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Genetics

Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

Published: May 3, 2018 doi: 10.3791/57056
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

Summary

Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.

Abstract

Lorsque les niveaux de l’état stationnaire RNA sont comparées entre deux conditions, il n’est pas possible de distinguer si les changements sont causés par des modifications de la production ou la dégradation de l’ARN. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure de la production d’ARN, à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage d’ARN suivie d’immunoprécipitation, qui permet l’investigation de l’ARN synthétisé dans un court délai (par exemple, 1 h). L’avantage de 5-Bromouridine-étiquetage et immunoprécipitation sur l’utilisation d’inhibiteurs de transcriptional toxiques, tels que le α-amanitine et l’actinomycine D, est qu’il n’y aucune ou très peu d’effets sur la viabilité cellulaire lors d’une utilisation à court terme. Cependant, parce que le 5-Bromouridine-immunoprécipitation capte seulement RNA produites dans le court délai d’étiquetage, produit lentement comme rapidement dégradés RNA peut être difficile à mesurer par cette méthode. L’ARN 5-Bromouridine-marqué capturé par 5-Bromouridine-immunoprécipitation peut être analysé par transcription inverse, quantitative PCR et séquençage de la génération suivant. Tous les types d’ARN peuvent être l’objet d’une enquête, et la méthode n’est pas limitée à la mesure des ARNm est présenté dans cet exemple.

Introduction

5-Bromouridine (BrU) immunoprécipitation (IP) permet l’étude de la production d’ARN dans les cellules avec no ou des effets très limités sur cellulaire physiologie au cours de la brève période1,2d’étiquetage. La méthode repose sur l’incorporation du dérivé synthétique de l’uridine BrU en ARN nouvellement synthétisé suivi par IP d’ARN marqué à l’aide d’anticorps anti-BrU (Figure 1).

On sait depuis des décennies que la synthèse de protéine peut être réglée de transcription, et l’existence de facteurs de transcription a émis l’hypothèse il y a plus de 50 ans3. Aujourd'hui, on sait que plusieurs maladies sont causées par le dérèglement de la transcription et de la stabilité de la RNA (complémentaire Figure S1 en référence4), et la capacité à mesurer les changements dans la production d’ARN est d’une grande importance dans la maladie de compréhension développement.

En revanche, outils pour réguler la production d’ARN fournissent de nouvelles possibilités pour le traitement de maladies causées par l’expression de protéines trop ou trop peu, ou l’accumulation de protéine comme dans la maladie de Parkinson (MP). La protéine prédominante, accumulant des agrégats comme insolubles dans PD est α-synucléine, et le niveau de la synucléine α est directement lié à la maladie, comme des causes de multiplication de gène du gène α-synucléine familial PD5. Par ailleurs, α-synucléine regroupe de manière dépendante de la concentration. Diminution de l’expression des ARNm de la synucléine α est donc une stratégie thérapeutique intéressante, qui a été réalisée avec succès à l’aide de l’interférence ARN pour diminuer la perte des neurones dans PD modèles rongeurs6,7.

Il est important de pouvoir mesurer les changements dans la production d’ARN causée par une maladie ou des interventions thérapeutiques. Méthodes de pointe pour mesurant les niveaux d’ARN, l’état stationnaire comme transcription inverse suivie par quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ne sont pas capables de distinguer les changements causés par la régulation de la transcription ou altérés Stabilité de RNA. Une méthode largement utilisée pour l’étude des taux de décomposition de RNA n’entrave de la machinerie transcriptionnelle utilisant des composés tels que le α-amanitine ou l’actinomycine D, suivie par des mesures de l’ARN en décomposition. Cependant, il y a certains problèmes liés à un blocage général de transcription dans des cellules, telles que l’induction de l’apoptose8,9. À côté des effets cytotoxiques, inhibiteurs de la transcriptionnelles présentent également de nombreux problèmes techniques, comme la lente absorption cellulaire de le α-amanitine et le manque de spécificité de l’actinomycine D (revu en référence10).

Pour éviter le blocage total de la transcription, analogues nucléotidiques ont été utilisées, comme 5-éthynyl uridine (UE 5), 4-thiouridine (TU-4) et BrU. Ceux-ci sont facilement absorbés par les cellules de mammifères et incorporés dans l’ARN nouvellement synthétisé, permettant pouls-étiquetage de l’ARN dans un délai spécifique. BrU est moins toxique que l’UE 5 et 4-TU, ce qui en fait le préféré analogique de choix11,12.

