Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57627
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة والاحتياطات المطلوبة لأداء متعدد النسخ العكسي خلية مفردة البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك. هذا الأسلوب أسلوب بسيط وفعال لتحليل الشخصية التعبير لمجموعة محددة سلفا من المورثات من خلية واحدة تتميز بتسجيلات المشبك التصحيح.

Abstract

قشرة الدماغ يتكون من العديد من أنواع الخلايا نستعرض مختلف السمات المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية. ويعوق هذا التنوع من السهل تحديد وتوصيف هذه الأنواع الخلية، شرطان أساسيان لدراسة مهامهم المحددة. توضح هذه المقالة خلية مفردة متعدد النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR) البروتوكول، الذي يسمح، بعد التصحيح-المشبك تسجيل شرائح، كشف في نفس الوقت التعبير عن عشرات الجينات في خلية واحدة. هذه طريقة بسيطة يمكن تنفيذها مع توصيف الخصائص المورفولوجية وقابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الصفات المظهرية لمختلف أنواع الخلايا وبيئتها الخلوية خاصة، مثل القرب من الأوعية الدموية. مبدأ هذا البروتوكول هو لتسجيل نسخ خلية مع تقنية المشبك التصحيح، الحصاد وعكس محتواه هيولى، والكشف عن نوعي متعدد التعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات ببكر. أنه يتطلب تصميم دقيق [بكر] كبسولة تفجير وحل المشبك التصحيح داخل الخلايا متوافق مع RT-PCR. للتأكد من نسخة انتقائية وموثوق بها يتطلب الكشف، هذا الأسلوب أيضا ضوابط ملائمة من حصاد السيتوبلازم إلى خطوات التضخيم. على الرغم من الاحتياطات التي نوقشت هنا يجب أن يتبع تماما، يمكن استخدام تقريبا أي المختبر الكهربية الخلية واحد متعدد تقنية RT-PCR.

Introduction

قشرة الدماغ وتضم العديد من أنواع الخلايا في مختلف العمليات الفسيولوجية. على تحديد وتوصيف، شرطا أساسيا لفهم وظائفها المحددة، يمكن أن تكون صعبة للغاية نظراً لتنوع المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية الكبيرة التي تتسم بها أنواع الخلايا القشرية1 ،2،،من34.

خلية واحدة متعدد RT-PCR يستند إلى المزيج من التصحيح-المشبك وتقنيات RT-PCR. ويمكن التحقيق في وقت واحد أكثر من 30 من الجينات المعرفة مسبقاً في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. إدراج الراسم العصبية في ماصة تسجيل زيادة يسمح توصيف الخصائص المورفولوجية للخلايا مسجل بعد الوحي histochemical6،،من78،9، 10. وأسلوب مفيدة جداً لتصنيف أنواع الخلايا العصبية على أساس تحليل متعدد المتغيرات لتلك الصفات المظهرية5،،من910،11،12 ،،من1314. خلية مفردة متعدد RT-PCR هو أيضا مناسبة لتوصيف الخلايا غير العصبية مثل أستروسيتيس15،،من1617، ويمكن تطبيقها عمليا على كل الدماغ بنية18، 19،20،21،22،23 وخلية نوع، على افتراض أنها يمكن أن تسجل في تكوين كل خلية.

هذا الأسلوب مريحة للغاية لتحديد مصادر الخلوية و/أو أهداف لانتقال أنظمة7،8،15،16،،من2021، 24،25،26،،من2728، لا سيما عندما لا توجد أجسام مضادة محددة. فإنه يعتمد على تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا المحددة بصريا29، ومما يسمح أيضا لاستهداف الخلايا في15،،من8بيئة خلوية خاصة16. وعلاوة على ذلك منذ سيتوارتشيتيكتوري أنسجة الدماغ محفوظاً في شرائح المخ، كما يتيح هذا النهج دراسة العلاقات التشريحية للخلايا تتميز بعناصر الخلايا العصبية وغير العصبية7،8 , 18.

نظراً لهذه التقنية محدودة بمبلغ المقطوع السيتوبلازم وكفاءة الرايت، الكشف عن مرناً المعرب عنها في عدد نسخ منخفضة يمكن أن يكون صعباً. على الرغم من أن النهج الأخرى القائمة على التكنولوجيا رناسيق تسمح لتحليل الترنسكربيتوم كله من خلايا مفردة3،4،،من3031، يحتاجون التعاقب مكلفة الفائق ليس بالضرورة متاح لكل مختبر. حيث يستخدم تقنية RT-PCR متعدد خلية مفردة بكر نقطة النهاية، فإنه يتطلب فقط ثيرموسيكليرس متاحة على نطاق واسع. يمكن أن توضع بسهولة في مختبرات مجهزة بالهياكل الكهربية ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. يمكن ذلك، خلال يوم واحد، توفير تحليل نوعي للتعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات. وهكذا، هذا النهج يوفر سهولة وصول إلى توصيف الجزيئية للخلايا المفردة بطريقة سريعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع إجراءات تجريبية باستخدام الحيوانات تم تنفيذها طبقاً للوائح الفرنسية (رمز الريف R214/87 إلى R214/130) وتتفق مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجماعة الاقتصادية الأوروبية (86/609/EEC) والميثاق الوطني الفرنسي على أخلاقيات التجارب الحيوانية. كافة البروتوكولات أقرته لجنة الأخلاقيات تشارلز داروين وقدم للوزارة الفرنسية للتعليم والبحوث (الموافقة عام 2015 061011367540). مرفق الحيوان إيببس معترف بها من قبل السلطات الفرنسية (A75-05-24).

1-اعتبارات أولية

ملاحظة: لتجنب التلوث، مطابقة للتوصيات التالية قبل إجراء وحيد الخلية RT-PCR بعد التصحيح-المشبك.

  1. لا تستخدم البلازميدات المحتوية على الجينات للفائدة في المختبر كما مصدر محتمل للتلوث.
  2. حجز مقعد معمل بعيداً عن غرفة التفريد جل لإعداد تقارير إتمام المشروعات.
  3. أهدى مجموعة من الممصات ونصائح تصفية مقاومة الهباء الجوي للتلاعب بالحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بتركيزات أقل من 1 نانوغرام/ميليلتر. ابدأ استخدام هذه لتحليل منتجات PCR.
  4. دائماً استخدم منتجات خالية من الدناز ورناسي وارتداء القفازات.
  5. استخدام مواد كيميائية مخصصة لإعداد الحلول الداخلية التصحيح-المشبك. ابدأ استخدام ملعقة ولكن وزنها بدلاً من الورق وزن مساحيق.
  6. استخدام قطب الهيدروجيني مخصصة والأس الهيدروجيني الحلول القياسية، كما أنها يمكن أن تكون مصدرا للتلوث (مثلاً، رناسي).
  7. متجر زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية؛ 20 ميليلتر طويلة ودقيقة ومرنة نصائح؛ ميكروبيبيتي 20 ميليلتر؛ اكسبيلير الصنع (التصحيح-المشبك ماصة حامل يعلق على حقنه 10 مل)؛ 500 أنابيب PCR ميليلتر؛ 10 ميليلتر مقاومة الهباء الجوي لتصفية نصائح؛ ورقيقة علامات دائمة في مربع مخصص (الشكل 1).

