Summary
Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.
Abstract
Quando livelli allo stato stazionario del RNA sono confrontati fra due condizioni, non è possibile distinguere se i cambiamenti sono causati da alterazioni nella produzione o degradazione del RNA. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione della produzione di RNA, usando 5-Bromouridine etichettatura di RNA seguito da immunoprecipitazione, che consente l'indagine di RNA sintetizzato entro un breve lasso di tempo (ad es., 1h). Il vantaggio di 5-Bromouridine-etichettatura e immunoprecipitazione sull'uso di inibitori trascrizionali tossici, come α-amanitina e actinomicina D, è che ci sono no o molto bassi effetti sulla vitalità cellulare durante l'uso a breve termine. Tuttavia, poiché 5-Bromouridine-immunoprecipitazione acquisisce solo RNA prodotta entro il breve tempo di etichettatura, lentamente prodotta così come rapidamente degradato RNA può essere difficile da misurare da questo metodo. Il RNA 5-Bromouridine-labelled catturato da 5-Bromouridine-immunoprecipitazione può essere analizzato da trascrizione d'inversione, reazione a catena della polimerasi quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. Tutti i tipi di RNA possono essere indagati, e il metodo non è limitato alla misura mRNA come è presentato in questo esempio.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitazione (IP) permette lo studio della produzione di RNA nelle cellule con no o molto limitati effetti su cellule fisiologia durante il breve periodo1,2di etichettatura. Il metodo si basa di incorporazione del derivato sintetico uridina BrU in RNA recentemente sintetizzato seguita da IP di RNA etichettato usando gli anticorpi anti-BrU (Figura 1).
È stato conosciuto per decenni quella sintesi della proteina possono essere regolata trascrizionalmente e l'esistenza di fattori di trascrizione è stata supposta più di 50 anni fa3. Oggi, è noto che molte malattie sono causate da disregolazione della trascrizione e della stabilità del RNA (complementare figura S1 in riferimento4), e la capacità di misurare le variazioni nella produzione di RNA è di grande importanza nella malattia di comprensione sviluppo.
D'altra parte, strumenti per regolare la produzione di RNA offrono nuove possibilità per il trattamento di malattie causate da troppo o troppo poco l'espressione della proteina, o accumulo di proteine come nella malattia di Parkinson (PD). La proteina predominante accumulando aggregati come insolubili nel PD è α-synuclein, e il livello di α-synuclein è direttamente legato alla malattia, come la moltiplicazione del gene del gene α-synuclein causa familiare PD5. Inoltre, α-synuclein aggrega in un modo dipendente dalla concentrazione. Downregulation dei livelli di mRNA di α-synuclein è quindi un'interessante strategia terapeutica, che è stato raggiunto con successo usando l'interferenza del RNA per ridurre la perdita di un neurone delle cellule nel PD modelli del roditore6,7.
È importante essere in grado di misurare i cambiamenti nella produzione di RNA causata da malattia o interventi terapeutici. Metodi all'avanguardia per misurazione livelli allo stato stazionario di RNA, come trascrizione d'inversione seguita da reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR), non sono in grado di distinguere tra i cambiamenti causati da regolazione trascrizionale o da alterato Stabilità del RNA. Un metodo ampiamente usato per le indagini dei tassi di decadimento di RNA è il blocco dell'apparato trascrizionale utilizzando composti come α-amanitina o actinomicina D seguita da misure del RNAs decadente. Tuttavia, ci sono alcuni problemi connessi con un blocco generale di trascrizione nelle cellule, come induzione di apoptosi8,9. Al lato degli effetti citotossici, trascrizionali inibitori presentano anche diversi problemi tecnici, come lento assorbimento cellulare di α-amanitina e mancanza di specificità di actinomicina D (rivisto in riferimento10).
