । यह विवर्तन सीमा परम्परागत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प को पार्श्व दिशा में २००-३०० एनएम तक और 500-700 एनएम को अक्षीय दिशा में25में रखने के लिए विवश करती है । इसलिए, छोटे सेलुलर संरचनाओं, साथ ही actin और microtubule cytoskeletons के ठीक विवरण, केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया जा सकता है । cytoskeleton की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग समय लेने वाली है, कठोर नमूना निर्धारण और तैयारी प्रोटोकॉल है कि जैविक संरचनाओं में परिवर्तन कर सकते हैं की आवश्यकता है, और एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए सीमित है. immunostain करने की क्षमता और एक साथ कई प्रोटीन या सेलुलर संरचनाओं छवि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का एक बड़ा लाभ है । इसके अलावा, कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन एक्सप्रेस वास्तविक समय इमेजिंग सक्षम बनाता है और उपयोगी है जब immunostaining के लिए प्रभावी एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन उपलब्ध नहीं हैं ।
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में हाल ही में तकनीकी प्रगति प्रकाश की विवर्तन सीमा को दूर किया है और नेनो सेलुलर संरचनाओं के दृश्य24की अनुमति दी । एक ऐसी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक प्रेरित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी कहा जाता है । STED दो पराबैंगनीकिरण, जहां एक लेजर fluorophore और एक डोनट के आकार का पैटर्न के साथ एक दूसरे लेजर उत्तेजित का काम चुनिंदा fluorophore के आसपास प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को रोकता है । यह एक एकल फ्लोरोसेंट कण के बिंदु प्रसार समारोह (स्पष्ट क्षेत्र) कम कर देता है और एक उप विवर्तन सीमा फ्लोरोसेंट छवि25,26प्रदान करता है । जमीन-राज्य कमी माइक्रोस्कोपी भी सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक को रोजगार । हालांकि, छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण बार लंबे होते हैं, वहां केवल fluorophores कि इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सीमित संख्या में हैं, और एकाधिक cytoskeletal घटकों के एक साथ उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि बनाए रखने actin और microtubule संरचनाओं अलग निर्धारण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इसलिए, STED इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अन्य सुपर संकल्प सूक्ष्म दृष्टिकोण है कि यह तेजी से छवि अधिग्रहण प्रदान करता है पर कई फायदे हैं, न्यूनतम पोस्ट प्रसंस्करण आवश्यकताओं है, और एक ही fluorophores और धुंधला तकनीक को रोजगार कि निर्धारित नमूनों की पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए26का उपयोग किया जाता है ।
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी अब प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में प्रतिरक्षा synapse पर actin संरचनाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है26,27,28,29,30, 31. हालांकि, microtubule cytoskeleton के सुपर संकल्प इमेजिंग, साथ ही प्रतिरक्षा cytoskeletons गठन के दौरान actin और microtubule synapse के समंवित पुनर्गठन, हाल ही में17सूचना दी गई है । हम छवि बी कोशिकाओं है कि विरोधी immunoglobulin (विरोधी ़) एंटीबॉडी, जो BCR संकेतन उत्तेजित और आरंभ cytoskeleton पुनर्गठन के साथ लेपित coverslips पर प्रसार करने की अनुमति दी गई थी STED माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया । जब मैटीरियल विरोधी ़ एंटीबॉडी पर चढ़ाया, बी कोशिकाओं को नाटकीय actin-निर्भर प्रसार है, जो प्रतिरक्षा synapse गठन के दौरान प्रारंभिक घटनाओं recapitulates गुजरना । महत्वपूर्ण बात, STED माइक्रोस्कोपी एफ के वृक्ष अंगूठी के ठीक विवरण-actin है कि प्रतिरक्षा synapse की परिधि में रूपों से पता चला और पता चला है कि MTOC, साथ ही साथ इससे जुड़ी microtubules, प्रतिजन संपर्क साइट17के करीब स्थानांतरित कर दिया था । इन microtubules ने F-actin के परिधीय वलय की ओर जावक को विस्तारित कर दिया । इसके अलावा, बहु रंग STED एफ के विभिंन संयोजनों के इमेजिंग-actin, tubulin, IQGAP1, और GFP-क्लिप टैग-170 + युक्तियां दिखाया है कि microtubule प्लस-समाप्त क्लिप द्वारा चिह्नित-170-GFP निकट परिधीय actin meshwork के साथ जुड़े थे और IQGAP1 के साथ, एक cortical कैप्चर प्रोटीन17।