BrU-IP peut servir à enquêter sur les deux le taux de synthèse d’ARN et de la stabilité et donc distinguer les causes des changements dans l’ARN total. Cet article se concentrera sur la mesure de la synthèse d’ARN et se réfère pour faire référence à2 pour plus de détails sur l’étude de stabilité de RNA. Pour étudier la synthèse de l’ARN, les cellules sont brièvement étiquetés avec BrU par exemple pendant 1 h puis BrU-IP1 (Figure 1). Ceci permet des mesures de l’ARN synthétisé dans le court délai d’étiquetage et les changements observés donnera une meilleure estimation des règlements dans la synthèse de l’ARN qu’en mesurant les changements dans l’ARN total par RT-qPCR. Il convient de mentionner, toutefois, que même si le temps d’étiquetage est, par exemple, seulement 1 h, dégradation peut avoir encore une influence sur les niveaux d’ARN observés.

L’ARN à partir des expériences de BrU-IP ne conviennent pas pour analyse en aval par les deux RT-qPCR1 ou prochaine génération séquençage2,13. Autres méthodes de détection RNA standards, tels que le transfert de Northern ou dosage de ribonucléase de protection, peuvent également s’appliquer pour certains ARN.

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Protocol

Remarque : Exécutez toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire et garder les tampons sur la glace ou dans le réfrigérateur (à l’exception de l’élution de la mémoire tampon contenant du SDS). Le protocole est divisé en 5 sections : échantillons de la préparation de l’ARN ; préparation des perles de la propriété intellectuelle ; liaison de l’ARN marqué BrU de perles ; élution et la purification d’ARN de BrU-étiqueté lié par extraction de 3 étapes de phénol-phénol/chloroforme-chloroforme ; analyse de l’ARN (dans cet exemple à l’aide de la RT-qPCR)

1. préparation des échantillons d’ARN

  1. Cellules HEK293T comte utilisant une cellule automatisée contrer et 3 500 000 cellules dans un plat de Pétri de 10 cm dans 10 mL de milieu de croissance (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco additionné de 10 % de sérum de veau foetal et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine) des graines afin d’obtenir un total de > 40 µg RNA après extraction 48 h plus tard. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. 48 h après l’ensemencement, aspirer 8 mL de milieu de croissance et laisser 2 mL pour éviter le dessèchement des cellules. Ajouter 2 mM BrU et tout traitement à 8 mL aspiré des milieux de culture et enlever les résidus de 2 mL des cellules avant de rebrancher le 8 mL de milieu de culture contenant BrU. Évitez d’utiliser des supports neufs, à la demande de la BrU aux cellules, puisque ceci peut induire des changements dans l’expression des gènes.
  3. Incuber les cellules pendant 1 h avec BrU et traitement. Laver les cellules dans un tampon de 5 mL Hank et trypsinize les cellules à l’aide de trypsine de 0.05 % de 2 mL. Ajoutez 8 mL de milieu de croissance pour arrêter la réaction, transférer les cellules dans un tube de 15 mL et tournez en bas les cellules pendant 2 min à 1 000 x g.
  4. Retirez le surnageant et extrait le culot cellulaire à l’aide d’un ARN de l’ARN total nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre méthode préférée et éluer exempte de RNase H2O. magasin de l’ARN à-80 ° C jusqu’au moment de procéder.