Per evitare il blocco generale della trascrizione, nucleotidici sono stati utilizzati, quali 5-Etinil uridina (5-UE), 4-thiouridine (4-TU) e BrU. Questi sono prontamente presi dalle cellule di mammifera e integrare nel RNA recentemente sintetizzato, Abilitazione impulso-etichettatura di RNA entro un lasso di tempo specifico. BrU è meno tossico che 5-UE e 4-TU, che lo rende il preferito analogo scelta11,12.
BrU-IP può essere utilizzato per indagare sia il tasso di sintesi di RNA e di stabilità e così distinguere tra le cause alla base dei cambiamenti nel RNA totale. Questo articolo si concentrerà sulla misurazione della sintesi del RNA e si riferisce per fare riferimento a2 per i dettagli sull'indagine di stabilità del RNA. Per studiare la sintesi del RNA, cellule brevemente sono etichettate con BrU ad es. per 1 h seguita da BrU-IP1 (Figura 1). Questo permette di eseguire misure di RNA sintetizzati entro il breve tempo di etichettatura e cambiamenti osservati verranno darà una stima migliore dei regolamenti nella sintesi di RNA che misurando i cambiamenti in RNA totale da RT-qPCR. Va ricordato, tuttavia, che anche se la data di etichettatura è, ad esempio, solo 1 h, degradazione può ancora avere un'influenza sui livelli di RNA osservata.
RNA da esperimenti di BrU-IP sono adatte per analisi a valle sia RT-qPCR1 o di prossima generazione sequenziamento2,13. Altri metodi di rilevamento standard di RNA, come Macchiarsi nordico o analisi della protezione della ribonucleasi, possono anche essere applicabile per certo RNAs.
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Protocol
Nota: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente indicato e mantenere buffer su ghiaccio o in frigo (tranne dall'eluizione di tampone contenente SDS). Il protocollo è diviso in 5 sezioni: esempi di preparazione di RNA; preparazione di perline per IP; associazione del RNA BrU-etichettati per perline; eluizione e purificazione di RNA BrU-etichettati associato di estrazione del fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi; analisi di RNA (in questo esempio usando RT-qPCR)
1. preparazione dei campioni di RNA
- Conteggio HEK293T cellule utilizzando una cella automatizzata del contatore e seme 3.500.000 cellule in una capsula Petri 10 cm in media di crescita 10ml (Medium dell'Aquila per volta di Dulbecco supplementato con 10% siero fetale di vitello e 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina) per ottenere un totale di > 40 µ g di RNA dopo l'estrazione 48 ore più tardi. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO2.
- 48 h dopo la semina, aspirare media di sviluppo di 8 mL e 2 mL si lasci alle spalle per evitare l'essiccamento fuori le cellule. Aggiungete 2 mM BrU e qualsiasi trattamento a 8 mL aspirato mezzi di sviluppo e rimuovere il residuo mL 2 dalle cellule prima di riapplicare il 8ml BrU contenenti terreni di coltura. Evitare l'uso dei mezzi freschi su richiesta del BrU, le cellule, poiché questo può indurre cambiamenti nell'espressione genica.
- Incubare le cellule per 1 h con BrU e trattamento. Lavare le cellule nel buffer di 5ml Hank e tripsinizzano le cellule con tripsina 0.05% 2 mL. Aggiungere 8 mL crescita media per fermare la reazione, trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e rotazione verso il basso le cellule per 2 min a 1.000 x g.
- Rimuovere il supernatante ed estrarre RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un isolamento di RNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro metodo preferito ed eluire privo di RNasi H2O. Store il RNA a-80 ° C fino al momento di procedere.
2. preparazione di perline per IP
- Preparare perline in lotti per il numero di campioni di essere studiato più uno extra per rappresentare perdita durante il pipettaggio e vortice di miscelazione. Risospendere le microsfere magnetiche di IgG anti-topo accuratamente mescolando il vortice e prendere 20 perle µ l per campione in una provetta da 1,5 mL RNAsi-libera. Posto la provetta da 1,5 mL in un supporto magnetico e lasciare circa 20 s per le perline per raccogliere sul lato.
