Name: 2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 2차원 반변성 아가로즈 겔 전기영동법을 사용하여 아밀로이드 유사 섬유의 크기 이질성을 확인하는 방법입니다. HT-29 대장암 세포를 이용하여 섬유 분해 없이 정확한 크기 분석이 가능합니다.

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이 작품은 대 한 친교에 의해 지원 상훈-. NIH/NCATS (TL1TR001104)에서 웰 치 재단 (I-1827), 부여 고 R01 부여 NIGMS (RGM120502A)에서 Z.W. Z.W. 의료 연구 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 학자 (R1222) 버지니아 머치 슨 Linthicum 학자 이다.

1. 샘플 준비
<ol><li>문화 2 x 106 아 밀 로이드 10 ml의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 스-10cm 조직 문화 접시에 HT-29 결 장 암 세포를 생산. 문화 셀 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.<ol>
<li>세포가 80 %confluency, 성장 후 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL로 세포 세척. 트립 신 솔루션의 3 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>셀 접시에서 완전히 끊 후, 문화 매체의 10 mL을 추가 하 고 10 mL 피 펫 셀 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온에서 3 분 1000 x g에서 셀 원심 매체를 발음, resuspend 문화 매체의 5 mL에 셀과 셀 카운터를 사용 하 여 셀. 두 10 cm의 각 플레이트 2 x 106 셀.</li>
		<li>준수 하 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 복구를 셀 수 있습니다. 한 접시 20 ng/mL 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 100 nM Smac 모방 및 20 µ M 팬 caspase 억제제 Z-VAD-FMK11와 amyloids의 형성을 유도 하에 치료를 적용 됩니다. 조합으로 TSZ 약식 이다. 제어로 차량 다른 요리를 취급 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 길이의 시간 후 보통 6 h 세포 lysate 수확.<ol>
<li>플라스틱 스 크레이 퍼로 접시에서 셀을 다쳤어요 하 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 전송. 1000 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심</li>
		<li>얼음 차가운 PBS의 10 mL에 resuspending 및 4 ° c.에 3 분 1000 x g에서 centrifuging 셀 2 회 세척 PBS 솔루션 발음 참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 셀 펠 릿 액체 질소에서 냉동 고 최대 1 개월 ˗80 ° C에 저장 하 여.</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 셀 펠 릿을 전송 하 고 얼음에 30 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL에서 품 어. 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 전체 세포 lysate 이다입니다. 참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 몇 개월-20 ° C에서 샘플을 저장 하 여.</li>
		<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 Bradford 분석 실험 단백질 농도 측정. 4 x 3 µ g / µ L 샘플의 20 µ L를 준비 하 여 10 분 동안 실내 온도에 품 어 SDD-나이 로딩 버퍼를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 하 고 실행 하는 젤