यहां, हम इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान actin और microtubule cytoskeletons प्रतिरक्षा synapse में STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इन तरीकों A20 murine बी सेल लाइन है, जो व्यापक रूप से अध्ययन BCR संकेतन और प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए नियोजित किया गया है का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. क्योंकि वाणिज्यिक एंटीबॉडी क्लिप के लिए-170 अच्छी तरह से पिछले प्रयोगों में immunostaining के लिए काम नहीं किया, हम विस्तार में वर्णन GFP की अभिव्यक्ति-A20 कोशिकाओं में क्लिप-170 टैग की गईं, साथ ही साथ करने के लिए visualizing प्रोटोकॉल के लिए तीन cytoskeletal अवयव या cytoskeleton-संबंधित प्रोटीन. NK सेल प्रतिरक्षा synapses में छवि actin को STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए तरीके पहले40वर्णित किया गया है । यहां, हम दोनों actin और बी कोशिकाओं में microtubule cytoskeletons के बहु रंग सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए यह विस्तार ।
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए एक महत्वपूर्ण विचार सेलुलर संरचनाओं को बनाए रखने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन को नुकसान को रोकने के लिए उचित निर्धारण प्रक्रियाओं का उपयोग कर रहा है । निर्धारण और दाग के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों को GFP प्रतिदीप्ति बनाए रखने और actin और microtubule नेटवर्क के उच्च संकल्प इमेजिंग प्रदान अनुकूलित किया गया है । जब फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बी कोशिकाओं को आम तौर पर transfect मुश्किल हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, A20 कोशिकाओं के 20-50% आम तौर पर transfected GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और इस आबादी के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर चर रहे हैं । फिर भी, actin और microtubules के सुपर संकल्प इमेजिंग प्रक्रियाओं हम वर्णन का उपयोग कर काफी मजबूत है और उच्च गुणवत्ता छवियों को आसानी से प्राप्त कर रहे हैं । A20 कोशिकाओं के सापेक्ष उनके छोटे आकार के बावजूद, हम बताते है कि इन प्रक्रियाओं को भी microtubule नेटवर्क प्राथमिक बी कोशिकाओं है कि संक्षेप में lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ सक्रिय किया गया है में छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें पता चला है कि एलपीएस-सक्रिय प्राथमिक बी कोशिकाओं को अपेक्षाकृत उच्च दक्षता पर siRNAs के साथ transfected जा सकता है (यानी, इस तरह कि प्रोटीन घट immunoblotting द्वारा पता लगाया जा सकता है), उन्हें कुछ अध्ययनों के लिए बी सेल लाइनों के उपयोग के लिए एक अच्छा विकल्प बना 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
cytoskeletal संरचनाओं की विस्तृत छवियों STED सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जो सैद्धांतिक रूप से 50 एनएम के एक संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में, ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम समर्थन और STED माइक्रोस्कोप को बनाए रखने के लिए UBC जीवन विज्ञान संस्थान (LSI) इमेजिंग सुविधा का शुक्र है । यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों से अनुदान #68865 द्वारा वित्त पोषित किया गया (M.R.G.) । हम Dr. Kozo Kaibuchi (नागोया विश्वविद्यालय, नागोया, जापान) क्लिप के लिए धंयवाद-170-GFP प्लाज्मिड ।
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
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