2. préparation des perles de la propriété intellectuelle

  1. Préparer les perles en lots pour le nombre d’échantillons à étudier plus un supplémentaire pour tenir compte des pertes pendant le pipetage et whirl mélange. Remettre en suspension les billes magnétiques de anti-souris IgG soigneusement par le mélange de tourbillon et retirer 20 perles µL par échantillon dans un tube de 1,5 mL de RNase-libre. Place le tube de 1,5 mL dans un support magnétique et laisser environ 20 s pour les perles pour recueillir sur le côté.
  2. Retirez le surnageant, sortir le tube du support magnétique et resuspendre dans 400 µL de tampon de BrU-IP 1 x par pipetage. Tourner le tube très brièvement pour 2 s dans une centrifugeuse de table-top, placez-le dans le socle magnétique et éliminer le surnageant. Répéter une fois l’étape de lavage.
  3. Liaison non-spécifique de bloc aux billes à l’aide de l’héparine. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampon de l’héparine et laisse tourner pour 30 min. Lavez les perles une fois, comme dans l’étape 2.2.
    Remarque : L’héparine est un polymère chargé négativement, qui sera en concurrence avec l’ARN pour la liaison. ARNt ou autres ARN non pertinent aussi peut être utilisé que si l’application en aval n’est pas séquençage.
  4. Remettre en suspension les perles dans 1 mL 1 x tampon de BrU-IP et ajoutez 1,25 µg/échantillon anti-α-bromodéoxyuridine anticorps, qui reconnaît également BrU. Incuber les perles pendant 1 h pendant la rotation, ou jusqu’au lendemain à la température ambiante.
  5. Laver les perles trois fois comme au point 2.2. Remettre en suspension les perles dans 50 µL/sample 1 x tampon de BrU-IP additionné de 1 mM BrU et laisser tourner pendant 30 min diminuer la sensibilité de l’anticorps lié aux talons et par la présente le risque de liaison non-spécifique au cours de la propriété intellectuelle.
  6. Laver les perles trois fois comme à l’étape 2.2 et remettre en suspension dans un tampon 50 µL/échantillon 1xBrU-IP.

3. liaison d’ARN marqué BrU à perles

  1. Mesurer les concentrations de RNA dans les extraits de RNA de l’étape 1.3 par spectrophotométrie UV-visible et diluer 40 µg RNA chaque échantillon libre de RNase H2O pour un volume total de 200 µL.
  2. Chauffer les échantillons d’ARN pendant 2 min à 80 ° C pour dénaturer l’ARN et essorage brièvement dans une centrifugeuse de table. Ajouter 200 µL 2 x inhibiteur de RNAse-IP + BSA/BrU.
  3. Ajouter 50 µL resuspendues et préparé des billes de l’étape 2.6 pour chaque échantillon et laisser tourner 1 h. lavage les perles quatre fois comme à l’étape 2.2.

4. élution et la Purification de l’ARN par Extraction au phénol-phénol/chloroforme-chloroforme 3 étapes

  1. Éluer l’ARN et d’effectuer l’extraction de phénol
    1. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon d’élution pour éluer l’ARN et rapidement par la suite ajouter 200 phénol µL, pH 6,6 (attention : toxique, voir note ci-dessous étape 4.1.2) pour éliminer toute non-RNA des molécules de l’échantillon.
    2. Tourbillon de mélanger l’échantillon et un essorage 3 min à 25 000 x g dans une centrifugeuse de table.
      NOTE : Phénol est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Le pH légèrement acide veille à ce que seulement les ARN et pas d’ADN, est extraite. L’ARN restera dans la phase aqueuse supérieure en raison de la nature hydrophile de charges. Les noyaux hydrophobes des protéines lient le phénol et passer à la phénol-phase organique inférieure.
  2. Effectuer l’extraction de phénol-chloroforme
    1. Aspirer autant phase supérieure possible (environ 190 µL de la 200 µL, selon l’expérience dans la manutention) et le mettre dans un tube avec 200 µL phénol/chloroforme, pH 6,6 (attention : toxique, voir la note). Veillez à aspirer la même quantité dans les trois échantillons.
    2. Tourbillon mélanger l’échantillon et un essorage pendant 3 min à 25 000 x g.
      NOTE : Chloroforme est toxique et doit être manipulé sous une hotte portant protection de la peau. Chloroforme est ajouté au phénol, qui peut affecter l’analyse en aval de l’ARN par inhibition de la transcription inverse14 et amplification des réactions en chaîne15.
  3. Effectuer l’extraction de chloroforme en aspirant la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 180 µL) et transférer dans un tube contenant le 200 µL chloroforme. Tourbillon mélanger l’échantillon et tourner 3 min à 25 000 x g.
  4. Aspirer la phase aqueuse supérieure comme avant (maintenant environ 170 µL) et transférez-le dans un tube contenant 17 µL (volume 1/10) 3M CH3COONa, pH 6,0. Pour neutraliser et précipiter RNA de la solution aqueuse, ajouter 2 glycogène µL (20 mg/mL), qui précipite ainsi que RNA et rend le culot de RNA plus visible.
  5. Ajouter 500 µL 96 % d’éthanol pour augmenter la liaison entre les ions salins et les ARN et les mélanger en renversant le tube une couple de fois. Maintenir le tube nuit à-20 ° C ou 15 minutes sur la glace sèche.
  6. Faites tourner l’échantillon à 25 000 x g, 4 ° C pendant 30 min. jetez surnageant sans déranger le culot et laver le culot dans 185 µL 75 % d’éthanol d’enlever n’importe quel sel résiduel. Tourner à 25 000 x g, 4 ° C pendant 5 min.
  7. Jeter le surnageant complètement sans déranger le culot et laisser le culot pour sécher 5-10 min avec un couvercle ouvert. Resuspendre dans 10 µL exempte de RNase H2O appliqué sur le côté du tube pour éviter de déranger le culot.