<ol><li>Agarose의 2 세대 유리 비 커에 녹기는 agarose는 전자 레인지에 열 1 x 트리 아세테이트 버퍼 (태)의 200 mL를 추가 합니다. 0.1 %SDS 최종 농도 20 %SDS 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 혼합 소용돌이 친다. SDS 추가 후 거품을 생성할 수 없는 주의.</li>
	<li>15 cm x 14 cm 젤 슬 래 브에 agarose 솔루션을 부 어. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 거품을 제거. 상단에서 한 20-잘 빗을 배치 합니다.</li>
	<li>첫 번째 치수: 피펫으로 60 µ g 전체 세포 lysate 맨 오른쪽 차선에서의. 실행 젤 60 V 약 4 h (염료 앞은 젤을 통해 서 약 ¾) 실행 버퍼 0.1 %SDS 포함 하는 태를 사용 하 여.</li>
	<li>두 번째 치수: 신중 하 게 회전 젤 90도 시계 반대 방향으로 (그림 2A). 60 V 약 4 h에서 젤을 실행 합니다. 참고: 일반 실행 조건은 4 V/cm 젤 길이입니다. 실행 조건에 정확히 같은 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 중요 하다.</li>
</ol>3입니다. 전송
<ol><li>모 세관 전송 메서드를 사용 하 여 (그림 2B) polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송.<ol>
<li>추가 전송 버퍼의 500 mL를 약 20 cm x 20 cm 컨테이너. 종이 수건 컨테이너 옆의 5 cm 높은 스택을 확인 합니다. 스택 맨의 표면적은 젤 크기 보다 커야 합니다.</li>
		<li>전송 버퍼에 14 cm x 15 cm 필터 종이 담근 다 고 종이 수건 스택 맨 위에 배치 합니다. 주름이 나 거품 없이 종이 주의 하십시오. 필터 종이의 또 다른 조각으로 반복 합니다.</li>
		<li>30 대 한 메탄올에 14 cm x 15 cm PVDF 막 활성화 s 다음 롤러를 사용 하 여 모든 거품을 제거 하도록 필터 종이에 레이어. 전송 버퍼와 젤을 씻어 하 고 다시 모든 거품을 압 막 위에 레이어.</li>
		<li>전송 버퍼의 컨테이너를 플라스틱 랩과 함께 가장 가까운 종이 수건의 가장자리를 커버. 그것은 중요 한 다음 단계에서 건설 종이 다리 종이 타월 스택와 직접 접촉으로 오지 않는다입니다.</li>
		<li>전송 버퍼에 15 cm x 35 cm 필터 종이 담근 다 고 그래서 한쪽 젤 상단 커버 하 고 다른 쪽 끝은 전송 버퍼의 컨테이너에 그것을 배치. 다른 다리와 함께 반복 합니다.</li>
		<li>플라스틱 포장을 가진 컨테이너를 커버 하 고 실 온에서 하룻밤 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 서 부 럽 탐지
<ol><li>0.05% 포함 된 PBS의 50 mL와 함께 막 씻어 20 cm × 20 cm 컨테이너에 트윈-20 (PBST). PBST에 5% 우유의 20 mL를 추가 합니다. 차단에 30 분 동안 실내 온도에 바위.</li>
	<li>PBST에 5% 우유의 20 mL에 토끼 안티-MLKL 항 체의 10 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 로커에 품 어</li>
	<li>5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.</li>
	<li>PBST에 5% 우유의 20 ml 안티 rabbit-HRP의 4 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 로커에 품 어.</li>
	<li>5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.</li>
	<li>향상 된 화학 기판 (ECL)를 추가 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 x 선 필름에 노출.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

