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방법 논문

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

9.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57498

⸱

2018년 4월 26일

 , 
1Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center

이 논문에서

요약

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

초록

녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 많은 인간 질병과 관련 된 되었습니다 그리고 지금 많은 신호 경로 대 한 중요 한 발견 되 고 있습니다. 쉽게 다양 한 실험 조건에서 이러한 섬유의 형성을 감지 하는 능력은 그들의 잠재적인 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 많은 방법이 섬유 검출에 사용 된 있지만 몇 가지 단점이 없이. 예를 들어 전자 현미경 (EM), 또는 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 종종 얼룩이 섬유의 정화를 요구 한다. 다른 한편으로, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) 정화 없이 셀 추출 물에 SDS 저항 아 밀 로이드 같은 섬유의 탐지를 허용 한다. 또한, 섬유의 크기 차이의 비교 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 서쪽 blotting에 의해 섬유 내의 특정 단백질을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 시간이 덜 소모 되 고 실험실의 넓은 수에 더 쉽게 액세스할 수입니다. SDD-나이 결과 종종 변수 정도의 표시 됩니다. SDS의 전기 이동 법 동안 복잡 한 단백질의 분리에서 결과이 부분의 여부를 문제를 발생 시킵니다. 이러한 이유로, 우리 SDD-연령 인지 확인 하려면 SDD 시대에 본 크기가 진정으로 섬유가 생체 내에서 의 결과 하지 저하 또는 일부 중 단백질의 분리의 결과의 두 번째 차원 고용 전기 이동 법입니다. 이 메서드는 빠른, 질적 확인을 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유는 SDD-나이 과정에서 부분적으로 해리 하지 않을 수 있습니다.

서론

단백질 misfolding로 인해 녹말 체 섬유의 형성이 오래 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병1pathologic 상태에 역할을 알려져 있다. 더 최근에, 녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유의 형성 안티 바이러스 타고 난 면역 반응2 와 necroptosis3,4, 동안 포함 한 인간, 그리고 낮은 유기 체 신호 통로의 일부가 될 표시 되었습니다. 효 모5,6등. 따라서, 실험실에서 이러한 섬유를 감지 하는 능력은 중요 합니다. 현재, 아 밀 로이드 및 아 밀 로이드 같은 섬유 감지 하 세 가지 주요 방법이 있다: 염료, EM, SDD-나이의 사용.

콩고 빨강 또는 Thioflavin T 같은 염료를 사용 하 여 신속 하 고 쉽게 현미경 검사 법 또는 분광학7를 사용 하 여 감지 되는 장점을 제공 합니다. 그러나, 현미경 검사 법, 콩고 빨강의 경우에 의해 탐지 아무 특이성을 대 한 단백질 구성 섬유 또는 섬유의 크기를 제공 합니다. 마찬가지로, 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 바인딩 단백질 복합물을 검출 하는 분광학의 사용만 긍정적 이거나 부정적인 결과를 제공 합니다.

그들의 섬유와 섬유 길이 직경8에 대 한 정량적 인 정보 존재의 결정적인 증거를 제공합니다. 그러나,이 방법은 매우 엄격한 정화를 요구 한다. 또한, 그들은 비싼 장비를 사용 하 여 전문된 기술.

SDD-나이 SDS 저항 메가 돌턴 단백질 복합물 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유를 포함 하 여 검색 사용 되었습니다. 그것은 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 그것은 섬유의 정화를 요구 하지 않는다 고 수행9쉽습니다. 둘째, 그것은 상대적인 크기와 양의 섬유 heterogenicity 포함 하 여 섬유의 크기에 대 한 질적 정보를 제공 합니다. 마지막으로, 서 부 럽 전기 이동 법 후 수행할 수 있습니다, 때문에 그것은 비록 그 SDD 연령 반 변성 때문에 일부 epitopes 남아 있을 수 있습니다 은폐를 주목 해야 한다는 어떤 단백질의 항 체은 존재를 검출 하기 쉽다 항 체에 의해 감지를 복잡.

