Summary
Deze studie presenteert een verbeterde konijn model geïnfecteerd met Staphylococcus aureus door het blokkeren van de dezelfde hoeveelheid bacteriën in het beenmerg. Vancomycine geladen calciumsulfaat en autogene bot worden gebruikt voor de behandeling van antibioticum en bot reparatie. Het protocol zou nuttig zijn voor de studie van bot infectie en regeneratie.
Abstract
Bot infectie het gevolg van bacteriële invasie, die zeer moeilijk te behandelen in traumatische, klinische en orthopedische chirurgie. De bot infectie kan leiden tot langdurige ontsteking, osteomyelitis en uiteindelijke been buiten de Unie. Oprichting van een haalbaar, reproduceerbare diermodel is belangrijk om het bot infectie onderzoek en behandeling met antibiotica. Als een in vivo model, wordt het model van het konijn veel gebruikt in bot infectie onderzoek. Echter, vorige studies op konijn bot infectie modellen toonde aan dat de status van de infectie inconsistent, was net als de hoeveelheid bacteriën variabele. Deze studie geeft een verbeterde chirurgische methode voor inducerende bot besmetting van een konijn, door het blokkeren van de bacteriën in het beenmerg. Multi-level evaluaties kunnen vervolgens worden uitgevoerd om te controleren of de modellering methode.
Debriding necrotisch weefsel en implantatie van vancomycine-geladen calciumsulfaat (VCS) zijn in het algemeen, overheersend in behandeling met antibiotica. Hoewel calciumsulfaat in VCS voordelen Osteocyt kruipen en nieuwe botgroei, optreden massale bot gebreken na debriding. Autogene bot (AB) is een aantrekkelijk strategie te overwinnen bot gebreken voor de behandeling van massale bot gebreken na debriding necrotische bot.
In deze studie gebruikten we de staart bot als een autogene bot geïmplanteerd in het bot defect. Bot reparatie werd gemeten met behulp van micro-berekend-tomografie (micro-CT) en histologische analyse na dierlijke offer. Dientengevolge, in de groep VCS was bot non-adhesie consequent verkregen. Daarentegen waren de botten defect gebieden in de VCS-AB groep aanzienlijk afgenomen. De huidige methode van de modellering beschreven een haalbaar, reproduceerbare methode ter voorbereiding van een bot besmetting-model. De behandeling van de VCS-AB resulteerde in lagere been buiten de Unie na behandeling met antibiotica. De verbeterde bot infectie model en de behandeling van de combinatie van VCS en autogene bot zou kunnen bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen in bot infectie en bot regeneratie relevant is voor de traumatologie orthopedische toepassingen nuttig zijn.
Introduction
Bot infectie meestal het gevolg van bacteriën of andere micro-organismen invasie na trauma, botbreuk, of andere bot ziekten1. Bot infectie kan leiden tot een hoog niveau van ontsteking en bot weefselvernietiging. In de kliniek is Staphylococcus aureus (S. aureus) de belangrijkste verwekker van bot infectie2,3. De bot infectie is pijnlijk, slopende, en neemt vaak een chronische cursus die uiterst moeilijk te behandelen van4. Op dit moment is debridement van necrotisch weefsel en implanteren van vancomycine-geladen calcium (VCS) kralen bevestigd dat een efficiënte strategie voor de beheersing van de lokale infectie5,6. 10% tot 15% van de patiënten ervaren echter een langdurige bot herstelproces, vertraagde adhesie of non-adhesie na anti-infectie behandeling7. Het grote segment van een bot defect is de moeilijkste kwestie voor orthopedische chirurgen. Een autologe bottransplantatie wordt beschouwd als de optimale bot vervanging in bot non-adhesie behandeling8,9.