2D SDD-나이의 가장 중요 한 점은 전기 조건 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 동일 하다는 것. 날카로운 대각선 45 ° (분리 또는 저하 발생 했음을 나타내는) 모두 동안 동일한 방식으로 마이그레이션 하는 섬유에 따라 검색할 수 electrophoreses. 예 전압 또는 실행된 시간을 변경 하는 다른 조건을 사용 하 여 이러한 결과 모호한 것 이다. 또한, 전통적인 1 D에 대 한 경우 처럼 SDD-나이, 샘플을 끓는 피해 야 한다로이 아 밀 로이드와 같은 아 밀 로이드 섬유를 방해 합니다. 모든 전송에 대 한 경우 처럼, 필터 종이, 막, 및 젤의 레이어 사이 거품을 피하기 위해 배려를 취해야 한다. 마지막으로, 전송 단계에서 그것은 중요 한 다리 다와 종이 타월 스택을 직접 연락 하지 않습니다. 이 방지 하기 위해 신뢰할 수 있는 방법은 종이 수건의 가장자리를 커버 플라스틱 랩의 작은 조각을 사용 하는 것입니다.
프로토콜 (60 V 4 h)에 제공 된 실행 조건은 ...

단백질 misfolding로 인해 녹말 체 섬유의 형성이 오래 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병1pathologic 상태에 역할을 알려져 있다. 더 최근에, 녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유의 형성 안티 바이러스 타고 난 면역 반응2 와 necroptosis3,4, 동안 포함 한 인간, 그리고 낮은 유기 체 신호 통로의 일부가 될 표시 되었습니다. 효 모5,6등. 따라서, 실험실에서 이러한 섬유를 감지 하는 능력은 중요 합니다. 현재, 아 밀 로이드 및 아 밀 로이드 같은 섬유 감지 하 세 가지 주요 방법이 있다: 염료, EM, SDD-나이의 사용.
콩고 빨강 또는 Thioflavin T 같은 염료를 사용 하 여 신속 하 고 쉽게 현미경 검사 법 또는 분광학7를 사용 하 여 감지 되는 장점을 제공 합니다. 그러나, 현미경 검사 법, 콩고 빨강의 경우에 의해 탐지 아무 특이성을 대 한 단백질 구성 섬유 또는 섬유의 크기를 제공 합니다. 마찬가지로, 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 바인딩 단백질 복합물을 검출 하는 분광학의 사용만 긍정적 이거나 부정적인 결과를 제공 합니다.
그들의 섬유와 섬유 길이 직경8에 대 한 정량적 인 정보 존재의 결정적인 증거를 제공합니다. 그러나,이 방법은 매우 엄격한 정화를 요구 한다. 또한, 그들은 비싼 장비를 사용 하 여 전문된 기술.
SDD-나이 SDS 저항 메가 돌턴 단백질 복합물 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유를 포함 하 여 검색 사용 되었습니다. 그것은 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 그것은 섬유의 정화를 요구 하지 않는다 고 수행9쉽습니다. 둘째, 그것은 상대적인 크기와 양의 섬유 heterogenicity 포함 하 여 섬유의 크기에 대 한 질적 정보를 제공 합니다. 마지막으로, 서 부 럽 전기 이동 법 후 수행할 수 있습니다, 때문에 그것은 비록 그 SDD 연령 반 변성 때문에 일부 epitopes 남아 있을 수 있습니다 은폐를 주목 해야 한다는 어떤 단백질의 항 체은 존재를 검출 하기 쉽다 항 체에 의해 감지를 복잡.
최근, 수용 체 상호 작용 단백질 키 니 아 제 1 (RIPK1) 및 3 (RIPK3) 플랫폼 necroptosis, 괴 사3의 프로그램된 형태 중 신호 역할을 양식 녹말 체 섬유에 보고 되었습니다. 이러한 섬유, 공부 하는 동안 우리의 실험실 아 밀 로이드 같은 섬유4을 형성 하는 또 다른 necroptosis 관련 된 단백질, 혼합 계보 니 도메인 같은 (MLKL), 보였다. 그러나, 검사 SDD-나이, MLKL 섬유의 크기 (그림 1) 서로 동일한 등장 RIPK1 및 RIPK3 섬유에서 등장. 그것은 잘 알려진 MLKL necroptosis 신호 복잡 한 necrosome10라는 형태로 RIPK1/RIPK3에 바인딩합니다 때문에 이것은 예상 이었다.
적어도 2 개의 설명이 있다. 먼저, 두 개의 완전히 다른 아 밀 로이드 같은 섬유 necroptosis, 포함 한 RIPK1/RIPK3 및 다른 포함 MLKL 동안 형성할 수 있습니다. 둘째, 아 밀 로이드 같은 섬유 포함 RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis, 하지만 다른 단백질 MLKL의 협회 동안 형성 될 수 있습니다만 한 가지 유형의 SDD 시대 dissociates 충분히 약한입니다.
이 해결 하기 위해 수행 하는 2 차원 (2D) SDD-나이 제안 한다. SDD-나이-안정 아 밀 로이드 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 첫 번째와 두 번째 차원 전기 이동 법 동안 동일한 마이그레이션 패턴을 갖습니다. 이것 막 단백질을 전송 하 고 서쪽 오 점 후 감지 될 것입니다. 안정적인 섬유 날카로운 대각선 패턴을 전시할 것 이다. 이에서 어떤 편차 섬유 SDS 전기 영동으로 변화 받아야 좋을 것.