2. تصميم التمهيدي

ملاحظة: متعدد RT-PCR يعتمد على خطوتين التضخيم. خلال PCR الأول، تتضخم جميع الجينات ذات الاهتمام المشترك بخلط معا جميع [بكر] كبسولة تفجير. للكشف عن موثوقية النصوص من الخلايا المفردة، من الضروري تصميم كفاءة وانتقائية [بكر] كبسولة تفجير. ويحسن استخدام كبسولة تفجير (الداخلية) المتداخلة للجولتين الثانية من بكر الخصوصية وكفاءة التضخيم.

  1. استرداد تسلسل مرناً المنسق جينات الفائدة في "نكبي مرجع تسلسل قاعدة بيانات"32 ، فضلا عن تلك الأسرة ذات الصلة (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. قم بإدخال الاسم في gene(s) والأنواع ذات الأهمية كاستعلام وانقر فوق تسلسل المسترجعة ذات الصلة.
    2. لتقييد التحليل إلى الترميز تسلسل gene(s)، انقر فوق إرسال إلى (الزاوية العلوية اليمنى)، وحدد الترميز تسلسل و النوكليوتيدات FASTA كتنسيق. ثم انقر فوق إنشاء ملف وحفظ تسلسل FASTA استخدام ملحق ملف ".nt".
  2. استخدام الببغاء البرمجيات33 (منضدة التحليل ومتعددة محاذاة البناء) أو أي برامج أخرى متعددة محاذاة لتحديد مناطق التماثل.
    1. انقر فوق الملف | مشروع جديد... وحدد الحمض النووي كنوع تسلسل. لاستيراد تسلسل الجين، حدد تسلسل | استيراد تسلسل... وتحميل ملف ".nt". كرر الإجراء لكافة تسلسل ذات الصلة.
    2. انقر واسحب كافة تسلسل في الإطار التخطيطي لتحديد تسلسل كامل.
    3. البحث في مناطق التماثل بتحديد محاذاة | البحث عن القطع... (CTRL + S). حدد زوج الجزء تتداخل في طريقة البحث. ضبط بيرويس نقاط قطع قيمة عالية نسبيا (مثلاً، 1,000) و الحد الأدنى seqs. كل كتلة على العدد الإجمالي لتسلسل إلى محاذاة، ثم انقر فوق بدء.
    4. في الإطار نتائج البحث يظهر، حدد عدد النتائج () مع النائب-درجة أعلى وانقر فوق الارتباط. إذا تم العثور على أي نتيجة، إنقاص بيرويس نقاط قطع و/أو seqs. كحد أدنى كل كتلة.
    5. لتسهيل تصور المناطق المتجانسة، حدد محاذاة | تظليل | يعني درجة.
    6. حدد أجزاء غير مرتبط تسلسل وكرر 2.2.3–2.2.4 خطوات لتحديد مناطق أخرى للتماثل مع درجة أقل النائب يحتمل أن تكون.
    7. للحصول على أجهزة الإشعال الأكثر تحديداً، تحديد المناطق ذات التماثل تسلسل أقل.
  3. إحضار في التسلسل لكافة المتغيرات لصق وكرر الخطوات 2.2.1–2.2.6. تحديد مناطقها المشتركة لكشف العام. النظر في أشرطة الكاسيت بديلة للوصلة مخصصة المتغيرات تحليلات20،34،35،36.
  4. قم بمحاذاة تسلسلات مرناً في جينوم الحيوان نموذج استخدام الانفجار37 الجينوم (الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث) لتحديد هيكل إنترون-إكسون الجينات (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. حدد جينوم الفأر الانفجار بالنقر فوق الماوس وتحميل التسلسل FASTA المستردة في المقطع أدخل سلسلة الاستعلام . في اختيار البرنامج، حدد الأمثل تسلسل مشابهة جداً (ميجابلاست)، ثم انقر فوق الزر الانفجار .
    2. في المقطع الوصف ، حدد المحاذاة مع هوية أعلى (تصل إلى 100 في المائة). تأكد من أن يناظر الجينات للفائدة كما هو مبين في ميزات قسم التحالفات .
    3. نوع المحاذاة بدء الاستعلام الموقف في نفس القسم للحصول على خلافة exons تسلسل الترميز. ملاحظة مواقف البدء والانتهاء من جميع الزيارات التي تتطابق تقريبا لموقف introns في سلسلة الاستعلام (الشكل 2A).
  5. حدد اثنين exons مختلفة للإشعال الإحساس و antisense للتفريق بين سهولة كدنا الجينوم تضخيم الحمض النووي (جدنا) استناداً إلى معيار حجم (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن أن يحدث تضخيم جدنا بتردد منخفض عندما يتم حصادها النواة مع السيتوبلازم. وبالتالي، من الضروري تصميم إنترون أوفيرسبانينج أزواج التمهيدي (الشكل 2A). في حالة أقل إنترون الجينات، مشكلة جمع النواة فإنه يمكن أن يؤدي إلى التباس يحتمل أن تكون النتائج. لمعالجة هذه المسألة، تشمل مجموعة من الإشعال بهدف تضخيم تسلسل إينترونيك للتحقيق لوجود جدنا25. إذا كان عنصر التحكم الجينوم إيجابيا، يجب تجاهل النتائج لجميع الجينات إنترون-أقل.
  6. للتوصل إلى مضاعفة كفاءة، حدد الإشعال توليد أمبليكونس بطول تتألف من الناحية المثالية بين 200 و 400 زوج قاعدي (الشكل 2).
  7. لتضخيم كدناس مختلفة في وقت واحد خلال الخطوة PCR متعدد، تصميم كبسولة تفجير بطول بين 18 و 24 النيوكليوتيدات ودرجة حرارة ذوبان (Tm) بين 55 و 60 درجة مئوية.
  8. للتقليل من تشكيل الهياكل الثانوية، التي تقلل من العائد التضخيم، حدد الإحساس والشعور المضادة الإشعال دبوس الحد الأدنى وأطوال المزدوجة (الشكل 2).
  9. تصميم كبسولة تفجير الداخلية باستخدام نفس المعايير (خطوات 2.5-2.8).
  10. التحقق من الطابع الخاص للإشعال PCR بمحاذاة الإشعال على "قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي مرجع" الكائن الحي من فائدة استخدام النوكليوتيدات انفجار.
    1. في الانفجار (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)، انقر فوق النوكليوتيدات الانفجار. قم بلصق تسلسل التمهيدي إدخال سلسلة الاستعلام.
    2. في المقطع اختيار مجموعة البحث ، انقر على الآخرين (nr إلخ)وتحديد تسلسل "الحمض النووي الريبي المرجع" (refseq_rna) في خيار قاعدة البيانات وحدد الكائن الحي (مثلاً، موس موسكولوس (taxid:10090) ) قصر التحليل على الأنواع المطلوبة.
    3. في اختيار البرنامج تحديد أمثلية تسلسل مشابهة إلى حد ما (بلاستن). في المقطع معلمات خوارزمية تقليص حجم كلمة وصولاً إلى 7 زيادة فرصة الحصول على عدد الزيارات.
  11. تصميم كبسولة تفجير انتقائية، تبقى فقط أولئك الذين تسلسل له على الأقل 3 حالات عدم التطابق مع كدناس غير مرغوب فيه عندما يكون ذلك ممكناً.
  12. ترتيب الإشعال ديسالتيد في تركيزات عالية نسبيا (مثلاً، 200 ميكرومتر) التأكد من أن جميع أجهزة الإشعال خارجي يمكن أن تكون مختلطة معا في تركيز نهائي من 1 ميكرومتر.

