2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

이 2차원 반변성 세제 아가로스 젤 전기영동의 전반적인 목표는 기존 SDD-AGE에서 볼 수 있는 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 크기 이질성을 확인하는 것입니다. 이 방법은 기존 SDD-AGE에서 볼 수 있는 크기 이질성이 생체 내 섬유의 고유 상태인지 또는 겔 전기영동 중 단백질 분해 또는 해리의 결과인지 여부와 같은 아밀로이드 또는 단백질 응집 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비 없이 실험실에서 쉽게 수행할 수 있다는 것입니다.

기존 SDD-AGE에서 사용되는 것 외에 추가 장비가 필요하지 않습니다. 먼저 아밀로이드를 생산하는 HT-29 대장암 세포를 10cm 조직 배양 접시에 파종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.

세포가 80% 포화도에 도달하면 인산염 완충 식염수를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포에 트립신 3ml를 넣고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 세포가 배양 접시에서 분리된 후 플레이트에 10ml의 배양 배지를 추가합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 1, 000회 g으로 원심분리한다. 원심분리 후, 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 5ml의 배양 배지에 재현탁합니다.

셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 그런 다음 두 개의 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 그대로 두십시오. 다음으로, TSZ 시약을 처리로 배양 접시 중 하나에 추가합니다.

약 6시간 후 플라스틱 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 3 분 동안 1, 000 번 g로 원심 분리하십시오. 그런 다음 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포 펠릿을 두 번 세척하고 원심분리 과정을 반복합니다.

다음으로, PBS 용액을 흡입하고 세포 펠릿을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 펠릿에 0.3ml의 용해 완충액을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 다시, 20, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 분리기.

얻어진 상등액은 전체 세포 용해물입니다. 상층액에 4X SDD-AGE 버퍼를 추가하여 샘플 마이크로리터당 3마이크로그램 20마이크로리터를 준비합니다. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

젤을 준비하려면 유리 비커에 200ml의 TAE 완충액에 아가로스 가루 2g을 추가합니다. 그런 다음 비커를 전자레인지에 가열하여 아가로스를 녹입니다. 다음으로 20%SDS 1ml를 최종 농도 0.1%에 첨가하고 비커를 부드럽게 휘젓습니다.

다음으로, 15x14cm 젤 슬래브에 액체 아가로스를 붓습니다. 기포를 제거하려면 1ml 피펫을 사용하십시오. 그런 다음 젤 위에 20웰 빗을 놓습니다.

다음으로, 겔의 맨 오른쪽 레인에 약 60마이크로그램의 전체 세포 용해물을 추가합니다. 0.1%SDS를 함유한 TAE 버퍼를 러닝 버퍼로 사용하여 60볼트에서 약 4시간 동안 젤을 실행합니다. 젤을 2차원으로 작동시키려면 젤을 시계 반대 방향으로 조심스럽게 90도 회전합니다.

그런 다음 젤을 60볼트에서 약 4시간 동안 작동시킵니다. 20 x 20cm 용기에 500ml의 전송 버퍼를 추가합니다. 용기 바로 옆에 5cm 높이의 종이 타월 더미를 준비합니다.

그런 다음 각각 14 x 15cm 크기의 여과지 두 개를 전사 버퍼에 담그고 종이 타월 스택 위에 놓습니다. 메탄올의 14 x 15cm PVDF 멤브레인을 30초 동안 활성화합니다. 활성화 후 멤브레인을 여과지 위에 놓고 롤러를 사용하여 모든 기포를 제거합니다.

전달의 가장 중요한 부분은 겔과 멤브레인 사이에 기포가 형성되지 않도록 하는 것입니다. 전사 완충액으로 겔을 헹구고 멤브레인 위에 겹겹이 쌓습니다. 형성된 거품을 굴립니다.

다음으로, 플라스틱 랩을 사용하여 전송 버퍼 용기에 가장 가까운 종이 타월의 가장자리를 덮습니다. 그런 다음 15 x 35cm 크기의 여과지 조각을 전송 버퍼에 담그십시오. 한쪽 끝이 겔 상단을 덮고 다른 쪽 끝이 전사 버퍼 용기에 있도록 여과지를 놓습니다.

용기를 비닐 랩으로 덮고 실온에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오. 다음 날, 20x20cm 용기에 50ml의 PBST로 멤브레인을 헹굽니다. 다음으로, 멤브레인의 PBST에 20ml의 5% 우유를 추가합니다.

그런 다음 로커의 멤브레인을 실온에서 30분 동안 차단하도록 두십시오. 10마이크로리터의 토끼 항-MLKL 항체를 PBST의 5% 우유 20밀리리터에 피펫팅합니다. 그런 다음 멤브레인에 항체 혼합물을 추가합니다.

로커에서 밤새 섭씨 4도에서 멤브레인을 배양합니다. 그런 다음 20ml의 PBST로 멤브레인을 5분 동안 세척합니다. 이 세척은 5 번 반복됩니다.

다음으로, 4마이크로리터의 항토끼-HRP 항체를 PBST에 함유된 5% 우유 20ml에 피펫팅합니다. 멤브레인에 항체를 추가합니다. 로커에 멤브레인이 있는 용기를 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오.

2시간 후, PBST 20ml에 멤브레인을 5회씩 5회씩 세척합니다. 마지막으로, 멤브레인에 향상된 화학발광 기질을 추가합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 멤브레인을 X선 필름에 노출시킵니다.

이 연구는 종양 괴사 인자 알파 처리된 세포에서 얻은 전체 세포 용해물에서 SDS 내성 아밀로이드 유사 섬유의 존재를 입증하기 위해 수행됩니다. 여기에서 RIPK1과 RIPK3가 유사한 동일한 아밀로이드 유사 패턴을 보인다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도 MLKL 섬유는 다른 섬유와 다른 이동 패턴을 가진 이질적인 것처럼 보입니다.

이 이미지는 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 가능한 이동 패턴을 보여줍니다. 1차원 SDD-AGE에서 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유는 특징적인 도말 현상을 보입니다. 이 이미지에서 섬유는 두 번째 실행에서 동일하게 이동하고 45도에서 멤브레인에서 대각선 이동 패턴을 나타냅니다.

이것은 섬유가 겔 실행 과정에서 분해 또는 해리를 겪지 않는다는 것을 보여줍니다. 반대로, 섬유가 해리되면 대각선 아래에 수직 줄무늬가 있는데, 이는 두 번째 전기영동 동안 더 작은 섬유의 더 빠른 이동을 나타냅니다. 이 1차원 및 2차원 SDD-AGE는 모두 MLKL 섬유가 SDD-AGE 프로세스 중에 해리되지 않으며 실제로 RIPK1 및 RIPK3 섬유와 구별됨을 보여줍니다.

이 이미지에서 MLKL 섬유는 1차원에서 특징적인 번짐을 보여줍니다. 그러나 동일한 섬유는 2차원 SDD-AGE에서 수직 줄무늬가 없는 날카로운 대각선을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때 전압 및 런 길이와 같은 모든 조건이 1차원과 2차원 사이에서 동일하게 유지되어 45도 각도에서 날카로운 선을 보장한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 멤브레인을 벗기고 다른 항체로 다시 프로빙하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 섬유에 다른 단백질이 포함되어 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기존 SDD-AGE 동안 아밀로이드 또는 아밀로이드 유사 섬유의 분해 또는 해리가 발생하지 않는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.