최근, 수용 체 상호 작용 단백질 키 니 아 제 1 (RIPK1) 및 3 (RIPK3) 플랫폼 necroptosis, 괴 사3의 프로그램된 형태 중 신호 역할을 양식 녹말 체 섬유에 보고 되었습니다. 이러한 섬유, 공부 하는 동안 우리의 실험실 아 밀 로이드 같은 섬유4을 형성 하는 또 다른 necroptosis 관련 된 단백질, 혼합 계보 니 도메인 같은 (MLKL), 보였다. 그러나, 검사 SDD-나이, MLKL 섬유의 크기 (그림 1) 서로 동일한 등장 RIPK1 및 RIPK3 섬유에서 등장. 그것은 잘 알려진 MLKL necroptosis 신호 복잡 한 necrosome10라는 형태로 RIPK1/RIPK3에 바인딩합니다 때문에 이것은 예상 이었다.

적어도 2 개의 설명이 있다. 먼저, 두 개의 완전히 다른 아 밀 로이드 같은 섬유 necroptosis, 포함 한 RIPK1/RIPK3 및 다른 포함 MLKL 동안 형성할 수 있습니다. 둘째, 아 밀 로이드 같은 섬유 포함 RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis, 하지만 다른 단백질 MLKL의 협회 동안 형성 될 수 있습니다만 한 가지 유형의 SDD 시대 dissociates 충분히 약한입니다.

이 해결 하기 위해 수행 하는 2 차원 (2D) SDD-나이 제안 한다. SDD-나이-안정 아 밀 로이드 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 첫 번째와 두 번째 차원 전기 이동 법 동안 동일한 마이그레이션 패턴을 갖습니다. 이것 막 단백질을 전송 하 고 서쪽 오 점 후 감지 될 것입니다. 안정적인 섬유 날카로운 대각선 패턴을 전시할 것 이다. 이에서 어떤 편차 섬유 SDS 전기 영동으로 변화 받아야 좋을 것.

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프로토콜

1. 샘플 준비

  1. 문화 2 x 106 아 밀 로이드 10 ml의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 스-10cm 조직 문화 접시에 HT-29 결 장 암 세포를 생산. 문화 셀 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.
    1. 세포가 80 %confluency, 성장 후 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL로 세포 세척. 트립 신 솔루션의 3 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 셀 접시에서 완전히 끊 후, 문화 매체의 10 mL을 추가 하 고 10 mL 피 펫 셀 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온에서 3 분 1000 x g에서 셀 원심 매체를 발음, resuspend 문화 매체의 5 mL에 셀과 셀 카운터를 사용 하 여 셀. 두 10 cm의 각 플레이트 2 x 106 셀.
    3. 준수 하 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 복구를 셀 수 있습니다. 한 접시 20 ng/mL 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 100 nM Smac 모방 및 20 µ M 팬 caspase 억제제 Z-VAD-FMK11와 amyloids의 형성을 유도 하에 치료를 적용 됩니다. 조합으로 TSZ 약식 이다. 제어로 차량 다른 요리를 취급 합니다.
  2. 적절 한 길이의 시간 후 보통 6 h 세포 lysate 수확.
    1. 플라스틱 스 크레이 퍼로 접시에서 셀을 다쳤어요 하 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 전송. 1000 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심
    2. 얼음 차가운 PBS의 10 mL에 resuspending 및 4 ° c.에 3 분 1000 x g에서 centrifuging 셀 2 회 세척 PBS 솔루션 발음
      참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 셀 펠 릿 액체 질소에서 냉동 고 최대 1 개월 ˗80 ° C에 저장 하 여.
    3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 셀 펠 릿을 전송 하 고 얼음에 30 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL에서 품 어. 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 전체 세포 lysate 이다입니다.
      참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 몇 개월-20 ° C에서 샘플을 저장 하 여.
    4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 Bradford 분석 실험 단백질 농도 측정. 4 x 3 µ g / µ L 샘플의 20 µ L를 준비 하 여 10 분 동안 실내 온도에 품 어 SDD-나이 로딩 버퍼를 추가 합니다.

2. 준비 하 고 실행 하는 젤

  1. Agarose의 2 세대 유리 비 커에 녹기는 agarose는 전자 레인지에 열 1 x 트리 아세테이트 버퍼 (태)의 200 mL를 추가 합니다. 0.1 %SDS 최종 농도 20 %SDS 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 혼합 소용돌이 친다. SDS 추가 후 거품을 생성할 수 없는 주의.
  2. 15 cm x 14 cm 젤 슬 래 브에 agarose 솔루션을 부 어. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 거품을 제거. 상단에서 한 20-잘 빗을 배치 합니다.
  3. 첫 번째 치수: 피펫으로 60 µ g 전체 세포 lysate 맨 오른쪽 차선에서의. 실행 젤 60 V 약 4 h (염료 앞은 젤을 통해 서 약 ¾) 실행 버퍼 0.1 %SDS 포함 하는 태를 사용 하 여.
  4. 두 번째 치수: 신중 하 게 회전 젤 90도 시계 반대 방향으로 (그림 2A). 60 V 약 4 h에서 젤을 실행 합니다.
    참고: 일반 실행 조건은 4 V/cm 젤 길이입니다. 실행 조건에 정확히 같은 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 중요 하다.

3입니다. 전송

  1. 모 세관 전송 메서드를 사용 하 여 (그림 2B) polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송.
    1. 추가 전송 버퍼의 500 mL를 약 20 cm x 20 cm 컨테이너. 종이 수건 컨테이너 옆의 5 cm 높은 스택을 확인 합니다. 스택 맨의 표면적은 젤 크기 보다 커야 합니다.
    2. 전송 버퍼에 14 cm x 15 cm 필터 종이 담근 다 고 종이 수건 스택 맨 위에 배치 합니다. 주름이 나 거품 없이 종이 주의 하십시오. 필터 종이의 또 다른 조각으로 반복 합니다.
    3. 30 대 한 메탄올에 14 cm x 15 cm PVDF 막 활성화 s 다음 롤러를 사용 하 여 모든 거품을 제거 하도록 필터 종이에 레이어. 전송 버퍼와 젤을 씻어 하 고 다시 모든 거품을 압 막 위에 레이어.
    4. 전송 버퍼의 컨테이너를 플라스틱 랩과 함께 가장 가까운 종이 수건의 가장자리를 커버. 그것은 중요 한 다음 단계에서 건설 종이 다리 종이 타월 스택와 직접 접촉으로 오지 않는다입니다.
    5. 전송 버퍼에 15 cm x 35 cm 필터 종이 담근 다 고 그래서 한쪽 젤 상단 커버 하 고 다른 쪽 끝은 전송 버퍼의 컨테이너에 그것을 배치. 다른 다리와 함께 반복 합니다.
    6. 플라스틱 포장을 가진 컨테이너를 커버 하 고 실 온에서 하룻밤 둡니다.

4입니다. 서 부 럽 탐지

  1. 0.05% 포함 된 PBS의 50 mL와 함께 막 씻어 20 cm × 20 cm 컨테이너에 트윈-20 (PBST). PBST에 5% 우유의 20 mL를 추가 합니다. 차단에 30 분 동안 실내 온도에 바위.
  2. PBST에 5% 우유의 20 mL에 토끼 안티-MLKL 항 체의 10 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 로커에 품 어
  3. 5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.
  4. PBST에 5% 우유의 20 ml 안티 rabbit-HRP의 4 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 로커에 품 어.
  5. 5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.
  6. 향상 된 화학 기판 (ECL)를 추가 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 x 선 필름에 노출.

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결과

Necroptosis 유도 후 RIPK1 및 RIPK3 거의 동일한 아 밀 로이드 같은 패턴 (2, 4, 그림 1차선)을 보여주었다. 그러나, MLKL 섬유는 더 이질적인 되었고 RIPK1/RIPK3 섬유 (레인 6, 그림 1) 보다 작은 것 같았다. 그는 RIPK1/RIPK3-독립적인 섬유를 형성 하는 MLKL 또는 MLKL 단순히 SDD 시대 큰 RIPK1/RIPK3/MLKL 섬유에서 분리 가능성을 해결 하기 위해 2D SDD-나이 기법을 개발 하 라는 메시지가 나타납니다.

전기 및 전송 절차의 일반적인 회로도 그림 2에 표시 됩니다. 그림 3

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토론

2D SDD-나이의 가장 중요 한 점은 전기 조건 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 동일 하다는 것. 날카로운 대각선 45 ° (분리 또는 저하 발생 했음을 나타내는) 모두 동안 동일한 방식으로 마이그레이션 하는 섬유에 따라 검색할 수 electrophoreses. 예 전압 또는 실행된 시간을 변경 하는 다른 조건을 사용 하 여 이러한 결과 모호한 것 이다. 또한, 전통적인 1 D에 대 한 경우 처럼 SDD-나이, 샘플을 끓는 피해 야 한다로이 아 밀 로이드와 같은 아 밀 로이드 섬유를 방해 합니다. 모든 전송에 대 한 경우 처럼, 필터 종이, 막, 및 젤의 레이어 사이 거품을 피하기 위해 배려를 취해야 한다. 마지막으로, 전송 단계에서 그것은 중요 한 다리 다와 종이 타월 스택을 직접 연락 하지 않습니다. 이 방지 하기 위해 신뢰할 수 있는 방법은 종이 수건의 가장자리를 커버 플라스틱 랩의 작은 조각을 사용 하는 것입니다.

프로토콜 (60 V 4 h)에 제공 된 실행 조건은 ...

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공개 사항

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 대 한 친교에 의해 지원 상훈-. NIH/NCATS (TL1TR001104)에서 웰 치 재단 (I-1827), 부여 고 R01 부여 NIGMS (RGM120502A)에서 Z.W. Z.W. 의료 연구 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 학자 (R1222) 버지니아 머치 슨 Linthicum 학자 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
젤 전기 이동법 단위FisherHE99XPRO젤 달리기를 위한 appratus.
아그로스VWR97062-250아가로스 젤용.
종이 타워Fisher19-120-2484용
여과지VWR21427-386
PVDF 멤브레인Bio-Rad162-0177
전송 차단 분유Bio-Rad1706404XTU웨스턴 블롯
MLKL 항체GenetexGTX107538토끼 안티 MLKL 항체
RIPK1 항체BD Biosciences610459마우스 anti-RIPK1 항체 RIPK3
Xiaodong WangRIPK3 항체토끼 anti-RIPK3. 참조 11.
안티 래빗 HRP시그마A61542 차 항체
ECL피셔WBKLS0500웨스턴 화학 발광 HRP 기판
X 선 필름피셔F-BX810웨스턴 블롯 결과
DMEM시그마D6429세포 배양
태아 소 혈청시그마F4135배양
세포 배양을 위한 페니실린-스트렙토마이신,시그마P4333
트립신 용액세포 배양을 위한시그마T4049
조직 배양을 위한 PBS배양을 위한시그마D8662
우리 실험실재조합 TNF. 참조 성구 11.
Xiaodong Wangsmac-mimetic로 necroptosis를 유도합니다. 참조 성구 11.
ZVAD-FMKApexBioA1902부사 유발용. 참조 성구 11.
세포 계수기Bio-Rad1450102모델 TC20; 세포
피어싱 &트레이드 계수용; 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하기 위한Thermo Scientific23225
접시에서 세포를 제거하기 위한Cell lifterFisher07-200-364
용해 완충액(1 L)20 mL 1 M Tris pH 7.4
10 mL glycerol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2O
10 mL Triton-X100
(프로테아제 및 인산염 억제제 원하는대)
10X TAE (1 L)48.4 g 트리스 염기
11.42 mL 빙하 아세트산
20 mL 0.5M EDTA pH 8
ddH 2< / sub>0 to 1 L
4X SDD-AGE 로딩 버퍼 (50 mL)5 mL 10X TAE
10 mL 글리세롤 < br / > 4 mL 20 % SDS
0.5 mL 10 % 브로 모페놀 블루 < / > 31 mL ddH2O
TBS 전송 버퍼(1 L)20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST 세척 버퍼(1 L)100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L)800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4· 2H2O
24 g KH2PO4
10 L에 ddH2O 추가
전송 전송 항체 박사의 선물 세포 , , , , 세포 , 괴사 유도를 위해 에서 만든 세포 배양 박사의 선물BCA 단백질 분석 키트

참고문헌

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

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