3-إعداد الكواشف RT

  1. 5 x ميكس RT: إعداد في المياه خالية من رناسي 400 ميليلتر من العامل RT مزيج محلول (5 س) يحتوي على كبسولة تفجير عشوائي في 25 ميكرومتر ودنتبس في كل 2.5 ملم. تخزين هذا المزيج العامل ك 20 ميليلتر مختبرين في 500 ميليلتر الأنابيب.
  2. 20 x ديثيوثريتول (DTT): إعداد 1 مل من 0.2 م DTT في رناسي مجانية المياه وتخزينها ك 50 ميليلتر مختبرين.
  3. تخزين 2500 يو من رناسي المانع (40 ش/ميليلتر) و 10,000 يو من المنتسخة العكسية (رتاسي، 200 يو/ميليلتر) ك 5 ميليلتر مختبرين.
  4. ضمان جودة مثلى من الكواشف RT، تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية. استخدامها لمدة تصل إلى 10 خلايا وفقط لمدة يوم واحد.

4-بكر التحقق من الصحة

  1. إعداد كدناس بالقيام نسخ عكسي على كمية كبيرة نسبيا من مجموع استخراج الحمض النووي الريبي (عادة 1 ميكروغرام)38 من الهيكل للفائدة.
    1. لا تستخدم الماصات مكرسة لواحد خلية RT-PCR للخطوات الأولية ولكن استخدام الماصات رناسي خالية. تمييع مجموع الجيش الملكي النيبالي وصولاً إلى 1 ميكروغرام/ميليلتر.
    2. في أنبوب PCR 500 ميليلتر، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي إجمالي المخفف و 8 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تؤذي في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتبرد الأنبوبة على الجليد.
    3. إضافة 4 ميليلتر من المخزن المؤقت 5 x RT تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة وميليلتر 4 RT ميكس الحل، 1 ميليلتر من رتاسي، 1 ميليلتر من مثبط رناسي و 1 ميليلتر من 200 ملم DTT (انظر القسم 3).
    4. نفض الغبار على أنبوب وأنها تدور، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. تخزين كدناس في-80 درجة مئوية لتصل إلى عدة سنوات. إعداد قاسمة كدناس المخفف إلى 1 نانوغرام/ميليلتر من مجموع الكشف المكافئة.
  2. خلط وتمييع كل زوج التمهيدي في 1 ميكرومتر مع الممصات مكرسة لخلية مفردة RT-PCR. استخدام 20 ميليلتر من كل التمهيدي مزيج 100 ميليلتر من تقارير إتمام المشروعات.
  3. على الجليد، والتحضير لكل زوج التمهيدي مواده التي تتضمن: المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 X المخزن المؤقت، 1 ميليلتر 100 x dNTPs (50 ميكرومتر في كل)، 500 – 1000 pg كدنا المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
  4. استخدام أنابيب PCR التي تناسب محكم آبار الجهاز PCR لعنصر تحكم درجة حرارة مثلى. إضافة 2 قطرات (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية إلى مواده دون لمس الجدار أو الحد الأقصى من الأنبوب PCR.
  5. للتقليل من التشكيل مبلمر، نفذ بداية ساخنة بوضع أنابيب PCR في ثيرموسيكلير قبل تسخينه عند 95 درجة مئوية. بعد 30 ثانية، بسرعة طرد 20 ميليلتر من ميكس التمهيدي على أعلى من النفط.
  6. بعد 3 دقائق عند 95 درجة مئوية، تشغيل دورات 40 (95 درجة مئوية، 30 s; 60 درجة مئوية، 30 s; 72 درجة مئوية، 35 s) تليها خطوة نهائية استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. تحليل 10 ميليلتر لكل منتجات PCR قبل [اغروس] هلام التفريد (2%، ووزن/حجم)39. إذا لم يكن لديك بعض منتجات PCR الحجم المتوقع، إعادة تصميم كبسولة تفجير أخرى (انظر القسم 2).
    تنبيه: اثيديوم بروميد هو مادة كيميائية إينتيركالاتينج التي يمكن أن تسبب طفرات الحمض النووي. استشارة مكتب السلامة المحلية قبل استخدامه. دائماً ارتداء قفازات عند التعامل مع ذلك. استخدام حل متاح تجارياً اثيديوم بروميد (10 مغ/مل) الحل بدلاً من مسحوق للتقليل من خطر استنشاق. وبالمثل، يمكن أن تكون ضارة الأشعة فوق البنفسجية، لذا تأكد من ارتداء نظارات السلامة حماية الأشعة فوق البنفسجية أو قناع. سحب المواد الهلامية المتسخة ونصائح وقفازات والمخزن المؤقت في الحاويات المخصصة للنفايات اثيديوم.
  8. بمجرد قد تم التحقق من جميع التمهيدي أزواج منفردة، اختبار بروتوكول متعدد (الشكل 3).
    1. خلط وتمييع جميع أجهزة الإشعال الخارجي معا في 1 ميكرومتر. متجر الإشعال متعدد مزيج في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أسابيع.
    2. على الجليد، وتعد القيمة التي تحتوي على: الماء (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 100 x dNTPs (50 ميكرون لكل منهما)، pg 500 – 1,000 من كدناس المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
    3. نفض الغبار على أنبوب بكر وأنها تدور، وإضافة نقطتين (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية.
    4. القيام ببداية ساخنة كما هو موضح في الخطوة 4، 5 مع 20 ميليلتر من ميكس التمهيدي متعدد. وبعد 3 دقائق عند 95 درجة مئوية، تشغيل 20 PCR دورات مماثلة لتلك الخطوة 4.6.
    5. إعداد عدد من أنابيب PCR متطابقة لعدد الجينات لتحليل. إعداد مواده كما هو الحال في الخطوة 4.8.2، ولكن باستخدام 1 ميليلتر من أول منتج PCR كل الجينات كقالب. ضبط كافة وحدات التخزين وفقا لعدد الجينات تحليلها والنظر في استخدام 10% حجم إضافي للتعويض عن أخطاء بيبيتينج.
    6. تهز بلطف وتدور الأنبوب وإرسال 80 ميليلتر من مواده في كل أنبوبة بكر وإضافة نقطتين (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية كل أنبوبة دون لمس الجدار أو الحد الأقصى من الأنابيب.
    7. أداء ساخنة ابدأ (راجع الخطوة رقم 4، 5) بطرد ميليلتر 20 من ميكس التمهيدي الداخلية إعدادها في الخطوة 4، 2. تشغيل 35 بكر دورات مماثلة للخطوة 4.6.
    8. تحليل منتجات PCR الثانية بالتفريد [اغروس] هلام. تأكد من أن كل بكر الثاني يولد amplicon من الحجم المتوقع. في حالة غير فعالة أو غير محدد إيضاحات مسهبة، إعادة تصميم كبسولة تفجير جديد (الخطوات 2.5 – 2.12) والتحقق من صحة عليها (الخطوات 4.2 – 4.8).