Tot op heden heeft het merendeel van de studies over bot zijn infectie en autologe bot innesteling uitgevoerd in verschillende soorten dierlijke modellen, zoals ratten, konijnen, honden, varkens en schapen10,11. Konijn modellen worden meestal gebruikt voor bot infectie studies, als eerste uitgevoerd door Norden en Kennedy in 197012,13. In onze eerdere studie, we gebruikten konijn modellen van Norden methode, en we vonden dat de hoeveelheid van S. aureus geïnjecteerd in het beenmerg kon niet worden gekwantificeerd nauwkeurig, zoals het lekken van bloed uit het beenmerg tot bacteriën oplossing overloop leidde.
Dit artikel presenteert een verbeterde chirurgische methode voor inducerende bot infectie van konijnen. Aan het einde van de procedure, werden een bloedonderzoek van de biochemie, een bacteriologisch onderzoek en een histopathologische onderzoek uitgevoerd om te controleren of het bot infectie model. Vervolgens VCS was geïmplanteerd om te remmen infectie en autogene bot was geïmplanteerd ter bevordering van de regeneratie van bot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De konijnen gebruikt in de huidige studie werden behandeld in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle experimentele procedures werden gevolgd door de regels van de bio-ethiek Commissie van Zhejiang Academie voor traditionele Chinese geneeskunde.
1. bereiding van de bacteriële suspensie
- Los 0,5 mg van S. aureus vriesdrogen poeder (ATCC 6538) met 0.3 mL Luria Bertani kweekmedium. Meng schorsing volledig.
- Strijk de entsuspensie op al soja agar platen en Incubeer de bacteriële kolonies bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Selecteer een enkele bacteriële kolonievormende eenheid (CFU) en cultuur in al soja Bouillon buizen voor 24 h. uitvoeren een subcultuur gedurende ongeveer 24 uur bij 37 ° C, en verkrijgen van medio-logaritmische groei fase bacteriën na 16 tot 18 uur, wanneer de waarde van de optische dichtheid (OD) 0.6 op 600 is nm 14.
- Breng 1 mL van de entsuspensie in een centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 5 min op 825 x g - en 4 ° C, en verwijder het supernatant. Resuspendeer en wassen van de bacteriën met 100 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); Herhaal deze stap 3 keer. Ten slotte resuspendeer bacteriën met 3 mL PBS.
-
Schatting van de concentratie van de bacteriën met behulp van de McFarland turbidimetrie15.
- Breng 100 tot 500 µL van de entsuspensie tot een colorimetrische koker totdat de troebelheid gelijk aan een 0,5 McFarland standaard is.
- Troebelheid beoordelen door visuele vergelijking aan de 0.5 McFarland, wanneer de inhoud van bacteriën ongeveer 10 bereikt8 CFU/mL.
Opmerking: Zorg ervoor dat het volume van de entsuspensie is voldoende voor de volgende protocollen. Voor elk konijn is het volume van de entsuspensie minder dan 1 mL.
- Breng een agarplaat 0,2 mL van bacteriële suspensie en gelijkmatig toe te passen. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 h. graaf de kolonies van bacteriën om te controleren of de CFU van de entsuspensie.
2. opstelling van bot infectie modellen
- Houd mannelijke Nieuw-Zeeland witte konijnen, leeftijd van 3 maanden, in afzonderlijke kooien, onder lucht-gecontroleerde omstandigheden (20 ± 1 ° C) en 12/12 uur licht-donker verlichting cycli. Bieden van routine dieet en leidingwater dagelijks.
- Ervoor zorgen dat ten tijde van de operatie dat het konijn meer dan 3 kg weegt.
- Anaesthetize konijnen door intraperitoneale injectie met pentobarbital natrium (3 mg per 100 g lichaamsgewicht). Zorg ervoor dat konijnen zijn volledig verdoofd door een mislukking om te reageren op een poot snuifje. Fix konijnen op de operatietafel tijdens operatie procedure.
Opmerking: Zorg ervoor dat het modelleren procedure duurt minder dan 1 uur. - Scheren van de proximale tibia regio met behulp van een elektrisch scheerapparaat tegen de richting van de haargroei. Desinfecteren van de huid door een Povidon-jodium oplossing toe te passen.
