Summary
在这里, 我们使用二维半变性琼脂糖凝胶电泳, 以确认存在的异质淀粉样纤维的异构大小, 并排除了大小异质性是由于淀粉样纤维在凝胶中离解的可能性运行过程。
Abstract
淀粉样蛋白或像淀粉样的纤维已经与许多人类疾病相关, 现在被发现对许多信号通路是重要的。在不同的实验条件下, 能够很容易地检测出这些纤维的形成, 对于了解它们的潜在功能是至关重要的。许多方法已被用来检测纤维, 但没有一些缺点。例如, 电子显微镜 (EM), 或染色与刚果红或 Thioflavin T 往往需要纯化的纤维。另一方面, 半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳 (SDD 年龄) 允许检测的 SDS 耐药淀粉样纤维在细胞提取物没有纯化。另外, 它允许比较纤维的大小区别。更重要的是, 它可以用来识别纤维内的特定蛋白质由西方印迹。它的耗时更少, 更容易被更多的实验室所访问。SDD 年龄的结果往往表现出不同程度的异质性。它提出了一个问题, 即非异质性的一部分是由蛋白质复合体在电泳过程中的分离而产生的。由于这个原因, 我们使用了 SDD 年龄的第二个维度来确定 SDD 年龄所看到的大小异质性是否真的是纤维异质性在体内的结果, 而不是由于某些蛋白质的降解或离解而导致电泳。这种方法可以快速、定性地确认淀粉样蛋白或淀粉样蛋白纤维在 SDD 年龄过程中没有部分游离。
Introduction
由于蛋白质错误折叠, 淀粉样纤维的形成早已被人们所熟知, 它在阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等病理状况中起到了1的作用.最近, 淀粉样蛋白或淀粉样纤维的形成已被证明是人类信号通路的一部分, 包括在抗病毒先天免疫应答中2和 necroptosis3,4, 和在较低的有机体如酵母5,6。因此, 在实验室中检测这些纤维的能力是很重要的。目前, 有三种主要的方法来检测淀粉样蛋白和淀粉样的纤维: 使用染料, EM 和 SDD 年龄。
使用染料, 如刚果红或 Thioflavin T, 提供了快速和容易检测使用显微镜或光谱学7的优势。然而, 在刚果红的情况下, 显微镜下的检测不提供任何蛋白质组成纤维或纤维大小的特异性。同样, 使用光谱学检测刚果红或 Thioflavin T 结合蛋白复合物只提供了积极或消极的结果。
EM 提供了有关纤维的存在的确凿证据, 以及关于光纤长度和直径8的定量信息。然而, 这种方法需要非常严格的净化。此外, EM 是一种专门的技术, 使用昂贵的设备。
SDD 年龄已被用来检测抗 SDS 的巨型道尔顿蛋白复合物, 包括淀粉样蛋白或淀粉样的纤维。它提供了许多优点。首先, 它不需要对纤维进行纯化, 并且很容易请执行 9.其次, 它提供了有关纤维大小的定性信息, 包括纤维 heterogenicity 的相对大小和数量。最后, 由于西方印迹可以在电泳后进行, 所以很容易检测出有抗体的任何蛋白质的存在, 虽然应该指出, 由于 SDD 年龄是半变性, 一些表位可能仍然隐蔽通过抗体使得检测复杂化。
最近, 据报道, 受体相互作用蛋白激酶 1 (RIPK1) 和 3 (RIPK3) 形成淀粉样纤维作为信号平台在 necroptosis 期间, 一个程序性的形式坏死3。在研究这些纤维时, 我们的实验室发现另一种 necroptosis 相关的蛋白质, 混合谱系激酶域样 (MLKL), 也形成淀粉样的纤维4。然而, 在 SDD 年龄的检查, MLKL 纤维的大小似乎有别于 RIPK1 和 RIPK3 纤维, 这似乎彼此相同 (图 1)。这是意外的, 因为众所周知, MLKL 绑定到 RIPK1/RIPK3, 形成称为 necrosome10的 necroptosis 信号复合体。
至少有两种解释。首先, 两个完全不同的淀粉样的纤维可能形成在 necroptosis, 一个含有 RIPK1/RIPK3 和其他含有 MLKL。其次, 在 necroptosis 期间, 只有一种含有 RIPK1/RIPK3/MLKL 的淀粉样纤维可以形成, 但 MLKL 与其他蛋白质的关联性较弱, 在 SDD 时代离解。
为了解决这个问题, 我们建议执行一个二维 (2D) SDD 年龄。在第一和第二维电泳中, SDD 稳定的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白纤维将具有相同的迁移模式。这将是可检测的, 将蛋白质转移到膜, 并进行了一个西方的印迹。稳定的纤维会呈现尖锐的对角线图案。任何偏离这一点将表明, 纤维发生变化, 由于 SDS 电泳。
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Protocol
1. 准备样品
- 培养 2 x 106淀粉样蛋白, 在10厘米组织培养皿中产生 HT-29 结肠癌细胞, 10 毫升的 Dulbecco 修饰鹰培养基 (DMEM) 含有10% 胎牛血清和青霉素-链霉素。培养细胞过夜在37°c 孵化器与 5% CO2。
- 细胞生长到80% 融合后, 用10毫升磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 冲洗细胞。加入3毫升胰蛋白酶溶液, 在37摄氏度孵育3分钟。
- 细胞完全脱离皿后, 加入10毫升培养基, 将10毫升吸管的细胞转移到15毫升圆锥管。在室温下将细胞以 1000 x g 为3分钟离心。吸入培养基, 并用重悬5毫升培养基中的细胞, 并用细胞计数器计数细胞。板 2 x 106单元格中每两个10厘米的菜肴。
- 允许细胞在一夜之间坚持和恢复在37°c 孵化器与 5% CO2。对一道菜进行治疗, 以诱导 20 amyloids 肿瘤坏死因子α (TNF α), 100 nM Smac 模拟, 20 µM 泛 caspase 抑制剂 Z-(芬兰马克11 的形成。组合缩写为慈。把另一盘车当作控制品对待。
- 在适当的时间长度以后, 通常 6 h, 收获细胞裂解。
- 用塑料刮刀刮掉盘子上的细胞, 然后用10毫升的吸管将其转移到15毫升圆锥管中。离心细胞在 1000 x g 3 分钟在4摄氏度。
- 2次通过 resuspending 在10毫升的冰冷 PBS 和离心在 1000 x g 3 分钟, 在4摄氏度清洗细胞。吸入 PBS 溶液。
注: 这个过程可以在这里暂停冻结细胞颗粒在液氮和储存 at#˗80°c 长达1月。 - 将细胞颗粒转移到1.5 毫升的离心管上, 在0.3 毫升的裂解缓冲液中孵育30分钟冰。离心机在 2万 x g 15 分钟在4摄氏度。上清是整个细胞裂解。
注意: 这个过程可以在这里暂停, 将样品储存在-20 摄氏度, 长达几个月。 - 根据制造商的协议测量蛋白质浓度的布拉德福德化验。添加 4x SDD 龄加载缓冲器, 准备20µL 的3µg/µL 样品, 室温孵育10分钟。
2. 准备和运行凝胶
- 在玻璃烧杯中添加2克琼脂糖到200毫升的1x 三醋酸盐缓冲液中, 在微波炉中加热以融化琼脂糖。添加1毫升 20% sds, 最终浓度为 0.1% sds。仔细地旋转混合。注意不要在 SDS 添加后产生气泡。
- 将琼脂糖溶液倒入15厘米 x 14 厘米的凝胶板中。使用1毫升吸管消除任何气泡。在顶部放一把20好梳子。
- 第一维: 吸管60µg 全细胞裂解在极右车道。在 60 V 左右运行凝胶约 4 h (直到染料前面是关于¾通过凝胶) 使用泰含 0.1% SDS 作为运行缓冲。
- 第二维: 小心旋转凝胶90°逆时针方向 (图 2A)。用60伏的凝胶大约4小时。
注: 一般运行条件为4伏/厘米凝胶长度。重要的是, 在第一和第二维度上, 运行条件是完全相同的。
3. 转让
- 使用毛细管转移方法将蛋白质转移到聚偏聚氟 (PVDF) 膜 (图 2B)。
- 将500毫升的传输缓冲器添加到大约20厘米 x 20 厘米的容器中。在容器旁边制作一叠5厘米高的纸巾。堆栈顶部的表面积必须大于凝胶尺寸。
- 将14厘米 x 15 厘米的滤纸浸泡在传送缓冲器中, 放在纸巾栈的顶部。注意不要在纸上放皱纹或气泡。用另一张滤纸重复。
- 激活 14 cm x 15 cm PVDF 膜在甲醇三十年代然后在过滤器纸上把它层起来小心使用滚筒去除所有气泡。用转移缓冲器冲洗凝胶并将其层在膜上, 再滚出任何气泡。
- 覆盖最靠近容器的纸巾的边缘与塑料包装。在下一步施工的纸桥不与纸巾栈直接接触是很重要的。
- 在传输缓冲器中浸泡一块15厘米 x 35 厘米的滤纸, 然后将其放在一个端盖上, 另一端位于传输缓冲器的容器中。与另一座桥重复。
- 用塑料包装把容器盖住, 在室温下过夜。
4. 西方印迹检测
- 用50毫升的 PBS 冲洗膜, 其中 0.05% Tween-20 (PBST) 在20厘米 x 20 厘米的容器中。在 PBST 中加入20毫升5% 牛奶。在室温下晃动30分钟以阻挡。
- 吸管10µL 兔抗 MLKL 抗体成20毫升5% 牛奶在 PBST 和添加到容器。在摇杆上孵化过夜在4摄氏度。
- 用20毫升的 PBST 冲洗膜5分钟, 重复5次。
- 吸管4µL 的抗兔 HRP 到20毫升5% 牛奶在 PBST 和添加到容器。在2小时的室温下在摇杆上孵化。
- 用20毫升的 PBST 冲洗膜5分钟, 重复5次。
- 添加增强化学发光基底 (ECL), 并根据制造商的协议暴露在 X 射线胶片。
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Representative Results
在 necroptosis 诱导, RIPK1 和 RIPK3 显示几乎相同的淀粉样蛋白样的模式 (车道2和 4,图 1)。然而, MLKL 纤维更异质, 似乎小于 RIPK1/RIPK3 纤维 (6 车道,图 1)。这促使我们开发了 2D SDD 的方法, 以解决 MLKL 是否形成 RIPK1/RIPK3-independent 纤维或 MLKL 简单离解在 RIPK1/RIPK3/MLKL 年龄的大 SDD 纤维的可能性。
电泳和传输过程的一般示意图显示在图 2中。在第一维度 SDD 年龄段, 淀粉样蛋白或类似淀粉样的纤维将呈现一个特征涂片, 如图 3a所示。在运行第二维 SDD 的时候, 有两个可能的结果。在凝胶运行过程中无降解或离解的情况下, 纤维在第二次运行时会与第一次运行时相同。在这种情况下, 一个西方污点将在薄膜上以45°角显示对角线图案, 如图 3B所示。如果纤维在 SDD 过程中离解, 较小的纤维在第二次电泳过程中会更快地迁移。在这种情况下, 西方污点将在对角线下方显示垂直裸线, 如图 3C所示。
在 necroptosis 中看到的 MLKL 纤维的情况下, 它们显示了在第一维 SDD 年龄 (图 4A) 期间的特征涂片。当这些纤维受到 2D SDD 龄时, 他们展示了一条锋利的对角线, 没有垂直裸奔 (图 4B)。有了这一证据, 得出的结论是, MLKL 在 SDD 年龄过程中没有游离纤维, 在图 1中看到的含有 MLKL 的纤维确实有别于 RIPK1/RIPK3 纤维。此外, 当 RIPK3 从细胞裂解物免疫耗尽时, MLKL 纤维保持完好的 4, 确认 MLKL 纤维和 RIPK1/RIPK3 纤维确实是不同的实体.
图 1.necroptosis 过程中淀粉样蛋白纤维的检测.全细胞裂解物从肿瘤坏死因子诱导的 necroptosis 细胞中提取, 并受 SDD 年龄的影响。对 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 进行了西方印迹。MLKL 纤维在 RIPK1/RIPK3-containing 纤维中呈现出明显的迁移规律。在这种情况下, MLKL 单体几乎看不见。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.实验协议.(A) 二维半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳 (2D SDD 龄) 示意图。首先加载的样本在最右边的车道, 标记为红色。第一维运行终止后, 逆时针旋转凝胶90°。运行第二维电泳。实心箭头指示第一个维度运行的方向, 虚线箭头指示第二个维度运行的方向。(B) 通过毛细管操作进行传输的模式。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.可能的结果.(A) 在 SDD 后的第一个维度后, 淀粉样或淀粉样纤维的预期迁移模式。实心箭头指示迁移的方向。(B) 在 2D SDD 岁以后, SDD 年龄稳定 (无降解或离解) 淀粉样蛋白或淀粉样纤维的预期迁移模式。实心箭头指示第一维 SDD 的方向。虚线箭头指示第二维 SDD 的方向。(C) 非 SDD 年龄稳定的淀粉样蛋白或淀粉样纤维的预期迁移模式。实心箭头指示第一维 SDD 的方向。虚线箭头指示第二维 SDD 的方向。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4。在1D 和 2D SDD 期间迁移含 MLKL 光纤.(A) 整个细胞裂解物是从与慈 necroptosis 刺激的细胞中收获的。裂解物受 SDD 年龄的侵害, 并为 MLKL 进行了一次西方印迹。观察了特征涂片。(B) 从裂解物刺激的细胞中采集整个细胞, 接受 necroptosis。裂解物受 2D SDD 年龄的侵害, 并为 MLKL 进行了一次西方印迹。在45°角上观察到一条锋利的线, 表明纤维在 SDD 时期不会发生离解。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
2D SDD 年龄的最关键的方面是电泳条件是相同的第一和第二个维度。在 45° (表明没有离解或退化发生) 的情况下, 检测到一条锋利的对角线的能力取决于在两个电泳中以相同方式迁移的纤维。使用不同的条件, 例如改变电压或运行时间的长短, 将会掩盖这些结果。同样, 与传统的 1D SDD 年龄的情况一样, 煮沸的样品应该避免, 因为这将扰乱淀粉样蛋白和淀粉样的纤维。与所有转移的情况一样, 应注意避免滤纸、膜和凝胶层之间的气泡。最后, 在转移步骤中, 桥梁不下垂, 直接接触纸巾栈是至关重要的。一个可靠的方法来防止这是使用一小块塑料包装覆盖的边缘的纸巾。
协议中提供的运行条件 (60 V 为4小时) 可以调整。例如, 在这个协议中, 琼脂糖凝胶是14厘米 x 15 厘米。如果使用更小的胶凝体, 电压 (4 V/cm 凝胶长度) 和奔跑时间应该按比例调整。两个样品可以一次分析, 使用两个梳子时, 准备凝胶。样品应该被装载在权利最好为每个梳子。在这种情况下, 运行时间应再次缩短, 以便顶部样品不会运行到凝胶的底部一半。如果为凝胶的一个维度调整时间, 则调整另一个维度以匹配是至关重要的。
与 SDS 页面相比, 1D 和 2D SDD 年龄都是半变性。由于光纤保持不变, 某些表位可能仍然无法访问。这可能会限制某些抗体的检测。2D. SDD 年龄在确定淀粉样蛋白或淀粉样蛋白纤维的确切大小方面的能力有限。但是, 可以进行相对大小比较。
所有蛋白复合物在 SDD 的过程中都有离解或降解的可能, 因此很难解释其定性结果。使用 2D SDD 年龄允许确认在 SDD 年龄看到的大小异质性并不是由于电泳过程中 SDS 依赖性的离解。2D. SDD 年龄适合在使用传统 1D SDD 年龄的任何情况下使用。2D. SDD 在 1D SDD 年龄段的大小异质性观察时尤其有用。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了何善衡奖学金的支持。从 NIH/NCATS (TL1TR001104), 韦尔奇基金会赠款 (I-1827) 和研究院 (RGM120502A) R01 赠款 z.w.z. W. 是弗吉尼亚默奇森克姆学者在医学研究和癌症预防和研究所得克萨斯学者 (R1222)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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