5-إعداد والتحقق من صحة الحل المشبك التصحيح داخل الخلايا

ملاحظة: بروتوكول التالية توضح الإعداد والتحقق/gluconate ك+أساس حل داخلي، ولكن يمكن استخدام تقريبا أي نوع من التصحيح-المشبك الحل طالما أنه لا يعوق كفاءة RT-PCR. ارتداء قفازات إلزامي للحصول على حل داخلي رناسي مجاناً.

  1. 60 مل من محلول تسجيل التصحيح-المشبك الداخلية، تعد اكستيمبورانيوسلي 10 مل من 0.1 م كوه.
  2. حل مغ 11.4 لعطا (النهائي 0.5 مم) في مل 0.9 م 0.1 كوه.
  3. إضافة 40 مل رناسي خالية من الماء وتذوب 2.02 ز من كغلوكونات (144 مم النهائي)، 143 مغ حبيس (النهائي 10 ملم)، وميليلتر 180 1 م MgCl2 (النهائي 3 مم).
  4. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2 بإضافة ~ 6 مل من 0.1 م كوه.
  5. ضبط الاسموليه لموسم 295 مع ~ 13 مل مياه خالية من رناسي.
  6. منذ حل داخلي يستخدم أيضا كمخزن مؤقت للنسخ العكسي، بعناية مراقبة تركيز Mg2 + . تعويض بملغ2 + تركيز أقل في حل داخلي بإضافة مجكل2 بعد ذلك للوصول إلى تركيز نهائي من 2 مم في رد فعل RT.
  7. لتسمية الخلية المقطوع بعد تسجيل التصحيح المشبك، إضافة 2 – 5 ملغ/مل بيوسيتين خالية من رناسي إلى الحل الداخلية المذكورة أعلاه (خطوات 5.1 – 5.5).
  8. تصفية (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) حل داخلي وتخزينها في-80 درجة مئوية، 100 – 250 ميليلتر مختبرين.
  9. للتحقق من صحة استخدام حل داخلي لخلية واحدة RT-PCR، إضافة 0.5 ميليلتر من مجموع الكشف المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر إلى ميليلتر 6 حل المشبك التصحيح وتركه على مقاعد البدلاء لمدة حوالي 30 دقيقة.
  10. مع ميكروبيبيتي 2 ميليلتر، إضافة 2 ميليلتر من 5 x RT-ميكس، 0.5 ميليلتر 20 x مادة الدي دي تي، 0.5 ميليلتر رناسي المانع، و 0.5 ميليلتر رتاسي، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  11. تدور الأنبوب. على الجليد إضافة المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
  12. إجراء دورات 40 من PCR باستخدام مجموعة من الإشعال المصادق عليها (الخطوات 4، 4، 4-6).
  13. تحليل منتجات PCR بالتفريد [اغروس] هلام (راجع الخطوة 4، 7)، والتحقق من أن لديهم الحجم المتوقع.
    ملاحظة: حذف 0.5 ميليلتر من مجموع الجيش الملكي النيبالي واستبدالها بالمياه خالية من رناسي 0.5 ميليلتر سيضمن أن الحل الداخلي خال من التلوث الحمض النووي الريبي و/أو الحمض النووي.

6-إعداد شريحة الحاد

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراء تشريح للأحداث (أيأقل من 28 يوما بعد الولادة) الفئران الذكور والإناث. حلول شاملة لقطاعات أخرى، مثل السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القائم على السكروز (قام) هي أيضا قابلة للاستخدام40.

  1. إعداد 2 لتر قام المحتوية على كلوريد الصوديوم 125، 2.5 (في مم) بوكل، 2 كاكل2، 1 MgCl2، 1.25 نة2بو4، 26 ناكو3، الجلوكوز 10 و 15 السكروز. للحد من نشاط جلوتاماتيرجيك أثناء إعداد شريحة، تعد حلاً قطع بإضافة 1 ملم حمض كينورينيك.
  2. قبل التقطيع، إعداد مجموعة مواد تشريح التي تحتوي على المقص الجراحي، مقص آيريس غرامة، ملاعق اثنين، الملقط، وقرص لتصفية الورق والغراء cyanoacrylate.
  3. استخدم الحل قطع الجليد مشبعة/CO س22 (95/5 ٪) وتهدئة قطع الدائرة في-20 درجة مئوية.
  4. تخدير الماوس مع منشفة ورقية صغيرة غارقة مع إيسوفلوراني. وبعد دقيقة ~ 2، تأكد من أن الماوس تحت التخدير العميق بالتحقق من عدم وجود استجابة مخلب قرصه.
  5. بسرعة قطع رأس الماوس. إزالة فروة الرأس وفتح الجمجمة. استخراج الدماغ بعناية ووضعها في كوب صغيرة مملوءة بالجليد الباردة (~ 4 درجة مئوية) الحل قطع اﻷوكسيجين مع/CO2س2.
  6. قم بإزالة قطع الدائرة من الشروط-20 درجة مئوية والرطوبة مع منشفة ورقية.
  7. تشريح الدماغ لعزل منطقة اهتمام والصقه في قاعة قطع وإضافة حل قطع الجليد اﻷوكسيجين مع س2/CO2بعناية.
  8. قطع 300 ميكرون شرائح سميكة استخدام فيبرتوم. نقلها في درجة حرارة الغرفة في غرفة استراحة مليئة بحل قطع اﻷوكسيجين والسماح لهم باستعادة لمالا يقل عن 0.5 ح.