<table><tbody><tr><td>젤 전기 이동법 단위</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>젤 달리기를 위한 appratus.</td></tr><tr><td>아그로스</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>아가로스 젤용.</td></tr><tr><td>종이 타워</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td> 전송 <td>용</td></tr><tr><td>여과지</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td> 전송 <td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>전송 차단 분유</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>MLKL 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>토끼 안티 MLKL 항체</td></tr><tr><td>RIPK1 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>마우스 anti-RIPK1 항체 RIPK3</td></tr><tr>항체 <td>Xiaodong Wang</td><td></td> 박사의<td>RIPK3 항체</td> 선물 <td>토끼 anti-RIPK3. 참조 11.</td></tr><tr><td>안티 래빗 HRP</td><td>시그마</td><td>A6154</td><td>2 차 항체</td></tr><tr><td>ECL</td><td>피셔</td><td>WBKLS0500</td><td>웨스턴 화학 발광 HRP 기판</td></tr><tr><td>X 선 필름</td><td>피셔</td><td>F-BX810</td><td>웨스턴 블롯 결과</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마</td><td>D6429</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>시그마</td><td>F4135</td> 세포 <td>배양</td></tr><tr><td>세포 배양을 위한 페니실린-스트렙토마이신,</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr>, <tr><td>트립신 용액</td>, <td>세포 배양을 위한</td><td>시그마</td><td>T4049</td></tr>, <tr><td>조직 배양을 위한 PBS</td>, 세포 <td>배양을 위한</td><td>시그마</td><td>D8662</td></tr>, <tr>괴사 유도를 위해 <td>우리 실험실</td><td></td>에서 만든 세포 배양<td>재조합 TNF</td><td>. 참조 성구 11.</td></tr><tr><td>Xiaodong Wang</td><td></td> 박사의 <td>smac-mimetic</td> 선물<td>로 necroptosis를 유도합니다. 참조 성구 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>부사 유발용. 참조 성구 11.</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>모델 TC20; 세포</td></tr><tr><td>피어싱 &트레이드 계수용; </td><td>세포 용해물의 단백질 농도를 측정하기 위한</td>BCA 단백질 분석 키트 <td>Thermo Scientific</td><td>23225</td></tr><tr><td>접시에서 세포를 제거하기 위한</td><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td></tr><tr><td>용해 완충액(1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (프로테아제 및 인산염 억제제 원하는대)</td></tr> <tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td> <td>48.4 g 트리스 염기 11.42 mL 빙하 아세트산 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH 20 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE 로딩 버퍼 (50 mL)</td><td></td><td></td> <td>5 mL 10X TAE 10 mL 글리세롤 4 mL 20 % SDS 0.5 mL 10 % 브로 모페놀 블루 < / > 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>TBS 전송 버퍼(1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>PBST 세척 버퍼(1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 10 L에 ddH2O 추가</td></tr></tbody></table>

2 차원 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 많은 인간 질병과 관련 된 되었습니다 그리고 지금 많은 신호 경로 대 한 중요 한 발견 되 고 있습니다. 쉽게 다양 한 실험 조건에서 이러한 섬유의 형성을 감지 하는 능력은 그들의 잠재적인 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 많은 방법이 섬유 검출에 사용 된 있지만 몇 가지 단점이 없이. 예를 들어 전자 현미경 (EM), 또는 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 종종 얼룩이 섬유의 정화를 요구 한다. 다른 한편으로, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) 정화 없이 셀 추출 물에 SDS 저항 아 밀 로이드 같은 섬유의 탐지를 허용 한다. 또한, 섬유의 크기 차이의 비교 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 서쪽 blotting에 의해 섬유 내의 특정 단백질을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 시간이 덜 소모 되 고 실험실의 넓은 수에 더 쉽게 액세스할 수입니다. SDD-나이 결과 종종 변수 정도의 표시 됩니다. SDS의 전기 이동 법 동안 복잡 한 단백질의 분리에서 결과이 부분의 여부를 문제를 발생 시킵니다. 이러한 이유로, 우리 SDD-연령 인지 확인 하려면 SDD 시대에 본 크기가 진정으로 섬유가 생체 내에서 의 결과 하지 저하 또는 일부 중 단백질의 분리의 결과의 두 번째 차원 고용 전기 이동 법입니다. 이 메서드는 빠른, 질적 확인을 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유는 SDD-나이 과정에서 부분적으로 해리 하지 않을 수 있습니다.

Necroptosis 유도 후 RIPK1 및 RIPK3 거의 동일한 아 밀 로이드 같은 패턴 (2, 4, 그림 1차선)을 보여주었다. 그러나, MLKL 섬유는 더 이질적인 되었고 RIPK1/RIPK3 섬유 (레인 6, 그림 1) 보다 작은 것 같았다. 그는 RIPK1/RIPK3-독립적인 섬유를 형성 하는 MLKL 또는 MLKL 단순히 SDD 시대 큰 RIPK1/RIPK3/MLKL 섬유에서 분리 가능성을 해결 하기 위해 2D SDD-나이 기법을 개발 하 라는 메시지가 나타납니다.
전기 및 전송 절차의 일반적인 회로도 그림 2에 표시 됩니다. 그림 3</s...