- Mark van de bovenkant van het scheenbeen en het boren gat standpunt voor injectie met S. aureus (de afstand tot de bovenkant van het scheenbeen is 1,5 cm) met pen en liniaal. Zorg ervoor dat de boren gat posities zijn in het midden van de Tibia plateau horizontaal(Figuur 1).
- Tibia huid met behulp van een scalpel No. 11 knippen en maak een incisie van 1 cm in het beenvlies (Figuur 1B, C). Punch een 2 mm diameter gat in het onderbeen met behulp van een elektrische bot boor eenheid (Figuur 1D).
- Druk op de 2 mm diameter gaten in de tibiale plateau met een cilinder van bot was van 2 mm diameter en 2 mm hoogte (Figuur 1E). Verwijder de reserve bot was langs het horizontale vlak van de Tibia plateau (Figuur 1F). Controleer of het gat 2 mm vol met been wax (Figuur 1G is).
Opmerking: Ervoor zorgen dat de gaten vol met been wax door het controleren van het gat met of zonder bloed overloop. - Naai tot het beenvlies en huid met absorbeerbare chirurgische hechtdraad in een verticale matras Sutuur (geologie) om te voorkomen dat het dier kauwen de hechtingen (Figuur 1H).
- 1 x 108 CFU/mL van de oplossingen van de S. aureus (30 µL per 100 g lichaamsgewicht) injecteren met een 1 mL asepsis injector (Figuur 1ik). Zorg ervoor dat de naalden penetreren de bot was en het injecteren van de S. aureus -oplossing in het beenmerg langzaam.
- Houd het dier te vermijden van warmteverlies na modellering warm en schone omstandigheden. Ademhaling en hartslag controleren. Na het wakker worden, het huis van de konijnen in afzonderlijke kooien met gratis toegang tot voedsel en water.
3. evaluatie van bot infectie Model
- Dagen 7, 14, 21 en 28 na infectie, konijnen in de fixer konijn met het hoofd en oor buiten de fixer te plaatsen.
-
2 mL bloed trekken door de auricular aderen verpakkingsgasssen dikaliumhexafluorozirkonaat ethyleendiamminetetra zuur (EDTA-K2) anticoagulatie bloed. 1 mL bloed trekken door een bloedvat verpakkingsgasssen bloed. Centrifugeer het serum voor 10 min met een snelheid van 651 x g bij kamertemperatuur.
- Witte bloedcellen (WBC) bepalen in volbloed met behulp van een biochemische analyzer van bloed, en C - reactief proteïne (CRP) door een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methode16.
- Anaesthetize in dagen 7, 14, 21 en 28 na infectie, één model konijn met pentobarbital natrium bij de dosering van 3 mg / 100 g lichaamsgewicht. Tibia huid met behulp van een scalpel No. 11 knippen en maak een incisie van 2 cm in het beenvlies(Figuur 2).
- Schoon been wax. Debride necrotische bot door ponsen van twee aangrenzende 4,8 mm diameter gaten met behulp van een elektrische bot boor eenheid (Figuur 2B). Debride necrotische beenmerg en granulatie weefsel met behulp van een bot lepel (Figuur 2C).
Opmerking: Schone botweefsel tijdens de debridement te vermijden botweefsel resterende in het beenmerg. - Schrapen en reinig het botweefsel tussen de twee gaten (Figuur 2D).
- 1 mL van het beenmerg op schapen bloed agar platen verspreid. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C. Platen van 30-300 kolonies selecteren, en het aantal kolonies te berekenen.
- Aan het eind van de dag 28 na infectie, pak tibia exemplaren langs de randen van de gewrichten van knie- en enkel. Correctie van de tibia specimens in 4% paraformaldehyde voor 24 h. Decalcify de tibia specimens in 10% EDTA voor 8 weken.