- Eliminare il surnatante, estrarre il tubo dal supporto magnetico e risospendere in 400 µ l 1 x BrU-IP tampone pipettando. Girare il tubo molto brevemente per 2 s in una centrifuga di tavolo, inserirlo nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
- Associazione aspecifici di blocco per le perle utilizzando eparina. Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL di tampone di eparina e lasciare rotante per 30 min. lavare le perle una volta, come descritto al punto 2.2.
Nota: L'eparina è un polimero caricato negativamente, che si sfideranno con RNA per l'associazione. tRNA o altro RNAs irrilevante può essere utilizzato anche se l'applicazione a valle non è sequenza. - Risospendere le sfere in 1 mL 1 x BrU-IP buffer e aggiungere 1,25 anticorpo di anti-α-bromodeossiuridina µ g/campione, che riconosce anche BrU. Incubare le perline per 1 h durante la rotazione, o durante la notte a temperatura ambiente.
- Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2. Risospendere le sfere in 50 µ l di campione 1 x BrU-IP buffer integrato con 1 mM BrU e lasciare a rotazione per 30 min abbassare la sensibilità dell'anticorpo associato ai talloni e con la presente il rischio di associazione non specifico durante IP.
- Lavare le perle tre volte come descritto al punto 2.2 e risospendere in 50 µ l di campione 1xBrU-IP buffer.
3. associazione del RNA BrU-etichettati per perline
- Misurare le concentrazioni di RNA in RNA estratti dal passaggio 1.3 tramite spettrofotometro ultravioletto-visibile e diluire 40 µ g RNA da ogni campione in privo di RNasi H2O a un volume totale di 200 µ l.
- Riscaldare i campioni di RNA per 2 min a 80 ° C per denaturare il RNA e spin brevemente in una centrifuga da tavolo. Aggiungere 200 µ l 2 x inibitore BrU-IP + BSA/RNasi.
- Aggiungere 50 µ l risospese e preparato perline dal passaggio 2.6 per ogni campione e lasciare rotante 1 h. lavare le perle quattro volte come descritto al punto 2.2.
4. eluizione e purificazione di RNA mediante estrazione con fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi
-
Eluire il RNA ed eseguire estrazione del fenolo
- Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di eluizione per eluire RNA e presto da allora in poi aggiungere fenolo di 200 µ l, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota sotto passo 4.1.2) per rimuovere eventuali molecole di RNA non dal campione.
- Mix di vortice del campione e spin 3 min a 25.000 x g in una centrifuga da tavolo.
Nota: Fenolo è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Il pH leggermente acido assicura che solo RNA e non il DNA, viene estratto. il RNA rimarrà nella fase acquosa superiore a causa della natura idrofila di cariche. I nuclei idrofobi delle proteine si legano fenolo e spostare fenolo-fase organica inferiore.
-
Eseguire l'estrazione del fenolo-cloroformio
- Aspirare tanto superiore-fase possibile (circa 190 µ l di 200 µ l, a seconda dell'esperienza nella gestione) e spostarlo in un tubo con 200 µ l fenolo/cloroformio, pH 6.6 (attenzione: tossici, vedi nota). Assicurarsi di aspirare lo stesso importo attraverso campioni.
- Vortice mescolare il campione e la rotazione per 3 min a 25.000 x g.
Nota: Cloroformio è tossico e deve essere gestita in una cappa aspirante indossa la protezione della pelle. Cloroformio è aggiunto per rimuovere il fenolo, che possa influenzare l'analisi a valle delle RNA inibendo la trascrizione d'inversione della polimerasi e14 reazioni a catena15.
- Eseguire l'estrazione di cloroformio aspirando la fase acquosa superiore come prima (ora circa 180 µ l) e trasferire in una provetta contenente cloroformio di 200 µ l. Vortice mescolare il campione e spin 3 min a 25.000 x g.