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

이 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동의 전반적인 목표는 기존 SDD-AGE에서 볼 수 있는 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 크기 이질성을 확인하는 것입니다. 이 방법은 기존 SDD-AGE에서 볼 수 있는 크기 이질성이 생체 내 섬유의 고유 상태인지 또는 겔 전기영동 중 단백질 분해 또는 해리의 결과인지 여부와 같은 아밀로이드 또는 단백질 응집 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비 없이 실험실에서 쉽게 수행할 수 있다는 것입니다.기존 SDD-AGE에서 사용되는 것 외에 추가 장비가 필요하지 않습니다. 먼저 아밀로이드를 생산하는 HT-29 대장암 세포를 10cm 조직 배양 접시에 파종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.세포가 80% 포화도에 도달하면 인산염 완충 식염수를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포에 트립신 3ml를 넣고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 세포가 배양 접시에서 분리된 후 플레이트에 10ml의 배양 배지를 추가합니다.그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 1, 000회 g으로 원심분리한다. 원심분리 후, 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 5ml의 배양 배지에 재현탁합니다.셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 그런 다음 두 개의 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 그대로 두십시오. 다음으로, TSZ 시약을 처리로 배양 접시 중 하나에 추가합니다.약 6시간 후 플라스틱 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 3 분 동안 1, 000 번 g로 원심 분리하십시오. 그런 다음 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포 펠릿을 두 번 세척하고 원심분리 과정을 반복합니다.다음으로, PBS 용액을 흡입하고 세포 펠릿을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 펠릿에 0.3ml의 용해 완충액을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 다시, 20, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 분리기.얻어진 상등액은 전체 세포 용해물입니다. 상층액에 4X SDD-AGE 버퍼를 추가하여 샘플 마이크로리터당 3마이크로그램 20마이크로리터를 준비합니다. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다.젤을 준비하려면 유리 비커에 200ml의 TAE 완충액에 아가로스 가루 2g을 추가합니다. 그런 다음 비커를 전자레인지에 가열하여 아가로스를 녹입니다. 다음으로 20%SDS 1ml를 최종 농도 0.1%에 첨가하고 비커를 부드럽게 휘젓습니다.다음으로, 15x14cm 젤 슬래브에 액체 아가로스를 붓습니다. 기포를 제거하려면 1ml 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 젤 위에 20웰 빗을 놓습니다.다음으로, 겔의 맨 오른쪽 레인에 약 60마이크로그램의 전체 세포 용해물을 추가합니다. 0.1%SDS를 함유한 TAE 버퍼를 러닝 버퍼로 사용하여 60볼트에서 약 4시간 동안 젤을 실행합니다. 젤을 2차원으로 작동시키려면 젤을 시계 반대 방향으로 조심스럽게 90도 회전합니다.그런 다음 젤을 60볼트에서 약 4시간 동안 작동시킵니다. 20 x 20cm 용기에 500ml의 전송 버퍼를 추가합니다. 용기 바로 옆에 5cm 높이의 종이 타월 더미를 준비합니다.그런 다음 각각 14 x 15cm 크기의 여과지 두 개를 전사 버퍼에 담그고 종이 타월 스택 위에 놓습니다. 메탄올의 14 x 15cm PVDF 멤브레인을 30초 동안 활성화합니다. 활성화 후 멤브레인을 여과지 위에 놓고 롤러를 사용하여 모든 기포를 제거합니다.전달의 가장 중요한 부분은 겔과 멤브레인 사이에 기포가 형성되지 않도록 하는 것입니다. 전사 완충액으로 겔을 헹구고 멤브레인 위에 겹겹이 쌓습니다. 형성된 거품을 굴립니다.다음으로, 플라스틱 랩을 사용하여 전송 버퍼 용기에 가장 가까운 종이 타월의 가장자리를 덮습니다. 그런 다음 15 x 35cm 크기의 여과지 조각을 전송 버퍼에 담그십시오. 한쪽 끝이 겔 상단을 덮고 다른 쪽 끝이 전사 버퍼 용기에 있도록 여과지를 놓습니다.용기를 비닐 랩으로 덮고 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오. 다음 날, 20x20cm 용기에 50ml의 PBST로 멤브레인을 헹굽니다. 다음으로, 멤브레인의 PBST에 20ml의 5% 우유를 추가합니다.그런 다음 로커의 멤브레인을 실온에서 30분 동안 차단하도록 두십시오. 10마이크로리터의 토끼 항-MLKL 항체를 PBST의 5% 우유 20밀리리터에 피펫팅합니다. 