- De tibia-modellen in een gesorteerde reeks van ethanol verdunningen uitdrogen, en vervolgens insluiten in paraffine. Snijd 4 opeenvolgende 5 µm secties van de coronale vliegtuigen. Vlek secties met een haematoxyline en eosine (H & E) kleuring kit.
- Met een Microscoop kunt bekijken de gekleurde secties en doorvallend licht beelden met standaard software registreren.
4. voorbereiding van de VCS kralen
- 1 g vancomycine hydrochloride poeder toevoegen aan 9,5 g van medische kwaliteit calciumsulfaat en vervolgens Voeg 3 mL van normale zout aan de gemengde macht. Meng met een spatel voor 30 tot 45 s.
- Plaats het gemengde product in een flexibele silicagel mal (cilinder van 4,8 mm diameter en 4,8 mm hoogte) en drogen bij kamertemperatuur voor 15 min. verwijderen de VCS kralen door het buigen van de schimmel.
5. antibiotische behandeling en implantatie van autogene bot
- Anaesthetize model konijnen met pentobarbital natrium bij de dosering van 3 mg / 100 g lichaamsgewicht op de 28th dag na infectie. De regio van de proximale tibia met behulp van een elektrisch scheerapparaat te scheren. Desinfecteren van de huid door Povidon-jodium oplossing toe te passen.
Opmerking: Zorg ervoor dat de modellering procedure minder dan 1 uur is. - Scheren van de staart regio met behulp van een elektrisch scheerapparaat en Desinfecteer de staart door Povidon-jodium oplossing toe te passen.
- Bezuinigen op de staart met behulp van chirurgische scharen. Knip staart huid met behulp van een scalpel No. 11 en onthullen de staart bot. Naai de huid op de staart regio met absorbeerbare chirurgische hechtingen in een verticale matras Sutuur (geologie) om te voorkomen dat het dier de hechtingen te kauwen.
- Verwijder elke spier, zacht weefsel en beenvlies. Loskoppelen van de staart bot bij elke joint en het bot fragment overbrengen in een 100 mm kunststof schotel met steriele zoutoplossing.
- Implantaat 4 stuks van VCS parels (cilinder van 4,8 mm diameter en 4,8 mm hoogte, 1,25 mg vancomycine per stuk van parel) in het beenmerg holte met gebogen pincet (Figuur 2E).
- Vul het been defect met 8 stuks van autogene botten (cilinder met een diameter van 2 mm en 4 mm hoogte per elk stuk) met behulp van gebogen pincet(Figuur 2).
- Naai tot het beenvlies en huid met absorbeerbare chirurgische hechtingen in een matras hechtdraad wijze (Figuur 2F).
Opmerking: Houd de temperatuur bij 25 ° C tijdens de operatie. - Houd het dier in warme en schone omstandigheden om warmteverlies te voorkomen dat na de operatie. Ademhaling en hartslag controleren. Na het wakker worden, het huis van de konijnen in afzonderlijke kooien met gratis toegang tot voedsel en water.
6. beoordeling van antibiotische werking
- Konijnen gestoken een konijn fixer en plaats van het hoofd en oor buiten de fixer op 2, 4, 6 en 8 weken na de behandeling.
- Bloed trekken auricular aders met EDTA-K2 anticoagulatie bloedvat. 1 mL bloed trekken door een bloedvat verpakkingsgasssen bloed. Centrifugeer het serum voor 10 min met een snelheid van 651 x g bij kamertemperatuur.
- Witte bloedcellen (WBC) in volbloed bepalen met behulp van biochemische analyzer van bloed, en C - reactief proteïne (CRP) door een ELISA methode16.
7. beoordeling van de Bone Regeneration
- Konijnen door het injecteren met een meer dan euthanaseren doseringen van pentobarbital natrium, aan het einde van 8 of 12 weken na de behandeling.
- Uittreksel tibia specimens, langs de randen van de gewrichten van knie- en enkel. Debride spieren en fasciaal lagen.