5. analyse de l’ARN

  1. Préparer le cDNA utilisant une ADNc de la transcription inverse nécessaire (voir la Table des matières) ou tout autre préféré méthode utilisant 2 µL d’échantillon RNA et 1 µg levure ARN total comme transporteur RNA pour la réaction de synthèse de cDNA (non utilisée si l’ADNc est utilisé pour l’ordonnancement de la génération suivante). Utilisez 1 µg RNA sans levure RNA pour préparation de cDNA de l’entrée correspondante.
  2. ADNc diluée 01:25 et mélange 9 µL dilué d’ADNc avec 10 µL qPCR Master 1 µL fluorogène sonde et mélange les deux spécifiés dans la Table des matières.
    Remarque : La dilution de l’ARNC dépend de la préparation de l’ARNC et qPCR méthode utilisée.
  3. Exécutez le programme suivant de qPCR (par exemple, sur un système rapide de Real-time PCR 7500 ou l’équivalent) : 2 min à 50 ° C, 20 s à 95 ° C, 40 cycles de 3 s à 95 ° C et 30 s à 60 ° C.

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Representative Results

Nos premiers tests de temps de BrU-étiquetage ont été effectuées dans les cellules CPIRA-1. Les cellules ont été traitées avec BrU 0, 1, 2 et 4,5 h, suivie par l’extraction de l’ARN totale et BrU-IP. GAS5 et GAPDH ont été mesurés dans l’ARN BrU-IP, ce qui démontre que l’étiquetage 1 h est suffisant pour atteindre un changement environ 9 et 44 fois comparé à fond (0 h) pour GAPDH et GAS5, respectivement.

BrU-propriété intellectuelle et l’analyse décrite ci-dessus ont été utilisés afin de déterminer si les changements découverts dans les niveaux de l’état stationnaire de l’ARNm de la synucléine α sur Polo-like kinase 2 (PLK-2) inhibition ont été causés par des changements dans l’ARNm synthèse1. Un temps de 1 h étiquetage a été choisi parce que cela fournit un étiquetage suffisant par rapport au contexte (Figure 2) et permet également le temps de traitement ait un effet. traitement de BrU 2 mM n’a pas induit des modifications morphologiques des cellules HEK293T pour 1 h ou le traitement plus long de 4 h (Figure 3 a).

Α-synucléine transfectées HEK293T cellules ont été traitées pendant 1 h avec le DMSO ou un inhibiteur spécifique de la PLK-2 (PLK-2i) en présence de BrU d’étiqueter les ARN synthétisé fraîchement. Les cellules ont été récoltées ci-après et l’ARN total a été extrait. ARN marqué BrU produite dans le traitement de 1 h ont été recueillie à l’aide de BrU-IP (« BrU-IP » dans la Figure 3 b) de la masse totale de l’ARN (« Input » de la Figure 3 b). Obtention de la quantité d’ARN avec BrU-IP de 40 µg matériel de départ varie selon les différentes lignées cellulaires, et on obtient en général environ 500 ng de cellules HEK293T, mais seulement de 10 à 50 ng de cellules HeLa. PLK-2 inhibition provoque une augmentation synucléine α mRNA dans l’entrée et la BrU-IP (Figure 3 b) ce qui suggère que l’augmentation dans l’état d’équilibre que RNA est causée par une augmentation de la synthèse de l’ARN. Faire en sorte que PLK-2i ne provoque pas seulement un taux d’augmentation dans la production d’ARN, 3 autres gènes endogènes (ACTB, HMBS et NADH) ont été mesurées (Figure 4). Aucun de ces gènes a été augmentée dans l’entrée (Figure 4 a) et BrU-IP (Figure 4 b) après traitement PLK-2i.

