Summary
Vi præsenterer her, en metode til at ingeniør genomet af C. elegans ved hjælp af CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins og homologi afhængige reparation skabeloner.
Abstract
De grupperede regelmæssigt spækket palindromiske gentagelser (CRISPR) - CRISPR - forbundet protein 9 (Cas9) prokaryote adaptive immun forsvarssystem har været selvsupplering som et effektivt redskab til præcise eukaryote genom engineering. Vi præsenterer her, en hurtig og enkel metode bruger kimære enkelt guide RNA'er (sgRNA) og CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) til den effektive og præcise generation af genomisk punktmutationer i C. elegans. Vi beskriver en pipeline for sgRNA måludvælgelser, homologi-instrueret reparation (HDR) skabelondesign, CRISPR-Cas9-RNP kompleksbindende og levering og en genotypebestemmelse strategi, der giver mulighed for robust og hurtig identifikation af korrekt redigerede dyr. Vores tilgang ikke blot tillader facile generation og identifikation af ønskede genomisk punkt mutant dyr, men også letter påvisning af andre komplekse indel alleler i ca 4-5 dage med høj effektivitet og en reduceret screening arbejdsbyrde.
Introduction
Seneste teknologiske fremskridt har radikalt forvandlet og accelereret evne til netop ingeniør genomer. Især har CRISPR-Cas9 system, som bygger på den RNA-styrede liv1975 Cas9 til at fremkalde en dobbeltstrenget pause (DSB) nær målet sekvens af interesse, været flittigt brugt til præcist ingeniør genom størstedelen af modelorganismer anvendes i biomedicinsk forskning1,2,3,4. Betydeligt, brugen af CRISPR-Cas9 har ulåst genom-redigering selv i vanskelige arter som C. elegans5. Uanset art, generere punktmutationer med den CRISPR-Cas9 baseret genom-redigering system bygger på tre centrale komponenter: 1) Cas9 endonuklease, 2) en enkelt guide-RNA (sgRNA), der dirigerer Cas9 liv1975 til en target sekvens, og 3) brugeren designet Homologi-instrueret reparation (HDR) skabelon der indeholder den ønskede edit(s) af interesse2.
Der er flere metoder, der kan bruges til at indføre de rettet mod sgRNA og Cas9 nukleasen ind i cellerne herunder plasmid, RNA og viral-baserede levering metoder6. Direkte levering af pre-kompleksbundet sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har for nylig dukket op som et kraftfuldt og effektivt redskab i CRISPR-Cas9-baseret genom-redigering7. Den direkte levering af pre-kompleksbundet CRISPR-Cas9 RNPs har flere klare fordele, nemlig: 1) RNPs bypass behovet for cellulære transskription og translation, 2) RNPs er hurtigt fjernet, som kan øge specificitet ved reducerer den tilgængelige tid for off-target kavalergang og 3) RNPs indeholder ingen fremmed DNA/RNA elementer, der omgår indførelsen af ikke-hjemmehørende sekvenser i vært genomet gennem tilfældige integration. Sammen, give disse attributter sandsynligvis en kortvarig burst-mål CRISPR redigering samtidig minimere off target effekter.
Vi beskriver en enkel og effektiv protokol til at indføre lokationsspecifikke genomisk ændringer i C. elegans. Denne protokol omfatter rettet mod sgRNA og enkelt strandede oligonukleotid (ssODN) HDR skabelondesign, sgRNA-Cas9 RNP kompleksbindende og levering og en genotypebestemmelse strategi til entydig identifikation af korrekt redigerede dyr. Bruger denne strategi, ikke blot kan de ønskede lokationsspecifikke ændringer inddrives, men andre uspecifikke indel mutationer kan også inddrives. Således, vores strategi tillader generation af en allel serien ved hjælp af en enkelt strategi, hvor både mono-allel, bi-allel, og indel mutanter kan genereres i F1 generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrs pleje og eksperimentelle procedurer fulgt retningslinjen fra National Institutes of Health og institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan. Bruge RNase-fri løsninger og afpipetteres tips hele protokollen. Ren arbejdsområde, pipetter, rør og centrifuge med RNase dekontaminering løsning efter fabrikanten retningslinjer (Se Materialer tabel).
1. sgRNA valg af observationsområde
- Ved hjælp af en webbrowser, åbner websiden: http://crispor.tefor.net8
- Input ~ 60 basepar (bp) af sekvens flankerer den ønskede redigering af interesse (dvs. 30 bp 5' og 3' af ønskede redigering).
- Vælg Caenorhabditis elegans genomet fra rullegardinmenuen.
- Vælg Protospacer tilstødende motiv (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) i rullemenuen.
- Klik på Send. Vælg top rangeret target sekvens tættest på redigering af interesse på resultatsiden. Hvis der er nogen egnet målwebsteder inden for de flankerende 60 bp input sekvens, udvide forespørgsel sekvens op til 100 bp (dvs. 50 bp enten side af den ønskede edit).
- Fra en anvendelig kilde, f.eks. synthego, få en 20-mer target sgRNA med følgende specifikationer: 3 nmol; ingen ændringer.
- Ved modtagelsen, centrifugeres frysetørret sgRNA indeholdende tube på > 12.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Tilsættes 60 µL af nukleasen-gratis TE til røret, og forsigtigt genopslæmmes af pipettering op og ned 15 - 20 gange med P200 pipette. Den endelige koncentration er 50 µM.
2. homologi-instrueret reparation skabelondesign
- Designe en ssODN HDR skabelon indeholder: 1) mutationen af interesse, 2) en enestående i-frame begrænsning liv1975 site, 3) en tavs mutation af en eller begge af Gs i NGG PAM sekvens og 4) 50 bp 5' og 3' homologi arme flankerer den første og sidste mutation. (Figur 1 c) 9 , 10.
- Hvis mutation af NGG PAM sekvens ikke er muligt, indføre 5-6 tavse mutationer i sgRNA mål anerkendelse sekvens til at forhindre sgRNA-medieret spaltning af ssODN HDR skabelon.
- Fra en anvendelig kilde, f.eks. idtdna, få en "Ultramer DNA oligonukleotid" med følgende parametre: skala: 4 nmol; Formulering: None; Rensning: Standard afsaltning.
- Ved modtagelsen, centrifugeres frysetørret ssODN indeholdende tube på > 12.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur. Forsigtigt suspendere re ssODN til en endelig koncentration på 100 µM i nukleasen-fri ddH2O af pipettering op og ned 15 - 20 gange med P200 pipette.
3. design genotypebestemmelse primere
- Designe en primer indstille flankerende genom ændring til at generere en ~ 400-700 bp PCR-amplikon11.
- Optimere PCR cykling betingelser til at producere en enkelt og specifikke amplikon11.
4. Forbered injektion Mix
- Centrifugeres tabel 1 reagenser ved maksimal hastighed for 2 min. ved 4 ° C.
- Tilføj tabel 1 reagenser til et nukleasen-fri PCR rør i den anførte rækkefølge.
- Blandes grundigt ved forsigtigt pipettering op og ned 10 gange med P20 pipette.
- Inkuber injektion mix i 10 min ved stuetemperatur.
5. indsprøjtning protokol
- Indlæse injektion mikropipette med cirka halvdelen af injektion mix12. Gemme resterende injektion mix i tilfælde af injektion nålen træsko eller pauser.
- Bryde mikropipette tip, så ~ 20-30 PSI producerer en gradvis strømmende løsning12.
Bemærk: Større diameter tips negativt påvirker dyrenes sundhed og mindske F1 afkom udbytte. - Injicér 10-15 unge voksne orme i begge gonadale arme om muligt12. Hvis ikke, kan injiceres i ene gonadale arm er tilstrækkelig.
- Tillad injiceres dyr (P0) at inddrive i 1-2 timer ved stuetemperatur på en OP50-seedede 35 mm ødelægge vækst medier (NGM) fad. Efterfølgende vælge enkelt indsprøjtet P0 dyr til individuelle OP50-seedede 35 mm NGM plader ved hjælp af en platin wire orm12.
6. screen P0 plader og enkelt mCherry(+) F1s
- To dage efter injektionen, identificere P0 plader der indeholder F1 afkom at udtrykke mCherry i svælget med en fluorescerende stereomikroskop (figur 1 d, dag 2 - 3). Vælg tre P0 plader, der indeholder de fleste mCherry(+) F1 dyr.
- Fra hver af de tre valgte P0 plader, enkelt 8-12 mCherry(+) F1 dyr for i alt 24-36 mCherry(+) F1s ved hjælp af en orm pick (figur 1 d, dag 2 - 3).
Bemærk: mCherry(-) dyr kan også være udvalgt fra disse P0 plader, men sandsynligheden for at identificere korrekt redigeret dyr er meget lavere (figur 2A). - Tillade individuelle F1s til self-fertilize og lægge æg i 1-2 dage ved stuetemperatur.
7. single orm PCR og genotypebestemmelse
- Efter 1-2 dage efter æglægning, overføre F1s i individuelle PCR strip tube caps indeholdende 7 µL af ormen lysisbuffer ved hjælp af en orm pick (tabel 2, figur 1 d, dag 4-5).
- Centrifugeglas PCR ved maksimal hastighed i 1 minut ved stuetemperatur til at bringe dyr til rør bunden, og fryse rør ved-80 ° C i 1 time.
Bemærk: Orme kan opbevares ved-80 ° C på ubestemt tid. - Lyse frosne orme i en thermocycler ved hjælp af følgende program: 60 ° C i 60 min, 95 ° C i 15 min, 4 ° C hold.
- Set-up PCR-mastermix, som vist i tabel 3.
- Tilføj 21 µL PCR-mastermix i ren PCR rør, og Tilføj derefter 4 µL af ormen lysis fra trin 3. Bland godt med en pipette og køre PCR programmet følgende producenter retningslinjer (Se Materialer tabel).
- Rense PCR reaktioner ved hjælp af en DNA ren og koncentrat kit, efter producentens anvisninger (Se Materialer tabel). Elueres DNA ved at føje 10 µL vand til kolonnen spin.
- Set-up begrænsning enzym mastermix som vist i tabel 4.
- Tilsæt 10 µL af begrænsning enzym mastermix til hver renset PCR reaktion og inkuberes i 1-2 timer ved 37 ° C13.
- Separat fordøjet PCR produkter på en 1,5%-agarosegel, køre på 120 V ved hjælp af 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer14.
8. identifikation og sekvens verifikation af redigerede dyr
- Undersøge enzym fordøjet prøver for tilstedeværelse af bands, der viser potentiale redigeret dyr14 (figur 1 d, dag 4-5).
Bemærk: Ilæg en N2 kontrol for at identificere potentielle indel mutationer, som kan observeres som forskydninger i bandet størrelse og/eller uventede og komplekse begrænsning enzym fordøjelsen banding mønstre. - Efter at identificere potentielle redigerede dyr, bruge de resterende 3 µL af ormen lysis og Gentag PCR reaktionen. Rengør ikke eller begrænsning enzym fordøje PCR reaktion efter programmet er afsluttet. Indlæse PCR reaktion på en 1% agarosegel, separat og udtrække bandet ved hjælp af en gel udvinding kit15 (Se Materialer tabel).
- Sanger sekvens16 gel udvindes DNA ved hjælp af F1 primer til at identificere korrekt redigerede dyr (figur 1A)
Bemærk: Heterozygote læser vil indeholde overlejret toppe på grund af tilstedeværelsen af typen vilde og manipuleret allel. - At indhente homozygot dyr fra verificerede heterozygous redigerede dyr, enkelt 8-12 F2 dyr og udføre trin 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutationer i menneskelige superoxiddismutase 1 (SOD1) udgør ~ 10-20% af familiær Amyotrofisk lateral sklerose, en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der uvægerligt fører til lammelse og død17. Menneskelige SPADESTIK-1 er en evolutionært bevarede protein deler 55% identitet og 70% lighed med C. elegans SPADESTIK-1 protein (figur 1B). For at demonstrere enkelhed, gennemførligheden og effektiviteten af den CRISPR-Cas9 RNP-baseret tilgang, målrettet vi C. elegans spadestik-1 -genet for at indføre sygdom-associerede menneskelige G93A variant i orm genomet (figur 1A).
For at ingeniør G93A mutation i C. elegans genom, en sgRNA blev valgt hvis PAM genkendelsessekvens sidder 3 bp opstrøms af G93 codon (figur 1 c). Vi har designet en ssODN HDR reparation skabelon indeholder: 1) nukleotid ændringer til at konvertere G93 codon til A93 (GGA GCA), 2) en tavs ændring NGG PAM sekvens (CGG CAG) for at forhindre sgRNA-Cas9-medieret kløvningen af skabelonen HDR, 3) en tavs mutation (CT), introducerer et unikt HindIII begrænsning enzym sted for genotypebestemmelse, og 4) 50 bp 5' og 3' homologi våben (figur 1 c). En PCR primer sæt (F1-R1) var designet til at producere en enkelt 592 bp PCR produkt i N2 kontrolelementer (figur 1A). En injektion blanding indeholdende sgRNA, blev Cas9, ssODN og en fluorescerende markør plasmid (pCFJ90) blandet sammen, inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur og indlæses i en mikroinjektion pipette.
Figur 1 d skildrer arbejdsprocessen efter injektion mix er indlæst i en injektion mikropipette. På dag 0, blev 10-15 P0 dyr injiceret i en eller begge gonade våben ved hjælp af standard mikroinjektion teknik18,19. Injiceres dyr kommet sig 1-2 h og blev derefter individuelt belagt på OP50-seedede NGM plader. Efter 2-3 dage, var vellykket P0 injektioner identificeret af dem, der har mCherry(+) F1 afkom. De øverste tre P0 plader (dvs. dem, der har det største antal af mCherry(+) F1s) blev valgt til efterfølgende analyse. Fra hver af disse tre plader (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s blev udpeget til individuelle OP50-seedede 35 mm NGM plader for i alt 24 mCherry(+) F1s. Efter 2-3 dage efter æglægning (dag 4 - 5), den enkelte F1s blev overført til PCR rør indeholdende orm lysisbuffer og frosset i 1 time ved-80 ° C. Efterfølgende, F1s var mængden for at befri genomisk DNA, og underkastes PCR. PCR produkter blev derefter renset og fordøjes med HindIII for 1 h, og køre på en 1,5%-agarosegel for at identificere potentielle redigeret dyr. I korrekt redigerede dyr, HindIII fordøjelsen skærer fuld længde PCR produktet (592 bp) til to bands af 370 bp og 222 bp. Denne genotypebestemmelse strategi utvetydigt skelner mellem wild-type (592 bp), heterozygote (592, 370, 222 bp) og homozygote (370, 222 bp) dyr. Figur 2A illustrerer genotypebestemmelse resultater for de 24 mCherry(+) dyr.
For at demonstrere, at fluorescerende mCherry markør beriger for genom ændring, samlet vi også 8 mCherry(-) dyr fra hver af de tre P0 plader. 24 mCherry(+) F1s screenet (rød bar), 10 indeholdt mono-allel eller bi-allel modifikation (42%), 10 var vildtype (42%), 3 var potentielle indels (13%), og der var 1 PCR fiasko (figur 2A). Derimod af 24 mCherry(-) F1s screenet, blev kun 1 dyret korrekt modificerede (4%), mens 23 var vildtype (96%) (Figur 2A). Figur 2B viser kromatogram fra den fuld længde gel udvindes PCR produkt (F18-6), viser at de præcise nukleotid ændringer designet i skabelonen ssODN HDR var trofast indarbejdet i genomet af denne homozygot F 1 dyr. Navnlig, udstillet F1 dyr 10-7, 10-8 og 12-3 uventede PCR produktstørrelser og begrænsning digest banding mønstre, hvilket tyder på disse dyr må udføre komplekse indel mutationer (figur 2A). Således, vores metode er ikke kun i stand til at generere ønskede genom modifikationer med lethed, effektivitet og troskab, men også tillader identifikation og inddrivelse af unikke indel alleler, der kan kaste vigtigt og uventet indblik i genfunktion.
Figur 1 . CRISPR-Cas9 engineering af den C. elegansspadestik-1 locus. (A) Skematisk illustration skildrer exon-intron strukturen af sod-1 locus i C. elegans. Den røde bar angiver placeringen af G93 i exon 3. Primer par sæt er bemærket af de røde pile (F1-R1). (B) sekvens justering af menneskelige og C. elegans (orm) SPADESTIK-1 proteiner. Den målrettede G93 rest er fremhævet med rødt. (C) Top, en del af genomisk DNA omkring G93 codon er vist som en reference, og PAM (grøn) og sgRNA (blå) målwebsteder er fremhævet. Bund, enkelt strandede oligonukleotid (ssODN) homologi instrueret reparation (HDR) skabelon er vist indeholdende: codon redigere ændre G93 til A93, en tavs ændring af PAM motiv til at forhindre spaltning af sgRNA-Cas9-komplekset, en tavs ændre til indføre en unik HindIII begrænsning enzym websted (gul boks) og flankerende 5' og 3' 50 bp homologi arme (sorte bjælker). Alle nukleotid ændringer designet i ssODN er fremhævet rød. (D) skematisk illustration af rørledningen til at skabe og at identificere CRISPR-Cas9 RNP-baserede punkt mutanter. På dag 0, der injiceres 10-15 P0 dyr med indsprøjtning mix. På dag 2-3, identificere succes injiceres P0 dyr af dem, der indeholder fluorescerende F1 afkom, og vælg tre P0 plader med den mest fluorescerende afkom. Fra hver af de tre P0 plader, enkelt 8 fluorescerende F1 afkom. På dag 4-5, trin 1 og (a), individuelle F1s er plukket og placeret i PCR rør indeholdende lysisbuffer; (b) trin 2, er efter frysning ved-80 ° C, PCR rør indeholdende F1 orme mængden for at frigive genomisk DNA, som er brugt som en PCR skabelon. PCR produkter derefter rengøres og fordøjes med den entydige begrænsning enzym; (c) trin 3, enzym fordøjet produkter er løst på en agarosegel, hvor vilde type (+/ +), heterozygous (m / +), og homozygot (m/m) dyr kan identificeres ved begrænsning digest banding mønstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Genotypebestemmelse data for sod-1 (G93A) mutanter. ()A) Gel billede af F 1 dyr, der var individuelt mængden, PCRed og fordøjes med HindIII. For hver P0 plade (P0-8, P0-10, P0-12), blev 8 mCherry(+) og 8 mCherry(-) F1 dyr analyseret. Både mono-allel (blå tal) og bi-allel (røde tal) redigerede dyr blev inddrevet. Størrelse flyttet PCR produkter eller uforudsete HindIII fordøjet bands var også inddrives der er vejledende for indel mutanter (gule tal). N2 kontrolelementer er vist som en reference til PCR produkt dimensionering og enzym specificitet. (B) Top, codon afstand og aminosyre oversættelser er vist ovenfor for vildtype (WT) og nedenfor for G93A ændret tråde. Den ønskede redigering er fremhævet af en rød boks, og de tavse ændringer, at oprette en i-frame HindIII begrænsning websted fremhæves med en gul boks. Alle designet nukleotid ændringer er vist med fed skrift. Bunden, repræsentative kromatogrammet fra homozygot F1 animalsk 8-6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Volumen | Endelig koncentration |
| Hedeselskabet2O | 6.3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | 0,94 ΜL | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7,4 | 0,5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μl) | 1,25 ΜL | 2.5 ng/μl |
| ssODN (500 ng/μl) | 1,25 ΜL | 50 ng/μl |
| sgRNA (50 μM) | 1,25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1,03 ΜL | 5 ΜM |
| Endelige volumen | 12,5 ΜL | ---- |
Tabel 1. CRISPR-Cas9 RNP injektion Mix. Alle reagenser skal være re suspenderet i nukleasen-fri ddH2O. RNase gratis teknikker skal bruges ved håndtering af reagenser og når du foretager injektion mix.
| Reagens | [Endelig] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0,45% |
| Tween-20 | 0,45% |
| Proteinase K | 1 mg/mL |
Tabel 2. Ormen Lysis Buffer opskrift. Proteinase K bør tilføjes frisk før hver brug.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12,5 ΜL | 300 ΜL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Ormen Lysis | 4 ΜL | ---- |
| Hedeselskabet2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| Endelige volumen | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tabel 3. PCR-Mastermix. The PCR-mastermix skal være blandet godt af pipettering indtil løsningen er homogen. 21 µL PCR-mastermix bør føjes til ren PCR rør, og derefter 4 µL af individuelle orm lysate skal føjes til korrekt mærket rør.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 10 x enzym Buffer | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Renset PCR reaktion | 10 ΜL | ---- |
| Hedeselskabet2O | 7 ΜL | 168 ΜL |
| Begrænsning enzym (10 U/μL) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Endelige volumen | 20 ΜL | 240 ΜL |
Tabel 4. Begrænsning enzym Mastermix. Begrænsning enzym mastermix skal være blandet godt af pipettering indtil løsningen er homogen. 10 µL af begrænsning enzym mastermix skal tilføjes 10 µL af renset PCR produkt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas9-systemet er et stærkt og effektivt værktøj til præcist ændre genomet af modelorganismer. Vi viser her, at kimære sgRNAs20 kombineret med ssODN HDR skabeloner aktiver den højeffektive generation af genomisk punktmutationer i C. elegans. Vigtigere, vise vi at RNP levering producerer redigering højeffektiv når fluorescens bruges som fælles udvalg markør, fremhæver den lethed og pålidelighed af teknikken.