- Structuur van tibia analyseren met behulp van micro-berekend tomografie (micro-CT). Kies een ovale gebied 4,8 mm diameter en 9.6 mm lang als de regio van belang (ROI). Reconstrueren 3D-model beelden met behulp van bitmapgegevens.
- Scores van de verhouding van bot volume/weefsel volume (BV/TV), trabecular dikte (Tb.Th), kies trabecula nummer (Tb.N) en trabecular scheiding (Tb.Sp)from the3D modellen te beoordelen bot regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van bot infectie Model
Na infectie met S. aureusleken de pathologische uitingen van konijnen op de representatieve symptoom van chronische osteomyelitis in de kliniek. In onze studie, waren 30 konijnen besmet, onderworpen als een Modelgroep en 10 konijnen waren onderworpen als de controledieren. Alle de model konijnen hebben besmet sinussen van de lokale site van tibia, met witte en gele pus over vloeien voort uit de sinussen (Figuur 3A). De resultaten van de H & E kleuring geven dat bacteriële aggregaten bevinden zich rondom het dode bot in de modelgroep en normale osteocytes kunnen niet worden geïdentificeerd. Het gehalte aan CRP en WBC zijn hoger in de modelgroep dan de controlegroep (Figuur 3B). De necrotic beenmerg lysates zijn streaked op agar platen, die in een toenemend aantal kolonies voor de modelgroep na infectie (Figuur 3C resulteren). Aan het einde van de modellering waren er 3 konijnen dood vanwege ernstige infectie. De resterende besmette konijnen werden geïdentificeerd als het bot infectie model en werden in 3 groepen verdeeld: model groep, VCS groep en VCS-AB groep.
Beoordeling van antibiotische werking en regeneratie van bot
Op 2, 4, 6 en 8 weken na de behandeling met de VCS of VCS-AB, het gehalte aan CRP en WBC aanzienlijk worden verminderd (Figuur 4A). Na 12 weken innesteling van de VCS en bot allograft leek tibiale defecten van de VCS-AB groep volledig coalescent. Tibia plateau oppervlakken van de VCS-AB-groep zijn platter dan die van de Fractie van de VCS. 2D wederopbouw beelden geven een geleidelijke toename van de bot volume tijdens de periode van 12 weken na behandeling met VCS-AB en VCS, terwijl de botverlies is significant in de modelgroep (Figuur 4B). Voor het analyseren van de bot regeneratie kwantitatieve indexen, een ovale gebied 4,8 mm diameter en 9.6 mm lang werd gekozen als de regio van belang (ROI) (Figuur 4C), en afbeeldingen van 3D modellen werden gereconstrueerd met behulp van bitmapgegevens. De micro-CT indexen BV/TV in de modelgroep waren beduidend lager dan dat in de VCS en VCS-AB groepen. De scores van het Tb.N en Tb.Th in de VCS-AB-groep waren aanzienlijk hoger dan die in het model en de groep van de VCS. Bovendien zijn de scores van de Tb.Sp in de VCS-AB groep aanzienlijk lager dan die in de modelgroep en VCS groep (Figuur 4D).
Deze resultaten suggereren dat infectie met S. aureus oorzaken toenemende WBC en CRP in de modelgroep, die kan worden verlaagd met behulp van de VCS. De inplanting van de VCS wordt beschouwd als de optimale behandeling met antibiotica. Echter, het bot defect is waarneembaar in de VCS-groep. De VCS en autogene bot behandeling verhogen de trabeculae dikte en trabeculae nummer en afnemen van de trabecular scheiding. De behandeling van de VCS-AB toonde vermogen ter bevordering van genezing van bot.