- Aspirare la fase acquosa superiore come prima (ora circa 170 µ l) e trasferirlo in una provetta contenente 17 µ l (1/10 di volume) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Per neutralizzare e precipitare RNA dalla soluzione acquosa, aggiungere 2 glicogeno µ l (20 mg/mL), che precipita insieme a RNA e rende più visibile la pallina del RNA.
- Aggiungere 500 µ l di etanolo 96% per aumentare il binding tra il sale ioni e RNA e mescolare capovolgendo la provetta un paio di volte. Lasciare il tubo durante la notte a-20 ° C o 15 min su ghiaccio secco.
- Spin il campione a 25.000 x g, 4 ° C per 30 min. Discard surnatante senza disturbare il pellet e lavare la pallina in etanolo di 75% µ l 185 per rimuovere qualsiasi residuo di sale. Spin a 25.000 x g, 4 ° C per 5 min.
- Eliminare il surnatante completamente senza disturbare il pellet e lasciare il pellet a secco 5-10 minuti con un coperchio aperto. Risospendere in 10 µ l, privo di RNasi H2O applicata sul lato del tubo per evitare di disturbare il pellet.
5. analisi del RNA
- Preparare cDNA usando una trascrizione inversa di cDNA kit (Vedi Tabella materiali) o qualsiasi altro preferito metodo utilizzando 2 µ l di campione di RNA e 1 µ g lievito RNA totale come elemento portante di RNA per la reazione di sintesi del cDNA (non utilizzata se cDNA è utilizzato per il sequenziamento di nuova generazione). Utilizzare 1 µ g di RNA senza lievito RNA per la preparazione di cDNA di ingresso corrispondente.
- CDNA diluito 01:25 e mix 9 µ l diluito cDNA con 10 µ l qPCR Master mix e 1 µ l fluorogenic sonda, entrambi specificati nella Tabella materiali.
Nota: La diluizione di cDNA dipende dalla preparazione di cDNA e qPCR metodo utilizzato. - Eseguire il seguente programma di qPCR (ad esempio, su un sistema Fast Real-Time PCR di 7500 o equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 cicli di 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.
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Representative Results
I nostri test iniziale di tempo BrU-etichettatura sono state eseguite in cellule AsPC-1. Le cellule sono state trattate con BrU per 0, 1, 2 e 4,5 h, seguita da estrazione di RNA totale e BrU-IP. GAS5 e GAPDH sono stati misurati in BrU-IP RNA, che ha dimostrato che l'etichettatura 1h era sufficiente per raggiungere un circa 9 e 44 volte cambiamento rispetto allo sfondo (0h) per GAPDH e GAS5, rispettivamente.
BrU-IP e l'analisi sopra descritti sono stati utilizzati per indagare se i cambiamenti rilevati in livelli allo stato stazionario di α-synuclein mRNA su Polo-like chinasi 2 (PLK-2) inibizione sono stati causati dai cambiamenti nel mRNA sintesi1. Un tempo di 1h etichettatura è stato scelto perché questo fornisce sufficiente etichettatura rispetto allo sfondo (Figura 2) e permette anche il tempo di trattamento avere un effetto. trattamento di BrU 2 mM non ha indotto alcun cambiamenti morfologici in cellule HEK293T per 1 h o il trattamento più lungo di 4 h (Figura 3A).
Α-Synuclein transfected HEK293T cellule sono state trattate per 1 h con DMSO o PLK-2 un inibitore specifico (PLK-2i) in presenza di BrU per etichettare RNA appena sintetizzato. In seguito sono state raccolte le cellule e il RNA totale è stato estratto. BrU-etichettati RNA prodotta entro il trattamento 1 h è stato raccolto utilizzando BrU-IP ("BrU-IP" in Figura 3B) dal pool totale di RNA ("Input" in Figura 3B). La quantità di RNA ottenuta con BrU-IP 40 µ g materiale di partenza varia tra diverse linee cellulari, e otteniamo generalmente circa 500 ng da HEK293T cellule, ma solo il 10-50 ng da cellule HeLa. PLK-2 inibizione ha causato un aumento in α-synuclein mRNA in ingresso e BrU-IP (Figura 3B) che suggeriscono che l'aumento in stato stazionario che RNA è causato da un aumento della sintesi di RNA. Per garantire che PLK-2i non causa solo un aumento globale della produzione di RNA, 3 ulteriori geni endogeni (ACTB, HMBS e NADH) sono stati misurati (Figura 4). Nessuno di questi geni è stata aumentata in ingresso (Figura 4A) e BrU-IP (Figura 4B) previo trattamento di PLK-2i.