7-وحيد الخلية RT-PCR بعد تسجيل التصحيح-المشبك

  1. تنظيف نظام التروية بانتظام مع ~ 100 مل من 30 ٪ ح2س2 الحل وشطف على نطاق واسع مع ~ 500 مل ماء المقطر لتجنب نمو البكتيريا، كما أنها مصدر التلوث رناسي التغاضي.
  2. تشلوريناتي خيوط مع ماصة تصحيح مليئة بالتبييض تتركز كل يوم الحصاد. لا تستخدم ميكروبيبيتي لملء الماصة التصحيح ولكن بدلاً من ذلك 20 ميليلتر طويلة، غرامة، ومرونة تلميح تعلق بحقنه 1 مل. ثم شطفة على نطاق واسع مع رناسي المياه مجاناً والجافة بخرقه غاز.
  3. إعداد مربع صغير من الثلج الذي يحتوي على 5 x ميكس RT و 20 x DTT مختبرين. تخزين مختبرين مثبط رتاسي ورناسي في-20 درجة مئوية في benchtop برودة.
  4. نقل شريحة في قاعة تسجيل perfused في 1-2 مل/دقيقة مع قام اﻷوكسيجين.
  5. سحب الماصات التصحيح (1 – 2 ميكرومتر فتح نصيحة القطر، MΩ 3-5) من زجاج البورسليكات أثناء ارتداء القفازات وملء أحد منهم مع 8 ميكروليتر من حل داخلي. ضع في اعتبارك أن المقابض ساحبة الماصة مصدر تلوث رناسي.
  6. مكان الماصة في حامل ماصة حين ارتداء القفازات الجديدة وعدم لمس الشعيرة بالاصابع.
  7. نهج ماصة التصحيح مع ضغط إيجابي، والقيام بتسجيل كامل الخلية لتحديد خصائص الخلية المستهدفة (الشكل 4).
  8. وحفاظا مرناس، الحد من الوقت في تكوين كل خلية إلى 20 دقيقة41.
  9. في نهاية التسجيل، إعداد أنبوب PCR 500 ميليلتر مليئة 2 ميليلتر 5 x ميكس RT و 0.5 ميليلتر من 20 x DTT، أنها تدور، وتخزينها على الجليد.
  10. حصاد السيتوبلازم الخلية عن طريق تطبيق ضغط سلبي لطيف (الشكل 4). تحكم بمحتوى الخلية يأتي من داخل ماصة مع المحافظة على ختم ضيق بصريا.
    1. تجنب بقدر الإمكان جمع النواة إذا اعتبر بعض الجينات أقل إنترون. وفي هذه حالة دائماً تتضمن مجموعة من الإشعال بهدف تضخيم جدنا للتحقيق للتلوث بالجينوم.
    2. إذا النواة قادمة قريبة من طرف الماصة، الإفراج عن الضغط السلبي ونقل ماصة بعيداً عن النواة. ضمان أن يتم الاحتفاظ بختم ضيق وإعادة جمع السيتوبلازم في الموقع الجديد ماصة.
  11. إيقاف حصاد عندما يقترب من أية مادة أخرى و/أو قبل أن يفقد ختم ضيق.
  12. سحب ماصة برفق لتشكيل على تصحيح من الخارج للحد من التلوث بالانقاض خارج الخلية (الشكل 4) ويؤيدون إغلاق غشاء الخلية لتحليل histochemical اللاحقة.
  13. نضع في اعتبارنا أن المقابض، ميكرومانيبولاتورس، ولوحة المفاتيح بالكمبيوتر، أو ماوس الكمبيوتر هي المصادر المحتملة للتلوث رناسي. إذا كانوا قد لمست أثناء التسجيل، قم بتغيير القفازات.
  14. إرفاقه الماصة اكسبيلير، وطرد محتواه في أنبوب PCR بتطبيق ضغط إيجابي (الشكل 1).
  15. اقتحام غيض ماصة أنبوب PCR للمساعدة في جمع محتواه.
  16. الطرد المركزي في الأنبوب بإيجاز، وإضافة 0.5 ميليلتر من مثبط رناسي و 0.5 ميليلتر من رتاسي، المزيج بلطف، الطرد المركزي مرة أخرى، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  17. تدور الأنبوب وتخزينها في-80 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر حتى تحليل PCR.
  18. نفذ الخطوة التضخيم الأولى مباشرة في أنبوب يحتوي على ميليلتر ~ 10 RT المنتجات عن طريق إضافة المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من المخزن المؤقت x 10، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو) من [تق] [بولمرس]. ثم اتبع الإرشادات المذكورة في الخطوات 4.8.2–4.8.8.

8-histochemical تلوين الخلية مسجل (اختياري)

  1. وعقب التسجيلات الكهربية، الحفاظ على شريحة لمدة 20 دقيقة في قام اﻷوكسيجين للسماح بنشر بيوسيتين في شجرة محواري والجذعيه.
  2. ضع الشريحة في بئر لوحة 24-جيدا ويكس أنه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% 0.1 متر العازلة الفوسفات.
  3. تغسل الشرائح 4 مرات، مدة كل منهما 5 دقائق مع 1 مل الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
  4. في نفس بيرميبيليزي جيدا، وتشبع الشريحة أثناء ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.25% تريتون الجيلاتين X-100 و 0.2 في المائة من أسماك المياه الباردة الجلد (برنامج تلفزيوني-GT).
  5. تبني بين عشية وضحاها مع عبدين مسمى فلوريسسينتلي المخفف في 1/400 في 250 – 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-gt.
  6. أغسل مرات 5، 5 دقائق، مع كل 1 مل من برنامج تلفزيوني وجبل الشرائح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 3عملية تحقق من صحة ممثل متعدد RT-PCR. تم تصميم البروتوكول للتحقيق في نفس الوقت التعبير عن 12 جينات مختلفة. VGluT1 الناقل غلوتامات حويصلية اتخذ كعنصر إيجابي ل الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك42. واستخدمت كعلامات جابايرجيك إينتيرنيورونس3،،من511غابا توليف الإنزيمات (GAD65 وجاد 67) Neuropeptide Y (نبي) وسوماتوستاتين (سوم). إنزيم السيكلواوكسيجيناز-2 (كوكس-2) كعلامة على3،السكان الفرعية16خلية الهرمية.