Figuur 1 . Chirurgische voorbereiding van het bot infectie model. (A) toont de ponsen plaats op het onderbeen. De afstand tussen de boren gat positie voor injectie met S. aureus aan de bovenkant van het scheenbeen 1,5 cm. (B is) incisie gemaakt in de huid om het beenvlies bloot te stellen. (C) toont incisie gemaakt door het beenvlies bloot van het scheenbeen. (D) Punch een gat 2 mm diameter in het scheenbeen. (E) vulling de 2 mm diameter gat vol met been wax. (F), is afgesneden van vrije been wax. (G) Toon de bot was vullen het bot defect. (H) Sew omhoog het beenvlies en de huid. (ik) Inject met S. aureus -oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Voorbereiding van bot allograft en antibioticum behandeling. (A) incisie gemaakt in de huid beenvlies bloot te stellen. (B) Punch van twee aangrenzende 4,8 mm diameter gaten. (C) Debride necrotische bot en inflammatoire beenmerg. (D) schrapen en schoon het botweefsel tussen de twee gaten te maken van een lange cirkel met 4.8 mm diameter en 9.6 mm lang. (E) Vul het gat met VCS en bot allograft. (F) Sew omhoog het beenvlies en de huid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Evaluatie van bot infectie model. (A) uiterlijk kenmerken van de benen van de konijn besmet met S. aureus, en typische histopathologie beelden van de tibia konijn in de model- en controlegroepen. Blauwe pijl: Osteocyt; Roze pijl: bone trabeculae; gele pijl: bacteriële aggregaten; groene pijl: dode bot. (B) de WBC en CRP resulteert in de konijnenserum op de punten van de tijd van vóór de modellering, 7, 14, 21 en 28 dagen na infectie. De kolommen vertegenwoordigen de gemiddelde ±SE, *p < 0.05 vs. de controlegroep. (C) het aantal bacteriële kolonies in het beenmerg van de tibia geteld na overnachting incubatie. De kolommen vertegenwoordigen de gemiddelde ±SE, *p < 0,05 vs. de kolonie rekenen op dag 0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Beoordeling van antibiotische activiteit en bot regeneratie. (A) de resultaten van WBC en CRP in konijnenserum op de tijdstippen van 2, 4, 6 en 8 weken na implantatie van VCS en VCS-AB, de punten vertegenwoordigen de gemiddelde ±SE, #p < 0,05 en *p < 0.05 t.o.v. de modelgroep. (B) de coronale sectie beelden van tibia geanalyseerd door micro-CT. (C) de locatie van de ROI. (D) de histogrammen show het bot volume/weefsel volume (BV/TV), trabecular dikte (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) en trabecular scheiding (Tb.Sp) scores van ROI van vijf konijnen per groep. De kolommen vertegenwoordigen de gemiddelde ±SE, *p < 0.05 vs. de controlegroep of de modelgroep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . De tijdlijn van alle procedures. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de vorige studies, werden diverse soorten dierlijke modellen gebouwd om te studeren zowel acute en chronische bot infectie; echter blijft de zoektocht naar het ideale model17,18. Bovendien, het ideale bot infectie model naar verwachting simuleren de pathologische kenmerken van bot infectie in klinische setting, terwijl de modellering periodes, blijven low-cost en gemakkelijk uit te voeren. Tot nu toe is het konijn bot infectie model het meest voorkomende model in het onderzoek van de ziekte van de inflammatoire bot, zoals de konijnen beschikbaar, haalbaar en goedkoop zijn. In onze eerdere studie vergeleken we de sterftecijfer en de besmettingsgraad van konijnen met uiteenlopende gewichten van het lichaam. De resultaten toonden aan dat het lichaamsgewicht meer dan 3 kg moet; anders zou er een hoog sterftecijfer of een hoge incidentie van haematosepsis en een hogere mortaliteit na de operatie.