Per convalidare la specificità del BrU-pi, un controllo con le cellule non-BrU trattati era incluso. I livelli di 18sRNA catturato da BrU-IP dalle cellule BrU-trattati e non trattate sono stati confrontati (Figura 5). Questo dimostra chiaramente che il BrU-IP è altamente specifico e acquisisce solo una frazione molto piccola del RNA non etichettati (Figura 5).
Perché il RNA BrU-etichettati è prodotto solo all'interno di 1h, è importante scegliere un gene di riferimento corretto, poiché alcuni geni normalmente adatti potrebbero essere espresso in concentrazioni troppo basse per essere affidabile. 18sRNA è stato scelto come un gene di riferimento per i dati presentati in Figura 4 e Figura 3B a causa della sua elevata abbondanza. Parecchi geni di riferimento erano, tuttavia, testati, e alcuni hanno mostrato cicli soglia alta (> 30) (Figura 6). Questi dati dimostrano inoltre che la differenza tra BrU-etichettati IP'ed RNA e RNA totale in ingresso è circa 5 di Ct e alcuni RNA espressa a basse quantità nella cella potrebbe pertanto non essere rilevato correttamente seguito BrU-IP.
Figura 1: Descrizione del BrU-IP per indagine della sintesi del RNA. (A) RNA è trascritto in cellule da DNA da RNA polimerasi. (B) all'aggiunta ai media, BrU è preso dalle cellule e integrare nel RNA recentemente trascritto. (C) per misurare i tassi di sintesi di RNA: RNA (1) recentemente sintetizzato è etichettato per 1 h con BrU, (2) RNA viene estratto dalle cellule immediatamente dopo l'etichettatura, (3) BrU-etichettati RNA è immunoprecipitati utilizzando anticorpi anti-BrU, (4) BrU-etichettati (e all'ingresso corrispondente) RNA è analizzato da RT-qPCR o sequenziamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: valutazione dell'etichettatura tempo. Esempio di una valutazione iniziale di tempo BrU-etichettatura. AsPC-1 cellule coltivate in un terreno di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) completati con 10% siero bovino fetale e 50 U/mL / 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina sono stati trattati con BrU ad una concentrazione finale di 2 mM per 0, 1, 2 e 4,5 h prima estrazione del RNA e l'analisi di RT-qPCR. Dati è quantificati come 2-Cted è presentati come la media dei triplici copie tecniche ± deviazione standard, n = 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cellule trattate risultati rappresentativi mostrando Input e BrU-IP RNA da DMSO e PLK-2i. Trattamento di BrU di 1 h e 4 h 2 mM (A) non ha indotto alcun visibili cambiamenti morfologici in cellule HEK293T. Barra della scala = 100 µm. (B) adattato la figura di riferimento1. 3.500.000 HEK293T cellule sono state seminate per ogni piatto di 10 cm e transfected con un plasmide esprimente α-synuclein 24 h dopo la semina. 24h post trasfezione cellule sono state incubate per 1 h con BrU in presenza di DMSO o PLK-2i, seguita da estrazione del RNA e BrU-IP. Analisi di RNA è stato fatto da RT-qPCR utilizzando insiemi di sonda dirette contro umano SNCA (α-synuclein) e 18sRNA. BrU-IP e Input SNCA è stato quantificato rispetto al BrU-IP e ingresso 18sRNA, rispettivamente, utilizzando il metodo diΔΔC -T 2. Risultati sono stati normalizzati per i campioni trattati con DMSO. Dati sono presentati come media ± quadratici. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando spaiato t test di Student, * p < 0,001, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: misura di altri geni non modificati da PLK-2i. PLK-2i cambia né il RNA totale né sintetizzati di ACTB, HMBS e NADH. ACTB (A), HMBS e NADH RNA dall'input sono stati misurati in triplice copia in un esperimento e quantificato rispetto 18sRNA in ingresso utilizzando il metodo diΔΔC -T 2. I valori sono stati normalizzati per i campioni trattato di DMSO e barre rappresentano la media delle triplici copie ± deviazioni standard, n = 1. (B) ACTB, HMBS e NADH erano anche misurato nel RNA BrU-IP'ed e quantificato rispetto al 18sRNA nel BrU-pi. Valori sono stati normalizzati a DMSO e presentati come in A, n = 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: specificità di BrU-IP. Per il confronto di 18sRNA catturato da BrU-IP da BrU - e non-BrU-cellule trattate, RNA da BrU-IP è stato convalidato rispetto al RNA Input per tenere conto delle differenze nel materiale di partenza e d'ora in avanti normalizzato a campioni BrU-trattati. Solo una frazione molto piccola (0,002) di 18sRNA-BrU-labelled era immunoprecipitati, dimostrando che il BrU-IP è altamente specifico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: livelli di diversi mRNAs in BrU-IP RNA rispetto all'Input RNA. Parecchi geni di riferimento potenziali sono stati testati perché alcuni RNA sarà presente in concentrazioni molto basse in RNA di BrU-IP a causa di piccole quantità di RNA prodotta entro il 1 h trattamento BrU. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'uso di BrU-IP per determinazione della produzione di RNA mediante etichettatura di recente prodotte RNA per 1 h con BrU, seguita da estrazione di RNA immediata e immunoprecipitazione di RNA BrU-etichettati. Questo metodo precedentemente è stato descritto nel riferimento16, e in questo articolo include alcuni passaggi aggiuntivi per aumentare la specificità IP e purezza RNA, dai branelli di pre-trattamento con basse concentrazioni di BrU, nonché una fase di purificazione del fenolo-cloroformio per aumentare la purezza RNA seguito IP. Inoltre, siamo presenti anche dati qui dimostrando la specificità del BrU-IP confrontando il RNA catturato da BrU e non-BrU cellule trattate. Purificazione di fenolo-cloroformio è economico, ma considerando la bassa quantità di RNA etichettati con BrU, segnali aumentati nell'analisi a valle potrebbero essere ottenuti utilizzando il kit di pulizia del RNA invece. La nostra esperienza è, tuttavia, che l'estrazione più uguale di RNA attraverso campioni si ottiene mediante purificazione fenolo-cloroformio.
BrU-etichettatura e IP sono, in contrasto con l'analisi dei livelli di RNA totali, in grado di indagare le cause delle variazioni dei livelli allo stato stazionario del RNA. Il metodo non ha alcun o limitata effetti sulla fisiologia cellulare, al contrario all'uso di inibitori trascrizionali come α-amanitina e actinomicina d. È stato suggerito che confronto di nuova sintesi RNA a livelli allo stato stazionario può essere utilizzato per calcolare RNA decadimento tariffe17, e il metodo di BrU-IP qui descritto consente la determinazione simultanea di sintesi di RNA e di decadimento in un saggio.
In Figura 5, abbiamo dimostrato che il RNA è che solo IP'ed da BrU trattato le cellule, mostrando che esiste effettivamente BrU inglobato il RNA nella linea cellulare usato qui. Tuttavia, si consiglia lo svolgimento di un test iniziale di BrU incorporazione nel RNA in altre linee cellulari prima di eseguire il BrU-IP. Questo potrebbe, ad esempio, essere fatto usando gli anticorpi anti-BrU BrU di quantificare in totale RNA estratti via macchia del puntino o analisi enzima-collegata dell'immunosorbente.