Størstedelen af CRISPR-Cas9 metoder til C. elegans genom engineering stole på specifikke genetiske baggrunde eller co-CRISPR strategier1. Co-CRISPR metode har vist sig for at være et utroligt nyttigt redskab, der øger sandsynligheden for at opnå en vellykket genom-redigering. Co-CRISPR metoder kræver dog at indføre en fænotype-vælges edit på en markør locus, der beriger for genom-redigering af interesse. Mens kraftfuld, kan at indføre valgbar fænotype-bærende mutationer være uønsket, hvis stamme til at redigere eller det ønskede punkt mutation af interesse, selv udviser fænotyper, der kan forværres eller undertrykt af markør fænotype. Desuden, co-CRISPR strategier nødvendiggøre, at skabe en ekstra dobbeltstrenget pause på en markør locus, der kan bidrage til at ud-target effekter. Vi præsenterer her, en metode, der bruger en forbigående fluorescerende markør, der ikke kun tjener til at identificere held indsprøjtet P0 dyr, men også beriger for ordentlig genom redigeringer. Vores data viser denne metode betydeligt beriger for held redigerede dyr i forhold til ikke-fluorescerende dyr, og giver flere markante fordele: 1) kun én målretning lokationsspecifikke sgRNA er påkrævet, 2) en 5-fold reduktion i Cas9 og sgRNA koncentration, 3) stamme og fænotype udvalg uafhængighed, og 4) en nominel screening arbejdsbyrde (~ 24 F1s). Robust CRISPR-Cas9 genom-redigering i F1 generation blev observeret ved hjælp af denne metode. Navnlig, PCR-begrænsning enzym-baseret detektion strategi beskrevet giver mulighed for entydig påvisning af mono - og bi-allel redigerede dyr i F1 generation. Endelig, genotypebestemmelse strategi letter identifikation af potentielle indel mutationer, som kan observeres som PCR band skifter når sammenlignet med N2 kontrolelementer, der er enten ikke modtagelige for begrænsning digest eller udbytte komplekse bands, når fordøjet.
Fremkomsten af næste generation sequencing kombineret med stor skala genomisk bestræbelser har fremskyndet identifikation af genomiske varianter, der adskille med sygdom21. Imidlertid har funktionelle tests sygdomsfremkaldende ikke påvist for fleste af varianter i cellulært og kropsligt modelsystemer. I denne undersøgelse, vi målrettet spadestik-1 -genet i C. elegans at indføre de almindeligt studerede ALS-associerede SPADESTIK-1G93A mutation. Til dato, denne mutation modelleret og studerede i C. elegans og mus primært ved hjælp af transgene overekspression. Selvom overekspression af varianter i dyremodeller kan sammenfatte nøglen cellulære, molekylære og adfærdsmæssige aspekter af sygdommen, det er i stigende grad klart, at 'dosis' er en formildende faktor fænotyper22. For eksempel, udviser høj kopi nummer SPADESTIK-1G93A mus transporterer ~ 24 eksemplarer af det muterede menneskelige SPADESTIK-1 gen høj grad accelereret sygdomsforløb i forhold til SOD-1G93Adl mus, som bærer kun ~ 8-10 eksemplarer23,24. Her, viser vi, at vores CRISPR-Cas9 RNP-baseret metode kan udnyttes til at hurtigt generere menneskelige variant-associerede mutationer i orthologous orm gen uden at kræve transgene overekspression, i et forsøg på at mere præcist replikerer den genetiske forbindelse med sygdom. Vores metode giver en realistisk platform til at producere og teste genomiske varianter af ukendt betydning i forbindelse med udtryk, der er til hinder for rammerne af overekspression og endogene myndighedskontrol. Endelig har vi også brugt denne metode til at tagge endogene gener med fluorescerende proteiner (dvs. normal god landbrugspraksis), som vil give en ekstra værktøj til at visualisere, hvordan varianter påvirke protein lokalisering, sammenlægning og omsætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker medlemmerne for Beg laboratorium for kritisk læsning af dette manuskript. Stammer blev leveret af Caenorhabditis genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Forskning i Beg laboratorium er støttet af tilskud fra NIH (R01 NS094678) og muskelsvind Association (MDA382300) til A.A.B.
Acknowledgments
Der er ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