In tegenstelling tot eerdere studies, het konijn bot infectie modellen en behandeling met antibiotica in onze studie zijn consistent met de pathologische kenmerken van ziekten bij de mens en de chirurgische therapie. In de vorige studie, hadden dieren ingespoten met natrium morrhuate en S. aureus geen pathologische status meer dan 60 dagen. Bovendien, het sterftecijfer was meer dan 20%12,19. De overflow S. aureus oplossing bot afwijkingen had bewezen voor het opwekken van een lage besmettingstarief. We been wax gebruikt om te vullen het gat 2 mm op het scheenbeen, om het blokkeren van de S. aureus -oplossing in het beenmerg en zorgde ervoor dat de gaten vol met been wax werden door het controleren van het gat met of zonder bloed overloop. Als de dikte van een konijn tibia 2 mm was, we gedrukt een cilinder met een diameter van 2 mm en 2 mm hoogte bot wax in de gaten 2 mm diameter, die ervoor de bot was zorgden het gat gevuld en niet kon infiltreren in het beenmerg. Bovendien, zoals de bot was was flexibel en stabiel, het de gaten gevuld en kon niet smelten of reageren met het beenmerg. In onze studie, op de 28ste dag na infectie, de bot wax nog compleet was en de gaatjes volledig gevuld. Zoals de gewichten van de konijnen meer dan 3 kg en minder dan 3,2 kg waren, was de omvang van de entsuspensie 900 µL tot 960 µL. Vanwege de lage snelheid van injectie en blokkerende functie van bot was, kon dit volume van de entsuspensie in beenmerg zonder hogedruk worden ingespoten. De resultaten toonden aan dat dit protocol zorgt ervoor de hoeveelheid van S. aureus geïnfecteerde in het beenmerg dat. Een 2 mm diameter gat was sloeg in het scheenbeen om ervoor te zorgen dat de afstand tot de bovenkant van het scheenbeen 1,5 cm, die het gat op de Tibia plateau is, zorgen voor voldoende ruimte om te debride en implantaat VCS kralen en autogene bot bij de volgende behandeling lokaliseert. Tijdens het modelleren, 3 konijnen gestorven als gevolg van ernstige infectie. Het bleef konijnen aangemerkt als bot infectie konijnen, en de infectie-tarief in de resterende konijnen was 100%. In vergelijking met andere bot infectie protocollen, zoals de inplanting van sponzen doorweekt met S. aureus of de inplanting van vreemde stoffen, onze protocollen nauw simuleren bot infectie in klinische setting, en weinig effect hebben op de procedures, die Als debriding necrotische bot en behandeling met antibiotica.
Diagnose van bot infectie is een uitdaging voor chirurgen. De laboratorium testresultaten, met inbegrip van serum ontsteking marker detectie, microbiologie en histopathologie analyse werden gebruikt voor het evalueren van bot infectie in klinische instellingen20. Diagnostische beeldvorming, zoals echografie, radiologie, computertomografie, magnetische resonantie beeldvorming of Ramanspectroscopie werden ook toegepast om te detecteren bot infectie21. Helaas, diagnose van osteomyelitis via imaging methoden wordt vaak vertraagd doordat necrose van het bot is difficult om op te sporen door gewoon radiografie tot week 3 van infectie. In onze studie, we gewend serum ontsteking marker detectie histopathologie analyse en evaluatie van bot infectie modellen, aangezien deze methoden effectief, bediend waren en de indexen gevoelig waren. De volgende zijn de belangrijkste stappen van de chirurgische procedure een bot infectie om model te maken in onze studie. Kies de konijnen met passende lichaamsgewicht de chirurgie en de behandeling uit te voeren. Een steriele omgeving tijdens de verhoging en chirurgische procedure handhaven, en waarborgt voorts warm na het protocol van de chirurgische ingreep. Punch een 2 mm diameter gat in het scheenbeen, en ervoor zorgen dat de afstand tot de bovenkant van het scheenbeen is 1,5 cm. Vul het gat met been wax en naai tot het beenvlies en de huid om het blokkeren van de bacteriën-oplossing. De belangrijkste stappen van antibiotische behandeling zijn de volgende. Zorgen voor de pathologische bot infectie van de konijnen door het opsporen van WBC in volbloed en CRP in het serum. Debride necrotische bot volledig, punch twee gaten van de diameter van de aangrenzende 4,8 mm en schrapen en schoon het botweefsel tussen de 2 gaten. Implantaat 4 stukken van VCS kralen en 8 stukken van autogene bot in het beenmerg en bot defect.
Na behandeling met antibiotica vastgesteld we hebben dat de konijnen in de VCS-AB-groep had een hogere osteogenic potentieel dan die in de VCS-groep. Dit kan zijn omdat het autogene bot geactiveerde osteocytes bevat en been vorming groeifactoren, die bot matrix in heel het oppervlak van de prothese, produceren overwegende dat de afbraak van VCS induceert schaarse matrix op de defect-regio bot. Onze resultaten wijzen erop dat het autogene bot de superieure osteogenic vermogen heeft. Hoewel autogene bot oogsten is beperkt in omvang en morbiditeit op de site van de donor met zich meebrengt, is het belang van autogene bot niet te verwaarlozen22,23,24. In onze studie, werd het autogene bot overgenomen van de staart bot, die voorkomt van systemische schade, en vermindert sterftecijfer in vergelijking met autogene bot van iliac bot wint. Autograft bot van de staart bot is misschien wel de voorkeur praktijk materiaal in de dierlijke studie van bot infectie.
Kortom, werd een verbeterde konijn model van bot infectie opgericht in deze studie. Ontsteking indexen en bloed biochemische indexen werden gebruikt om de schatten van het bot infectie model. Ook, na behandeling met antibiotica, multilevel analyses werden uitgevoerd om te detecteren antibiotische activiteit en bot Regeneratie vermogen. De modellering, de behandelprotocollen en de evaluatiemethoden zijn haalbaar en betrouwbaar. Verder onderzoek zal worden gericht op profiteren van multimodaliteit visuele apparaten om de pathologische proces van bot infectie en het herstelproces bot te controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81803808, 81873062), Zhejiang provinciale geneeskundige en Health Science, Technology Fund (2017KY271) en de wetenschap en technologie Project van de provincie Zhejiang (2017C 37181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable surgical suture | Jinghuan | 18S0604A | |
| asepsis injector | Jinglong | 20170501 | |
| bone wax | ETHICON | JH5CQLM | |
| CCD camera | Olympus | DP72 | |
| EDTA-K2 anticoagulant blood vessel | XINGE | 20170802 | |
| Electric bone drill unit | Bao Kang | BKZ-1 | |
| Electric shaver | Codos | 3800 | |
| flexible silica gel mold | WRIGHT | 1527745 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime | 20170523 | |
| Luria-Bertani culture medium | Baisi Biothchnology | 20170306 | |
| Medical-grade calcium sulphate | WRIGHT | 1527745 | |
| microcomputed tomography (micro-CT) | Bruker | SkyScan 1172 | |
| Microscope | Olympus | CX41 | |
| New Zealand white rabbits | Zhejiang Experimental Animal Center | SCXK 2014-0047 | |
| No. 11 scalpel | Yuanlikang | 20170604 | |
| normal saline | Mingsheng | 20170903 | |
| PBS | TBD(Jingyi) | 20170703-0592 | |
| pentobarbital sodium | Merk | 2070124 | |
| povidone-iodinesolution | Lierkang | 20170114 | |
| S. aureus freeze drying powder | China General Microbiological Culture Collection Center | ATCC 6538 | |
| sheep blood agar | HuanKai Microbial | 3103210 | |
| tryptic soy agar plates | HuanKai Microbial | 3105697 | |
| tryptic soy broth tubes | HuanKai Microbial | 3104260 | |
| Vancomycin | Lilly | C599180 |
References
- Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
- Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
- Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
- Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
- Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
- Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
- Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
- Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
- Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
- Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
- de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
- Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
- Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
- Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
- Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
- Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
- Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
- Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
- Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
- Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
- Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
- Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).