الوحدات الفرعية ATP1α1 3 نا+تم اختيارها لتقييم العلاقة بين نشاط الخلايا العصبية والأيضية الدول43/K+ ATPase والوحدات الفرعية Kir6.2 و SUR1 من قنوات ATP تراعي ك+ . منذ Kir6.2 جينات أقل إنترون، قد أدرج كعنصر تحكم الجينوم إنترون سوم. تم اختبار البروتوكول 1 نانوغرام من عكس يدون مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الماوس الجامع الدماغ، الذي يماثل تقريبا إلى وقائع 20 الخلايا44. بكر متعدد أنتجت أمبليكونس 12 من الحجم المتوقع (الشكل 3 و الجدول 1) مما يدل على حساسية وكفاءة من البروتوكول. مراقبة سلبية تؤدي بدون الجيش الملكي النيبالي إنتاج لا أمبليكون (البيانات لا تظهر).

خلية هرمي طبقة الخامس بصريا وحددت به سوما كبيرة وتغصن قمي بارز (الشكل 5A، اقحم). تسجيل خلية كله كشف الخصائص الكهربية نموذجي طبقة الخامس العادية التشويك الخلايا العصبية5،،من4546 ، لا سيما ومقاومة منخفضة مدخلات، وإمكانات العمل طويلة الأمد وسبايك وضوحاً التردد التكيف (الشكل 5A). وكشف التحليل الجزيئي للخلايا العصبية هذا التعبير عن vGluT1 (الشكل 5 (ب))، مؤكدا على النمط الظاهري جلوتاماتيرجيك42،46. كما أعرب عن هذه العصبية سوم، و ATP1α1، ومفارز 3 نا+/K+ أتباسي. وسم بيوسيتين من الخلايا العصبية المسجلة أكدت مورفولوجيا الهرمية (الشكل 5).

كما هو متوقع من الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك، كشف التحليل الجزيئي من 26 طبقة الخامس الخلايا الهرمية التعبير عن VGluT1، ولكن لم يكن أي من الازاميل اثنين (الشكل 5). ونادراً ما شوهدت علامات إينتيرنيورونس5،،من4246. لم يتم الكشف عن كوكس-2، أعرب أساسا بالطبقة الثانية-الثالث الخلايا الهرمية3،16، في طبقة الخلايا الهرمية الخامس. ATP1α1 ومفارز 3 كانت أكثر كثيرا ما لوحظ من وحدة فرعية ATP1α23. نادراً ما اكتشفت مفارز Kir6.2 و SUR1 في الخلايا العصبية الهرمية طبقة الخامس، وما يتسق مع التعبير عنها تفضيلية في الطبقات العليا3،43. وكان الحرص عدم حصاد الأنوية، أسفرت عن كشف نادرة من introns سوم (الخلايا 3 من أصل 26، أي12 في المائة).

Figure 1
الشكل 1: مربع مخصص لخلية مفردة RT-PCR. قائمة بالمواد محفوظة ل RT-PCR بعد التصحيح-المشبك. (1) الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج وطويلة (2) 20 ميليلتر، نصائح الجميلة ومرنة، (3) 20 ميليلتر ميكروبيبيتي، اكسبيلير (4) محلية الصنع، وأنابيب PCR ميليلتر (5) 500، ميليلتر مقاومة الهباء الجوي (6) 10 تصفية تلميحات وعلامات دائمة (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: استراتيجية تصميم التمهيدي PCR. (أ) التمثيل التخطيطي لتسلسل الترميز التي كدنا كوكس 2 الانحياز إلى تسلسل كروموسوم 2 الماوس التي تحتوي على الجين 2 كوكس. Exons تمثل المربعات السوداء وإينترونس على جدنا من المربعات البيضاء. ملاحظة الثغرات في كدنا المقابلة لتسلسل إينترونيك على جدنا. أمثلة من النوكليوتيد السيئة والجيدة التي مثلت كالسهام الحمراء والخضراء، على التوالي. الأسهم الأيمن والأيسر الدلالة الإشعال إلى الأمام وعكس. (ب) تسلسل والهياكل الثانوية من النوكليوتيد المبينة في (أ). اليمين واليسار لوحات تشير إلى تشكيل دبوس المتمتعة بالحكم الذاتي-التكامل والمتمتعة بالحكم الذاتي-ديمر، على التوالي. اليغنوكليوتيد B1 يعرض كلا دبوس قوي التكامل الذاتي وديمر تشكيل بينما اليغنوكليوتيد B2 فقط يظهر تشكيل ديمر. وقد النوكليوتيد B3 و B4 لا دبوس المتمتعة بالحكم الذاتي-التكامل وليس تشكيل ديمر؛ فهي أوفيرسبانينج إنترون (A)، وقد اختيرت الإشعال PCR المحتملة (انظر الجدول 1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التحقق من متعدد PCR. 1 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي من الماوس الجامع الدماغ تعرضت لنسخ عكسي متبوعاً بجولتين من [بكر] تضخيم. منتجات PCR 12 سويت في ممرات منفصلة من [اغروس] هلام التفريد بالتوازي مع Φx174 يهضم هايالثالث. منتجات PCR الثانية كانت أحجام (في شركة بريتيش بتروليوم) التي تنبأ بها التسلسل: 153 (vGluT1)، 248 (GAD65)، 255 (GAD67)، 181 (كوكس 2)، 220 (نبي)، 146 (SOM)، 183 (ATP1a1)، 213 (ATP1a2)، 128 (ATP1a3)، 342 (Kir6.2)، 211 (SUR1)، و 182 (سومint). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التصحيح-المشبك الحصاد في شرائح المخ. حالما يتم تحديد خلية بصريا، اقترب ماصة التسجيل مع ضغط إيجابي بغية تجنب تلوث الحطام الخلوية في التلميح الماصة. ملاحظة نقرة على الغشاء من هذه الخلايا العصبية. ثم انقطع الضغط الإيجابي من أجل تشكيل تكوين خلية المرفقة مع ختم ضيق جيجاوهم. وتطبق سوكشنز موجزاً للتبديل إلى تكوين كامل الخلية. في نهاية التسجيل، يتم حصاد السيتوبلازم عن طريق تطبيق ضغط سلبي لطيف إلى ماصة مع المحافظة على ختم ضيق. ملاحظة تقلص الجسم الخلية أثناء عملية الحصاد. ماصة التسجيل ثم تسحب برفق لتشكيل على تصحيح من الخارج، الذي يفضل إغلاق غشاء الخلية الوحي بيوسيتين اللاحقة، والحفاظ على المواد المحصودة في ماصة التصحيح. مستنسخة من كاولي ولامبوليز47 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: وصف طبقة الخامس الخلايا الهرمية نيوكورتيكال. (أ) غشاء الاستجابة المحتملة من خلية الهرمي الطبقة الخامس الناجم عن البقول الحالية من-100-40 و-10، + 60، 120، والسلطة الفلسطينية + 500 (آثار السفلي). الخلايا العصبية يعرض انحراف محتملة ضعيفة بعد الاستجابة الأولية هايبربولاريزينج (آثار العلوي). ردا على ديبولاريزيشن سوبراليمينال، خرج العصبية إمكانات العمل طويلة الأمد مع تطوير ببطء بعد فرط الاستقطاب (تتبع العلوي). القرب من التشبع، خرجوا بتردد منخفض العصبية ومعارضها للتكيف مع وضوحاً (تتبع الرمادية العلوية). داخلي: صور الأشعة تحت الحمراء من العصبية الهرمية طبقة مسجل الخامس. سطح بيل نحو الأعلى. شريط الحجم: 20 ميكرومتر. (ب) تحليل متعدد RT-PCR يكشف عن التعبير عن vGluT1، سوم، و ATP1α1، و ATP1α3. (ج) الشخصية التعبير الجيني في عينة 26 طبقة الخلايا الهرمية الخامس. وأعرب vGluT1 في جميع الخلايا العصبية في حين تم الكشف ابدأ عن GAD65 و GAD67 و COX2. ولوحظت نادراً ما نبي، سوم، Kir6.2، SUR1، واجتماع كبار المسؤولينint . الخلايا الهرمية وأعرب عن ATP1α3، وحدة فرعية 1 نا+/K+ أتباسي، و ATP1α2 بدرجة أقل. (د) أقصى كثافة الإسقاط من [كنفوكل] صور تظهر العلامات بيوسيتين من الخلايا العصبية سجلت في (أ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