Qui non abbiamo presentato un test di efficienza di BrU-IP attraverso campioni, ma questo può essere studiato utilizzando punte BrU-etichettati in RNA sia prodotto in vitro o da un altro organismo, come Drosophila melanogaster. Questo RNA potrebbe quindi essere utilizzato anche nel downstream quantificazioni e normalizzazioni.
Tecniche di pipettaggio corretti sono cruciali durante l'esecuzione di analisi quantitative altamente sensibili, ad esempio BrU-IP e RT-qPCR, e deve essere compiuto uno sforzo particolare per eseguire pipettaggio uguale attraverso campioni. Le estrazioni di fenolo-cloroformio domanda qualche esperienza, ma al momento di pipettaggio insoddisfacente, le fasi acquose e fenolo/cloroformio possono essere re-mixate e centrifugate nuovamente.
Questo protocollo suggerisce BrU-etichettatura per 1 h quando si misura la sintesi del RNA. Questa volta etichettatura consente una stima approssimativa dei cambiamenti nella trascrizione, poiché la maggior parte degli umani e topi mRNA è stati stimati per avere Half-Life > 6 h18,19. Attenzione, tuttavia, essere esercitato quando l'interpretazione dei dati ottenuti, poiché molti RNA hanno emivite < 1h18,19, quali diverse trascrizioni indotta dal lipide A, che rapidamente aumentare la stimolazione e declinare torna a livelli della linea di base entro 2 h dopo induzione20. Per ridurre il rischio di influenze dalla degradazione di RNA, il tempo di BrU-etichettatura può essere diminuito, tuttavia, è anche importante etichettare abbastanza RNA per essere in grado di distinguere il RNA ottenuto da BrU-IP dallo sfondo (che è stato ottenuto dopo 1h etichettatura nel nostro (mani Figura 2)). Un'altra opzione è di misurare sia la sintesi del RNA e decadimento del gene di interesse utilizzando BrU-etichettatura e IP, quest'ultimo metodo è descritto in2. I dati da questi due approcci integrano tra loro, e se un cambiamento nella sintesi fra due circostanze è misurato, ma nessun cambiamento è visto nei tassi di decadimento, si può concludere che i cambiamenti misurati nel RNA erano dovuto il regolamento della sintesi. Tuttavia, è importante ricordare che entrambe le tecniche misurano solo funzionalità di RNA stimando i livelli del RNA e trascurano completamente di studiare altri meccanismi che influenzano le funzioni di RNA come modificazioni chimiche14.
Poiché le cellule vengono incubate con BrU per solo 1 h, molto lentamente prodotto mRNA può essere difficile da misurare usando il metodo di BrU-IP. Questo è un punto dove l'uso di inibitori trascrizionali come α-amanitina e actinomicina D potrebbe essere preferito su BrU-IP, tuttavia, può essere utilizzati solo per misurare le variazioni di degrado e non direttamente misurare la produzione di RNA. Inoltre si possono superare i bassi livelli di RNA BrU-etichettati aumentando il tempo di incubazione con BrU, però, tempi di incubazione lunga aumentano il rischio di influenze dalla degradazione di RNA. In tal caso, non è più possibile sapere se cambiamenti nel RNA BrU-etichettati sono causate da cambiamenti nella produzione di RNA o decadimento.
In questo esempio, viene eseguita l'analisi a valle del RNA BrU-etichettati catturato usando RT-qPCR, tuttavia, prossima generazione sequenziamento è anche un metodo ampiamente usato a valle alla schermata per le modifiche in una grande piscina di RNAs2,13. Analogamente, il metodo non è limitato all'analisi del mRNA, ma può analizzare tutti i tipi di RNA2.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
La Fondazione di Lundbeck, Università di Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s sostenuto questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
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