그런 다음 멤브레인에 항체 혼합물을 추가합니다.로커에서 밤새 섭씨 4도에서 멤브레인을 배양합니다. 그런 다음 20ml의 PBST로 멤브레인을 5분 동안 세척합니다. 이 세척은 5 번 반복됩니다.다음으로, 4마이크로리터의 항토끼-HRP 항체를 PBST에 함유된 5% 우유 20ml에 피펫팅합니다. 멤브레인에 항체를 추가합니다. 로커에 멤브레인이 있는 용기를 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오.2시간 후, PBST 20ml에 멤브레인을 5회씩 5회씩 세척합니다. 마지막으로, 멤브레인에 향상된 화학발광 기질을 추가합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 멤브레인을 X선 필름에 노출시킵니다.이 연구는 종양 괴사 인자 알파 처리된 세포에서 얻은 전체 세포 용해물에서 SDS 내성 아밀로이드 유사 섬유의 존재를 입증하기 위해 수행됩니다. 여기에서 RIPK1과 RIPK3가 유사한 동일한 아밀로이드 유사 패턴을 보인다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도 MLKL 섬유는 다른 섬유와 다른 이동 패턴을 가진 이질적인 것처럼 보입니다.이 이미지는 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 가능한 이동 패턴을 보여줍니다. 1차원 SDD-AGE에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유는 특징적인 도말 현상을 보입니다. 이 이미지에서 섬유는 두 번째 실행에서 동일하게 이동하고 45도에서 멤브레인에서 대각선 이동 패턴을 나타냅니다.이것은 섬유가 겔 실행 과정에서 분해 또는 해리를 겪지 않는다는 것을 보여줍니다. 반대로, 섬유가 해리되면 대각선 아래에 수직 줄무늬가 있는데, 이는 두 번째 전기영동 동안 더 작은 섬유의 더 빠른 이동을 나타냅니다. 이 1차원 및 2차원 SDD-AGE는 모두 MLKL 섬유가 SDD-AGE 프로세스 중에 해리되지 않으며 실제로 RIPK1 및 RIPK3 섬유와 구별됨을 보여줍니다.이 이미지에서 MLKL 섬유는 1차원에서 특징적인 번짐을 보여줍니다. 그러나 동일한 섬유는 2차원 SDD-AGE에서 수직 줄무늬가 없는 날카로운 대각선을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때 전압 및 런 길이와 같은 모든 조건이 1차원과 2차원 사이에서 동일하게 유지되어 45도 각도에서 날카로운 선을 보장한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 멤브레인을 벗기고 다른 항체로 다시 프로빙하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 섬유에 다른 단백질이 포함되어 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기존 SDD-AGE 동안 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 분해 또는 해리가 발생하지 않는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

SDD - 나이가 세포에서 고분자와 같은 아밀로이드의 감지 및 특성화를위한 유용한 기법입니다. 여기 우리는 대규모 응용 프로그램에이 기술을 의무하게 적응을 보여줍니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

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폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 마우스 폐 조직에서 분리된 다양한 사슬 길이의 헤파란 황산염을 검출하는 분석 기법

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2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동: 크기 이질성에 따라 다형성 아밀로이드 섬유를 분리하는 기술

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

이 논문은 비변성 PAGE와 웨스턴 블롯 분석의 조합을 사용하여 인간 세포의 용해물에서 다이나민 유사 GTPase MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜에 대해 설명합니다.

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프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.

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네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

배우세요 2차원 반변성 아가로즈 겔 전기영동법을 사용하여 아밀로이드 유사 섬유의 크기 이질성을 확인하는 방법입니다. HT-29 대장암 세포를 이용하여 섬유 분해 없이 정확한 크기 분석이 가능합니다.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

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