جين/رقم بنك الجينات كبسولة تفجير خارجي الحجم (bp) كبسولة تفجير داخلي الحجم (bp)
vGlut1
NM_182993		 معنى،-113 259 معنى،-54 153
جكتككتتتتكتجججكتاك أتكجكاجككاكاججتكت
مكافحة الشعور، 126 مكافحة الشعور، 79
ككاجككجاكتككجتكتاج تجكاجكاججتاتجتجاك
GAD65
NM_008078		 معنى, 99 375 معنى, 219 248
ككاااجتكاكججكج كاككتجكجاككااااكككت
مكافحة الشعور، 454 مكافحة الشعور، 447
تككتككاجاتتتجكجتج جاتتتجكجتجتكتجكك
GAD67
NM_008077		 معنى، 529 598 معنى, 801 255
تاكجججتكجكاكاجتك كككاجاجتجاجاكاااجك
مكافحة الشعور، 1109 مكافحة الشعور، 1034
كككاجكاجكاتككاكات آتجكتككجتااكاجتكجتجك
كوكس 2
NM_011198		 معنى, 199 268 معنى، 265 181
كتجاجكككاككككااكاك آكاكاتككككتككتجكج
مكافحة الشعور، 445 مكافحة الشعور، 426
ككتاتتكككتكاكاكككات تججاجتججكاجتكاتكت
نبي
NM_023456		 معنى, 16 294 معنى, 38 220
كجاتجججكتجتجتجا كككتكجكتكتاتكتكتجكتكجت
مكافحة الشعور، 286 مكافحة الشعور، 236
آجتتتكاتتكككاتكاككاكات جكجتتتكتجتجكتتككتكا
سوم
NM_009215		 معنى, 43 208 معنى, 75 146
أتكجتككتجكتتججك جكككتكجاككككاجاكت
مكافحة الشعور، 231 مكافحة الشعور، 203
جككتكاتكتكجتككتجكتكا جكااتككتكججكتككا
ATP1Α1
NM_144900 		معنى، 1287 288 معنى، 1329 183
كاججكاجتجتتكاجكتا تاجكججكاجتاجكجج
مكافحة الشعور، 1556 مكافحة الشعور، 1492
ككجتجاجاجاتجاجك أجتجتتججكتكاجاتجك
ATP1Α2
NM_178405		 معنى، 1392 268 معنى, 1430 213
أجتجاجاجاتجاججاكاج آآتككككتكاكتككاككا
مكافحة الشعور، 1640 مكافحة الشعور، 1623
أكاجاجكككاجكاكتكجت جتككككاجتككتكككاجك
ATP1Α3
NM_144921		 معنى، 127 216 معنى، 158 128
كجااتاكاتاكتجاكتجكجتج تجاكاكاكاجتااجكككاجا
مكافحة الشعور، 324 مكافحة الشعور، 264
جتكاتككتككجتكككتجكك ككاكاجكاجاتاجاجاجككا
Kir6.2
NM_010602		 معنى, 306 431 معنى, 339 342
كجاجاججكاككاتجت كاتككاكتككتتتكاتكتجكك
مكافحة الشعور، 719 مكافحة الشعور، 663
كاكككاكجككاتكتككا تكجججكتجتجتكتج
SUR1
NM_011510		 معنى, 1867 385 معنى، 2041 211
كاجتجتجككككككجاجاج أتكاتكجاجكتكتكاكك
مكافحة الشعور، 2231 مكافحة الشعور، 2231
جتكتكتكككتكجكتجتكتج جتكتكتكككتكجكتجتكتج
سومنت
X51468		 معنى, 8 240 معنى, 16 182
كتجتكككككتاكجاتككك كتاكجاتكككككاجككت
مكافحة الشعور، 228 مكافحة الشعور، 178
ككاجكاككاججاتاجاجكك تجااجككاججاجاكت

الجدول 1. تسلسل من الأولى والثانية [بكر] كبسولة تفجير. يتم إعطاء موقف كل التمهيدي بكر وعلى تسلسل من 5 'إلى 3'. باستثناء إنترون سوماتوستاتين، يطابق الموضع 1 قاعدة أول كودون بداية من كل الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وحيد الخلية متعدد RT-PCR بعد التصحيح-المشبك يمكن موثوق بها وفي الوقت نفسه التحقيق أكثر من 30 من الجينات في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتطلب كفاءة عالية [بكر] كبسولة تفجير. واحدة من الخطوات التي تحد آخر جمع لمحتوى الخلية. فعاليتها تعتمد على قطر طرف ماصة التصحيح، التي يجب أن تكون كبيرة بقدر الإمكان مع مطابقة حجم الخلية. ثبت الممصات التي يبلغ قطرها 1-2 ميكرومتر تلميح مفتوحة تكون ملائمة لأنواع الخلايا العصبية أكثر. من الضروري أيضا التأكد من أن يتم تجميع المحتوى الخلوية فقط، وليس الأنسجة المحيطة بها. ويتحقق ذلك عن طريق التحكم اليكتروفيسيولوجيكالي الحفاظ على ختم ضيق خلال موسم الحصاد. تشكيل لتكوين التصحيح من الخارج أثناء انسحاب ماصة كذلك يحمي السيتوبلازم المقطوع من الحطام الخلوية. معدل النجاح من خلية مفردة متعدد RT-PCR يعتمد أيضا على وفرة مرناس من نوع الخلية التحقيق. على سبيل المثال، الغلة التي تم الحصول عليها مع أستروسيتيس، التي تعبر عن مرناس في كميات منخفضة نسبيا3، هو عموما أقل من التي تم الحصول عليها مع الخلايا العصبية، ومما يتطلب زيادة حجم العينة15،16. النسخ العكسي، التي لديها من كفاءة منخفضة في أنابيب48، هو رد فعل تحد وحيد الخلية متعدد RT-PCR. ولذلك من المهم استخدام أعلى جودة المواد الكاشفة، تخزينها كمختبرين في-80 درجة مئوية، واستخدامها فقط لمدة يوم واحد. وأخيراً، نشاط بوليميراز الدنا رتاسي غالباً ما مصدر التغاضي عن تشكيل التمهيدي-ديمر. ولمعالجة هذه المسألة، أداء بداية ساخنة مع الإشعال أمر بالغ الأهمية لزيادة كفاءة التضخيم. وباﻹضافة إلى هذا سيقلل من تأثير المثبطة رتاسي على نشاط بوليميراز "الدنا بوليميراز"49.