Pour valider la spécificité de la BrU-IP, un contrôle avec des cellules non-BrU traité a été inclus. Les niveaux de 18sRNA capturé par BrU-IP à partir de cellules de BrU-traitées et non traitées ont été comparés (Figure 5). Cela démontre clairement que la BrU-IP est très spécifique et capte seulement une très petite fraction de l’ARN non marquée (Figure 5).

Parce que l’ARN marqué BrU est uniquement produite à 1 h, il est important de choisir un gène de référence appropriée, étant donné que certains gènes normalement adéquat peuvent être exprimées en des concentrations trop faibles pour être fiable. 18sRNA a été choisi comme un gène de référence pour les données présentées dans la Figure 3 b et 4 de la Figure à cause de son abondance. Plusieurs gènes de référence étaient, cependant, testés, et certains ont montré des cycles de seuil élevé (> 30) (Figure 6). Ces données montrent également que la différence entre ARN IP'ed BrU-marqué et l’ARN total dans l’entrée est d’environ 5 du Ct et certains ARN exprimée en faibles quantités dans la cellule peut donc pas être correctement détecté suite BrU-IP.

Figure 1
Figure 1 : Description de BrU-IP pour enquête de synthèse d’ARN. (A) RNA est transcrit dans les cellules de l’ADN par des ARN polymérases. (B) lors de l’addition à la presse, BrU est absorbé par les cellules et incorporé dans l’ARN nouvellement transcrite. (C) pour mesurer les taux de synthèse de RNA : RNA (1) nouvellement synthétisée est étiqueté pendant 1 h avec BrU, (2) l’ARN est extrait des cellules immédiatement après marquage, ARN (3) BrU-marqué immunoprecipitated utilisant des anticorps anti-BrU, (4) BrU marqués (et correspondant d’entrée) RNA est analysée par la RT-qPCR ou séquençage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : évaluation de l’étiquetage temps. Exemple d’une première évaluation des temps de BrU-étiquetage. CNPA-1 cellules cultivées dans un milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 50 U/mL / 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine ont été traités avec BrU à une concentration finale de 2 mM à 0, 1, 2 et 4,5 h avant l’extraction de l’ARN et l’analyse de RT-qPCR. Données est quantifiées en 2-Ctet est présentées comme la moyenne des techniques réanalysés ± écart-type, n = 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : résultats représentatifs entrée et l’ARN de BrU-IP de DMSO et PLK-2i traitement cellules. Traitement de BrU 1 h et 4 h 2 mM (A) n’a pas induit de toute modifications morphologiques visibles dans les cellules HEK293T. Echelle = 100 µm. (B) adapté figure de référence1. 3 500 000 cellules HEK293T ont été ensemencées par plat de 10 cm et transfectées avec un plasmide exprimant la synucléine α 24h après l’ensemencement. 24h après la transfection cellules ont été incubées pendant 1 h avec BrU en présence de DMSO ou PLK-2i, suivie par l’extraction de l’ARN et BrU-IP. Analyse de l’ARN a été réalisée par RT-qPCR en utilisant des ensembles de sonde encontre humaine SNCA (α-synucléine) et 18sRNA. BrU-IP et entrée SNCA a été quantifiée par rapport à BrU-IP et Input 18sRNA, respectivement, à l’aide de la méthode deΔΔC -T 2. Résultats ont été normalisées pour les échantillons traités DMSO. Les données sont présentées comme moyenne ± écart. Comparaisons statistiques ont été réalisées à l’aide de non-apparié test t de Student, * p < 0,001, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : mesure des autres gènes ne pas changé par PLK-2i. PLK-2i change ni l’ARN total ni synthétisée de ACTB, HMBS et NADH. ACTB (A), HMBS et NADH ARN de l’entrée ont été mesurés en trois exemplaires, une expérience et quantifié par rapport à 18sRNA en entrée à l’aide de la méthode deΔΔC -T 2. Les valeurs ont été normalisées pour les échantillons de DMSO traité et barres représentent la moyenne des déviations réanalysés ± standard, n = 1. (B) ACTB, HMBS et NADH ont été également mesurée dans l’ARN de BrU-IP'ed et quantifié par rapport à 18sRNA dans le BrU-IP. Valeurs ont été normalisés à DMSO et présentés comme dans A, n = 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : spécificité de la BrU-pi. Pour comparaison des 18sRNA capturé par BrU-IP de BrU et non-BrU-cellules traitées, ARN de BrU-IP a été validé par rapport aux ARN d’entrée pour tenir compte des différences en matière première et ci-après normalisée à échantillons traités BrU. Qu’une fraction infime (0,002) de non-étiquetés BrU 18sRNA a été immunoprécipitée, ce qui démontre que la BrU-IP est hautement spécifique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : niveaux d’ARNm différents dans l’ARN de BrU-IP par rapport à l’entrée ARN. Plusieurs gènes de référence potentiels ont été testés car certains ARN seront présents en très faibles concentrations dans l’ARN de BrU-IP due à petites quantités de produits ARN dans 1 h BrU traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de BrU-IP pour la détermination de la production d’ARN par étiquetage des nouvellement produites RNA pendant 1 h avec BrU, suivie d’extraction de l’ARN immédiate et immunoprécipitation d’ARN marqué BrU. Cette méthode a déjà été décrit dans référence16, et cet article comprend quelques étapes supplémentaires pour augmenter la spécificité de la propriété intellectuelle et de la pureté de RNA, par prétraitement des billes avec de faibles concentrations de BrU, mais aussi une étape de purification du phénol-chloroforme à augmenter la pureté de RNA suite IP. En outre, nous présentons également des données démontrant la spécificité de la BrU-IP en comparant l’ARN capturée à partir de BrU et non-BrU traités des cellules. Purification de phénol-chloroforme est bon marchée, mais vu les faibles quantités d’ARN marqué avec BrU, signaux accrues dans l’analyse en aval pourraient être obtenus en utilisant des kits de nettoyage RNA plutôt. Notre expérience est, cependant, que l’extraction plus égale de l’ARN dans les trois échantillons est obtenue à l’aide de purification phénol-chloroforme.

BrU-étiquetage et la propriété intellectuelle - sont, contrairement à l’analyse des niveaux d’ARN totales, capables d’enquêter sur les causes des changements dans les niveaux de l’état stationnaire RNA. La méthode n’a aucun ou limitée effets sur la physiologie cellulaire, par opposition à l’utilisation des inhibiteurs de la transcriptionnelles tels que α-amanitine et l’actinomycine d. Il a été suggéré que comparaison des ARN nouvellement synthétisé au niveau de l’état d’équilibre peut être utilisée pour calculer les RNA decay taux17, et la méthode de BrU-IP décrite ici permet la détermination simultanée de synthèse d’ARN et de désintégration dans un essai.

Dans la Figure 5, nous avons démontré que l’ARN est que seulement IP'ed de BrU traités cellules, montrant qu’il n’y a en effet BrU incorporé dans l’ARN dans la lignée cellulaire utilisée ici. Cependant, nous suggérons d’effectuer un test initial d’incorporation de BrU en ARN dans les autres lignées cellulaires avant d’effectuer la BrU-IP. Cela pourrait, par exemple, se faire en utilisant des anticorps anti-BrU pour quantifier la BrU dans les extraits de RNA totales via la tache dot ou immuno enzymatique.

Ici, nous n’avons pas présenté un test d’efficacité de BrU-IP dans les trois échantillons, mais cela peut être étudiée à l’aide de pointes BrU-étiquetés dans RNA soit produite in vitro ou d’un autre organisme, tels que les Drosophila melanogaster. Cet ARN puis pourrait également être utilisé dans les analyses quantitatives en aval et les normalisations.

Techniques de pipetage correctes sont cruciales lors de l’exécution des épreuves quantitatives très sensibles, tels que BrU-IP et RT-qPCR, et un effort particulier devrait être fait pour effectuer le pipetage égales dans les trois échantillons. Les extractions de phénol-chloroforme exigent une expérience, mais à la pipetage insatisfaisante, les phases aqueuses et le phénol/chloroforme peuvent être re-mixés et centrifugés à nouveau.

Ce protocole suggère BrU-étiquetage pendant 1 h pour mesurer la synthèse de l’ARN. Cette fois-ci étiquetage permet une estimation approximative des modifications dans la transcription, puisque la majorité des humains et de souris ARNm ont été estimées à demi-vie > 6 h18,19. Attention, cependant, être exercé lors de l’interprétation des données obtenues, puisque de nombreux ARN ont des demi-vies <18,1 h19, comme plusieurs transcriptions induite par le lipide A, qui rapidement augmenter lors de la stimulation et diminuer à niveaux de ligne de base dans les 2 h après induction20. Pour réduire le risque d’influences de la dégradation de l’ARN, le temps de BrU-étiquetage peut être diminuée, cependant, il est également important d’étiqueter assez RNA pour pouvoir distinguer les RNA obtenu par BrU-IP de l’arrière-plan (qui a été obtenu après 1 h, étiquetage dans nos mains ( " Figure 2)). Une autre option consiste à mesurer les synthèse d’ARN et la décomposition du gène d’intérêt à l’aide de BrU-étiquetage et la propriété intellectuelle, cette dernière méthode est décrite dans2. Les données de ces deux approches complètent, et si un changement dans la synthèse entre deux conditions est mesuré mais aucune variation est observée dans le taux de décomposition, on peut conclure que les changements mesurés dans l’ARN résultaient de la régulation de la synthèse. Toutefois, il est important de se rappeler que les deux techniques ne mesurent que la fonctionnalité de RNA en estimant le taux d’ARN et complètement négligent étudier les autres mécanismes qui influencent les fonctions RNA tels que les modifications chimiques14.

Étant donné que les cellules sont incubées avec BrU pour seulement 1 h, ARNm produit très lentement peut être difficiles à mesurer à l’aide de la méthode de BrU-IP. Il s’agit d’un moment où l’utilisation d’inhibiteurs transcriptionnels tels que le α-amanitine et l’actinomycine D peut-être préférée sur BrU-IP, cependant, ils peuvent seulement servir à mesurer les changements dans la dégradation et mesurent pas directement la production d’ARN. Les faibles niveaux d’ARN marqué BrU peuvent également être surmontés en augmentant le temps d’incubation avec BrU, cependant, temps d’incubation longue augmentent le risque d’influences par la dégradation de l’ARN. Dans ce cas, il n’est plus possible de savoir si les changements en ARN marqué BrU sont causés par des changements dans la production d’ARN ou de désintégration.

Dans cet exemple, l’analyse en aval de l’ARN marqué BrU capturé est effectuée à l’aide de la RT-qPCR, cependant, prochaine génération séquençage est également une méthode largement utilisée en aval à l’écran des modifications dans un vaste bassin de RNAs2,13. De même, la méthode ne se limite pas à l’analyse de l’ARNm, mais peut analyser tous les types d’ARN2.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La Fondation de Lundbeck, Université d’Aarhus, Dandrite et Lundbeck a/s pris en charge ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribolock Rnase inhibitor ThermoFisher EO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Life Technologies 11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody BD Bioscience 555627
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Ultraviolet-visible spectrophotometry
Water-Saturated Phenol pH 6.6 ThermoFisher AM9712
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 ThermoFisher AM9732
High Pure RNA isolation Kit Roche 11828665001
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher 4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444557 qPCR Master Mix
Taqman RNA probes ThermoFisher SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system Applied Biosystems
HEK293T cell line ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Lonza BE12-604F
Fetal calf serum Biochrom S0115
Penicillin/Streptomycin Biochrom A2213
Hank's buffer 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.
DEPC-H2O 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O
2xBrU-IP Buffer 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin
1xBrU-IP 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock
Elution buffer 0.1% SDS in RNAse-free H2O

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References

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Génétique numéro 135 synthèse de l’ARN 5-Bromouridine étiquetage immunoprécipitation extraction au phénol-chloroforme reverse transcription PCR quantitative
Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation
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Kofoed, R. H., Betzer, C., Lykke-Andersen, S., Molska, E., Jensen, P. H. Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (135), e57056, doi:10.3791/57056 (2018).

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