تقنية RT-PCR متعدد الخلية الواحدة تنوعاً عاليا. وقد استخدمت على نطاق واسع في القوارض10،11،13،،من1920،34،،من5051،52 53، ،54 ولكن يمكن تكييفها وفقا للنماذج الحيوانية كلها تقريبا والجينات على افتراض أن تسلسل الجين والأنسجة متوفرة. يمكن استخدام العديد من الحلول المشبك التصحيح طالما أنها لا تتداخل مع RT-PCR في الخلية فحوصات مجانية. فعلى سبيل المثال كانت الحلول الداخلية على أساس ك+ أو الكاتيونات Cs+ أو Cl– أو غلوكونات المستخدمة بنجاح6،36،،من4155.

نتائج سلبية كاذبة الكلاسيكية تنبع من تلوث رناسي الشعيرة ماصة التصحيح و/أو حل المشبك التصحيح الداخلية. تشلوريناتينج خيوط بعناية والتحقق من صحة الحل الداخلية عموما حل هذه المشكلة. كما يمكن أن يحدث نتائج سلبية كاذبة عندما يتم التعبير عن جينات على مستوى منخفض من خلية مفردة، حيث يتم حصادها إلا نسبة من السيتوبلازم. ويمكن زيادة جودة الحصاد باستخدام الماصات الكبيرة و/أو خفض وقت تسجيل كامل الخلية. ويمكن تقييم حصاد الجودة بها بما في ذلك جين معروف للتعبير عنها على مستوى منخفض في الخلايا المفردة20. يمكن أن تحدث نتائج إيجابية كاذبة مع نوعية سيئة الأنسجة، الذي مقدار تلوث الحطام الخلوية عالية. يتم اختبار وجود الحطام قبل إدراج الشريحة ماصة تصحيح دون إجراء أي ختم والإفراج عن الضغط الإيجابي قبل إزالة ماصة. ثم يتم سبر وجود مواد أمبليفيابل بتعدد الإرسال RT-PCR42. وقد استخدمت أيضا سيلانيزينج ماصة التصحيح للحد من المجموعة من الملوثات خارج الخلية56. هو خلية مفردة بكر تقنية حساسة للغاية التي يمكن الكشف عن أقل من نسخة واحدة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل57. وفي حالة أقل إنترون الجينات، جدنا الواردة في النواة يمكن أيضا أن تنتج إيجابيات كاذبة. تجنب جمع جدنا عن طريق وضع ماصة بعيداً عن النواة أثناء الحصاد يساعدك على حل هذه المشكلة. يمكن أن يكون وجود جدنا سبر موثوق بتضخيم تسلسل إينترونيك25.

الكشف عن جزيئات مرناً ب RT-PCR يصبح لا يمكن الاعتماد عليها في نسخ 1044، يفترض أنه بسبب انخفاض كفاءة رتاسي48، ويمكن أن يؤدي إلى تحت الكشف عن محاضر منخفضة-وفرة26،42. يمكن أن يكون هذا مشكلة في حالة الجينات إنترون-أقل. في الواقع، تجنب الحصاد نواة يقلل من كمية السيتوبلازم التي يمكن جمعها وحساسية الكشف عن ذلك. المزيج من خلية واحدة RT-PCR بعد التصحيح-المشبك بوصفها بيوسيتين يتطلب الإبقاء قدر الإمكان على شكل الخلية (الشكل 3). لا محالة، وهذا يقلل كمية المواد التي يمكن جمعها، مما يقلل من معدل النجاح. حلاً وسطا بين مجموعة السيتوبلازم والحفاظ على مورفولوجيا الخلايا إلزامي.

خلية واحدة متعدد RT-PCR البيانات غير الكمية كما أنها تعطي فقط معلومات حول ما إذا كانت كدناس موجودة أو غائبة في المواد التي تم جمعها. ومع ذلك، بسبب حدود الكشف الوارد وصفها أعلاه، يمكن أن يعكس حدوث الكشف على مستوى السكان وفرة الجينات على مستوى الخلية الواحدة. تسمح نهج بديلة لتوليد المزيد من البيانات الكمية، ولكن القيود التقنية التي تفرضها استراتيجياتها التضخيم المحددة (أي، التحديد الكمي النسبي للجينات مثلى أو RT qPCR) إلى حد كبير الحد من عدد تحليل الجينات التي يمكن أن تكون في نفس الوقت41،53،55،،من5859،60،،من6162،63 64، ،،من6566. مزيج الأخيرة من تسجيلات المشبك التصحيح وخلية مفردة رناسيق، يشار إلى التصحيح seq30،31، يسمح تحليل كمي ترانسكريبتوميك الخلايا تتميز اليكتروفيسيولوجيكالي. ونهج جديدة وواعدة، بعد فإنه يتطلب الحصول على التعاقب الفائق وتتطلب البيانات الناتجة من التحليل مضيعة للوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر الدكتور ألكسندر مروة على تعليقاته على المخطوطة. بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحث (ANR الملز 2011 003 01؛ ANR-15-CE16-0010 والوكالة الوطنية للمعلومات-17-CE37-0010-03)، رقم معتمد من قبل الزمالة من صب مؤسسة بحوث sur la الزهايمر. ونحن نشكر مرفق الحيوان من إيببس (باريس، فرنسا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series - 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series - 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series - 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13 (2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Tags

علم الأعصاب، 136 قضية، الشخصية التعبير الجيني، والخلايا العصبية، أستروسيتيس، شرائح المخ، التكوين كامل الخلية، متداخلة البلمرة المتسلسل (PCR)
خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet,… More

Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter