Summary
Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.
Abstract
Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules présentant des caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires différents. Cette diversité entrave faciliter l’identification et la caractérisation de ces types de cellules, prérequis pour étudier leurs fonctions spécifiques. Cet article décrit le Protocole multiplex unicellulaire transcription réverse polymérase PCR (RT-PCR), qui permet de détecter simultanément l’expression de plusieurs dizaines de gènes dans une seule cellule, après enregistrement en tranches, patch clamp. Cette méthode simple peut être implémentée avec caractérisation morphologique et est largement applicable pour déterminer les caractéristiques phénotypiques de divers types de cellules et de leur environnement cellulaire particulière, comme dans les environs de vaisseaux sanguins. Le principe de ce protocole est d’enregistrer une cellule avec la technique de patch clamp, de récolter et d’inverser transcrire son contenu cytoplasmique, et de déceler qualitativement l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes par multiplex PCR. Elle nécessite une conception soignée des amorces de PCR et intracellulaire patch-clamp de la solution compatible avec la RT-PCR. Afin d’assurer une transcription sélective et fiable detection, cette technique requiert également des contrôles appropriés de cytoplasme récolte aux étapes de l’amplification. Bien que nous discutées des précautions doivent être strictement respectées, pratiquement n’importe quel laboratoire électrophysiologique peut utiliser la cellule technique RT-PCR multiplexe.
Introduction
Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules impliquées dans divers processus physiologiques. Leur identification et leur caractérisation, une condition préalable à la compréhension de leurs fonctions spécifiques, peuvent être très difficiles étant donné la grande diversité morphologique, physiologique et moléculaire qui caractérise les cellules corticales types1 ,2,3,4.
Single-cell RT-PCR multiplex repose sur la combinaison de patch clamp et techniques de RT-PCR. Il peut sonder simultanément l’expression de plus de 30 gènes prédéfinis dans les cellules identifiées rhinophore5. L’inclusion d’un traceur neuronale dans la pipette d’enregistrement supplémentaires permet la caractérisation morphologique des cellules enregistrés après la révélation histochimiques6,7,8,9, 10. c’est une technique très utile pour la classification des types neurones basée sur une analyse multivariée de leurs caractères phénotypiques5,9,10,11,12 ,13,14. Monocellulaire de RT-PCR multiplex est également adapté à la caractérisation des cellules non neuronales comme les astrocytes15,16,17et peut être appliqué de manière pratiquement à chaque cerveau structure18, 19,20,21,22,23 et cellule de type, en supposant qu’ils peuvent être enregistrés dans la configuration de la cellule entière.
Cette technique est très pratique pour l’identification des sources cellulaires ou cibles de transmission systèmes7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, surtout quand les anticorps spécifiques font défaut. Il s’appuie sur des enregistrements de patch clamp de cellules identifiées visuellement29et donc permet également le ciblage des cellules dans un environnement cellulaire spécifique8,15,16. En outre puisque la cytoarchitecture du tissu cérébral est conservé dans des tranches de cerveau, cette approche permet également l’étude des relations anatomiques des cellules caractérisés avec éléments neuronaux et non neuronales7,8 , 18.
Puisque cette technique est limitée par la quantité de cytoplasme récolté et de l’efficacité de la RT, la détection des ARNm exprimée au nombre de copies basse peut être difficile. Bien que les autres approches basées sur la technologie RNaseq permettent d’analyser le transcriptome entière de cellules individuelles3,4,30,31, dont ils ont besoin les coûteux séquenceurs haut débit pas nécessairement disponible pour chaque laboratoire. Étant donné que la technique de RT-PCR multiplexe unicellulaire utilise PCR point final, il suffit de thermocycleurs largement disponibles. Il peut être facilement développé dans des laboratoires équipés avec des configurations électrophysiologiques et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il peut fournir, dans la journée, une analyse qualitative de l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes. Ainsi, cette approche offre un accès facile à la caractérisation moléculaire des cellules individuelles d’une manière rapide.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales chez l’animal a eu lieu en stricte conformité avec les règlements Français (Code Rural R214/87 à R214/130) et sont conformes à l’éthique professionnelle de la Communauté économique européenne (86/609/CEE) et la Charte nationale Français sur l’éthique de l’expérimentation animale. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique de Charles Darwin et soumis au Ministère Français de l’éducation et de la recherche (approbation 2015 061011367540). L’animalerie de couples est accrédité par les autorités Français (A75-05-24).
1 Considérations préliminaires
Remarque : Pour éviter les contaminations, conforme aux recommandations suivantes avant de cellule unique entreprise RT-PCR après patch clamp.
- Ne pas utiliser les plasmides contenant des gènes d’intérêt en laboratoire car ils sont une source potentielle de contamination.
- Réserver un banc de laboratoire de la chambre d’électrophorèse sur gel pour préparer les RFT.
- Dédiez un ensemble des pipettes et des pointes à filtre aérosols résistants à manipuler l’ADN et l’ARN à des concentrations inférieures à 1 ng/µL. Jamais les utiliser pour analyser les produits PCR.
- Toujours utiliser des produits exempts de RNase et de DNase et porter des gants.
- Utilisez dédiés produits chimiques pour la préparation des solutions internes patch clamp. Ne jamais utiliser une spatule mais plutôt un poids papier pour peser des poudres.
- Utiliser une électrode pH dédiés et solutions étalons de pH, car ils peuvent être une source de contamination (par exemple, RNase).
- Capillaires en verre de borosilicate magasin ; 20 conseils de longue, fine et souple µL ; une micropipette de 20 µL ; un expulseur artisanale (support pipette patch clamp attaché à une seringue de 10 mL) ; 500 µL PCR tubes ; 10 µL aérosol résistant aux bouts filtrants ; et mince des marqueurs permanents dans une zone dédiée (Figure 1).
2. amorces
Notez : RT-PCR Multiplex repose sur deux étapes de l’amplification. Au cours de la première PCR, tous les gènes d’intérêt sont conjointement amplifiés en mélangeant toutes les amorces PCR. Pour détecter de manière fiable les transcriptions de cellules individuelles, il est essentiel de concevoir des amorces PCR sélectives et efficaces. L’utilisation des amorces (internes) imbriqués pour le deuxième tour des PCR améliore la spécificité et l’efficacité de l’amplification.
- Récupérer les séquences d’ADN messagère organisée de gènes d’intérêt dans la base de séquences de référence NCBI32 ainsi que ceux de leur famille connexe (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
- Entrez le nom du ou les gènes et les espèces d’intérêt en tant que requête et cliquez sur la séquence pertinente récupérée.
- Pour limiter l’analyse à la séquence codante de la gène (s), cliquez sur Envoyer à (en haut à droite) et sélectionnez les séquences codantes et FASTA nucléotides comme format. Cliquez ensuite sur Créer un fichier et enregistrer la séquence FASTA utilisant une extension de fichier « .nt ».
- Utilisez MACAW logiciel33 (Construction d’alignement Multiple & Analysis Workbench) ou tout autre logiciel d’alignement multiple pour déterminer les régions d’homologie.
- Cliquez sur fichier de | Nouveau projet... et sélectionnez le type de séquence ADN . Pour importer les séquences de gène, sélectionnez séquence | Importer la séquence... et de charger un fichier « .nt ». Répétez l’opération pour toutes les séquences connexes.
- Cliquez et faites glisser toutes les séquences dans la fenêtre schématique pour sélectionner les séquences entières.
- Recherchez les régions d’homologie en sélectionnant alignement | Recherche de blocs... (CTRL + S). Sélectionnez la paire de Segment se chevauche dans la Méthode de recherche. Ajuster le Pairwise score seuil à une valeur relativement élevée (par exemple, 1 000) et la seqs. min. par bloc et le nombre total de séquences pour aligner et cliquez sur commencer.
- Dans la fenêtre de Résultat de la recherche qui apparaît, sélectionnez le résultat (s) par le plus haut score MP et cliquez sur le lien. Si aucun résultat n’est trouvé, diminuer la Pairwise score seuil et/ou la seqs. min. par bloc.
- Pour faciliter la visualisation des régions homologues, sélectionnez alignement | Ombrage | Score moyen.
- Sélectionner des parties non couplés des séquences et répétez les 2.2.3–2.2.4 étapes pour déterminer éventuellement les autres régions d’homologie avec une MP-note inférieure.
- Pour obtenir les amorces plus spécifiques, sélectionnez les régions où l’homologie de séquence le moins.
- Récupérer les séquences de tous les variants d’épissage et répétez les étapes 2.2.1–2.2.6. Sélectionner leurs régions communes pour une détection globale. Envisager d’autres cassettes pour épissure dédié variantes analyses20,34,35,36.
- Aligner les séquences d’ADN messagère sur le génome de modèle animal à l’aide de génomes de37 BLAST (base Local Alignment Search Tool) pour déterminer la structure de l’intron-exon des gènes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
- Sélectionnez le génome de souris BLAST en cliquant sur la souris et téléchargez la séquence FASTA récupérée dans la section de la Séquence requête entrée . Dans la Sélection des programmes, sélectionnez l’option optimiser pour des séquences très similaires (megablast), puis cliquez sur le bouton BLAST .
- Dans la section Description , sélectionnez l’alignement avec l’identité plus élevée (jusqu'à 100 %). S’assurer qu’elle correspond au gène d’intérêt comme il est indiqué dans les caractéristiques de la section des alignements .
- Trier l’alignement de la position de début de requête dans la même section pour obtenir la succession exons de la séquence codante. Notez les positions de début et de fin de toutes les réponses qui correspondent en gros à la position des introns sur la séquence requête (Figure 2 a).
- Sélectionnez deux exons différents pour les amorces sens et anti-sens de différencier facilement cDNA de génomique amplification de l’ADN (génomique) basée sur un critère de taille (Figure 2).
Remarque : L’amplification de l’ADNg peut survenir à une fréquence faible lorsque le noyau est récolté avec le cytoplasme. Ainsi, il est essentiel de concevoir l’intron overspanning paires d’amorces (Figure 2 a). Dans le cas de gènes de l’intron-moins, la collection du noyau est problématique, car elle peut conduire à la confusion potentiellement les résultats. Pour résoudre ce problème, comprendre une série d’amorces visant à amplifier une séquence intronic pour détecter la présence de l’ADNg25. Si le contrôle de génomique est positif, les résultats de tous les gènes de l’intron-moins il faut éliminer. - Pour obtenir une amplification efficace, sélectionnez amorces générant des amplicons d’une longueur idéalement comprise entre 200 et 400 paires de bases (Figure 2).
- Pour amplifier simultanément divers ADNc pendant l’étape PCR multiplexe, concevoir des amorces d’une longueur comprise entre 18 et 24 nucléotides et une température de fusion (Tm) entre 55 et 60 ° C.
- Pour minimiser la formation de structures secondaires, qui réduisent le rendement de l’amplification, sélectionnez sens et anti-sens amorces avec un minimum en épingle à cheveux et duplex longueurs (Figure 2 b).
- Concevoir des amorces internes en utilisant les mêmes critères (pas 2,5 à 2,8).
- Vérifier la spécificité des amorces PCR en alignant les amorces sur la base de séquence ARN de référence de l’organisme d’intérêt à l’aide d’un nucléotide BLAST.
- Dans BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), cliquez sur nucleotide BLAST. Coller la séquence d’un apprêt à la Séquence requête entrée.
- Dans la section Choisissez Rechercher ensemble , cliquez sur d’autres (nr etc.), sélectionnez les séquences d’ARN de référence (refseq_rna) dans l’option de base de données et spécifier l’organisme (p. ex., Mus musculus (taxid:10090) ) de restreindre l’analyse à l’espèce désirée.
- Dans la Sélection du programme sélectionnez optimiser des séquences assez semblables (blastn). Dans la section paramètres de l’algorithme , réduire la taille du mot jusqu'à 7 pour augmenter les chances d’obtenir des hits.
- Pour concevoir des amorces sélectives, garder seulement ceux dont la séquence est au moins 3 désadaptation avec des ADNc indésirables lorsque cela est possible.
- Commander des amorces de morue dessalées à une concentration relativement élevée (par exemple, 200 µM) pour s’assurer que tous les apprêts externes peuvent être mélangés à une concentration finale de 1 µM.
3. préparation des réactifs de RT
- 5 x RT-mix : préparer dans de l’eau exempte de RNase 400 µL de solution de mélange de RT (x 5) contenant des amorces aléatoires à 25 µM et dNTPs à 2,5 mM de chaque travail. Conserver ce mélange de travail 20 µL d’extraits dans des tubes de 500 µL.
- 20 x le dithiothréitol (DTT) : préparer 1 mL de 0,2 M TNT en RNase-libre de l’eau et stocker en tant que 50 µL d’extraits.
- Store 2 500 U d’inhibiteur de RNase (40 U/µL) et 10 000 U de la transcriptase inverse (RTase, 200 U/µL) comme 5 µL d’extraits.
- Afin d’assurer une qualité optimale, les réactifs de RT, stocker les aliquotes à-80 ° C. Utilisez-les pour jusqu'à 10 cellules et seulement pour un jour.
4. PCR Validation
- Préparer des ADNc en faisant une transcription renversée sur une quantité relativement importante de l’ARN (typiquement 1 µg) extrait total38 de la structure d’intérêt.
- Ne pas utiliser les pipettes dédiées pour single cell RT-PCR pour ces étapes préliminaires, mais utiliser les pipettes de la RNase-libre. Diluer l’ARN total à 1 µg/µL.
- Dans un tube de PCR 500 µL, ajouter 1 µL d’ARN total dilué et 8 µL d’eau exempte de RNase. Dénaturation à 95 ° C pendant 1 min et refroidir le tube sur la glace.
- Ajouter 4 µL de tampon de 5 x RT fournie par le fabricant, 4 µL de solution de mélange de RT, 1 µL de RTase, 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL de 200 mM TNT (voir Section 3).
- Glissement du tube, le tourner et incuber une nuit à 37 ° C.
- Stocker les ADNc à-80 ° C pendant jusqu'à plusieurs années. Préparer une partie aliquote d’ADNc diluées à 1 ng/µL d’équivalents d’ARN totales.
- Mélanger et diluer chaque paire d’amorces à 1 µM avec les pipettes dédiés à cellule unique RT-PCR. Utilisez 20 µL de chaque mélange amorces pour 100 µL PCRs.
- Sur la glace, préparer pour chaque paire d’amorce un prémélange contenant : eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon 1 µL de 100 x dNTPs (50 µM chacun), 500 – 1 000 pg de l’ADNc dilué à 1 ng/µL et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
- Utiliser des tubes PCR qui correspondent étroitement à des puits de la machine PCR pour un contrôle optimal de la température. Verser 2 gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale dans le prémélange sans toucher le mur ou le bouchon du tube PCR.
- Pour minimiser la formation de dimères-apprêt, effectuez un démarrage à chaud en plaçant les tubes PCR dans le thermocycleur préchauffé à 95 ° C. Après 30 s, expulser rapidement 20 µL du mélange primer sur le dessus de l’huile.
- Après 3 min à 95 ° C, effectuez des cycles de 40 (95 ° C, 30 s, 60 ° C, 30 s ; 72 ° C, 35 s) suivie d’une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 5 min.
- Analyser les 10 µL de chaque produits PCR en gel d’agarose gel électrophorèse (2 %, poids/volume)39. Si certains produits PCR n’ont pas la taille attendue, re-conception autres amorces (voir Section 2).
ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un produit chimique intercalant qui peut induire des mutations de l’ADN. Consulter le Bureau de la sécurité locale avant de l’utiliser. Toujours porter des gants pour manipuler. Utilisez une solution de la solution (10 mg/mL) du bromure d’éthidium au lieu de la poudre pour minimiser le risque d’inhalation. De même, lumière UV peut être nocive, alors assurez-vous de porter des lunettes de protection UV protection ou un masque. Retirer les gels souillés, conseils, gants et tampon en conteneurs dédiés aux déchets d’éthidium. - Une fois que toutes les paires d’amorces ont été validés individuellement, tester le Protocole multiplex (Figure 3).
- Mélanger et diluer tous les apprêts externes ensemble à 1 µM. entreposer les amorces multiplexes mélangent à-20 ° C pendant jusqu'à plusieurs semaines.
- Sur la glace, préparer un prémélange contenant : eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon, 1 µL de 100 x dNTPs (50 µM de chacun), 500 – 1 000 pg d’ADNc dilués à 1 ng/µL et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
- Glissement du tube PCR, tourner et ajouter deux gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale.
- Effectuer un démarrage à chaud comme indiqué au point 4.5 avec 20 µL du mélange amorces multiplex. Après 3 min à 95 ° C, exécutez 20 cycles PCR identiques à celles de l’étape 4.6.
- Préparer un certain nombre de tubes PCR identiques au nombre de gènes à analyser. Préparer un prémélange comme étape 4.8.2, mais à l’aide de 1 µL du premier produit PCR par gène en tant que modèle. Ajuster tous les volumes selon le nombre de gènes à analyser et à envisager d’utiliser 10 % de volume supplémentaire pour compenser les erreurs de pipetage.
- Remuez délicatement, faites tourner le tube, envoyer 80 µL de prémélange dans chaque tube PCR et ajouter deux gouttes (~ 100 µL) d’huile minérale par tube sans toucher le mur ou au plafond des tubes.
- Effectuer un chaud commencer (voir étape 4.5) en expulsant 20 µL du mélange amorces internes préparées à l’étape 4.2. Effectuez des cycles PCR 35 identique à étape 4.6.
- Analyser les deuxième produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Assurez-vous que chaque deuxième PCR génère un amplicon de la taille attendue. Dans le cas des amplifications inefficaces ou non spécifiques, re-conception de nouvelles amorces (étapes 2.5 – 2.12) et les validera (étapes 4.2 – 4,8).
5. préparation et Validation de la Solution de Patch-clamp intracellulaire
Remarque : Le protocole suivant décrit la préparation et validation d’un /gluconate K+basés sur la solution interne, mais pratiquement n’importe quel type de patch-clamp de la solution peut être utilisé tant qu’il ne fasse pas obstacle à l’efficacité de la RT-PCR. Port de gants est obligatoire pour l’obtention d’une solution interne sans RNase.
- Pour 60 mL de solution d’enregistrement interne patch-clamp, préparer extemporanément 10 mL de 0,1 M KOH.
- Dissoudre 11,4 mg de EGTA (finale de 0,5 mM) à 0,9 mL de 0,1 M KOH.
- Ajouter 40 mL de RNase-libre d’eau et dissoudre 2,02 g de K-gluconate (144 mM final), 143 mg de HEPES (10 mM final) et 180 µL de 1 M du MgCl2 (3 mM final).
- Ajuster le pH à 7,2 en ajoutant environ 6 mL de 0,1 M KOH.
- Ajuster l’osmolarité à 295 mOsm ~ 13 ml d’eau exempte de RNase.
- Puisque la solution interne est également utilisée comme un tampon pour la transcriptase inverse, contrôler soigneusement la concentration de Mg2 + . Compenser une concentration plus faible Mg2 + dans la solution interne en ajoutant du MgCl2 par la suite pour atteindre une concentration finale de 2 mM dans la réaction de RT.
- Pour spécifier que la cellule récoltée après enregistrement patch clamp, ajouter 2 à 5 mg/mL de la biocytine RNase-libre à la solution interne décrite ci-dessus (étapes 5.1 – 5,5).
- Filtrer (0,22 µm taille de pore) la solution interne et conserver à-80 ° C sous le nom de 100 – 250 µL d’extraits.
- Pour valider l’utilisation de la solution interne pour single-cell RT-PCR, ajouter 0,5 µL d’ARN total dilué à 1 ng/µL à 6 µL de solution de patch clamp et laisser sur le banc pendant environ 30 min.
- Avec une micropipette 2 µL, ajouter 2 µL de 5 x RT-mix, 0,5 µL du DDT x 20, inhibiteur de RNase 0,5 µL et 0,5 µL RTase et incuber une nuit à 37 ° C.
- Tourner le tube. Sur la glace ajouter de l’eau (q.s., 80 µL), 10 µL de 10 X tampon et 0,5 µL (2,5 U, 5 U/µL) de la Taq polymérase.
- Effectuer 40 cycles de PCR à l’aide d’une série d’amorces validés (étapes de 4,4 à 4,6).
- Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose (voir étape 4.7) et vérifier qu’ils ont la taille attendue.
Remarque : En omettant les 0,5 µL d’ARN total et son remplacement par l’eau sans RNase 0,5 µL veillera à ce que la solution interne est exempte de contaminations RNA et/ou de l’ADN.
6. préparation de tranches aiguë
Remarque : Ce protocole décrit la procédure de tranchage pour mineur (c'est-à-diremoins de 28 jours après la naissance) souris mâles et femelles. Autres solutions de découpe, comme base de saccharose artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) sont également utilisables40.
- Préparer 2 L de FSCA contenant (en mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 Glucose et saccharose 15. Pour réduire l’activité glutamatergique au cours de la préparation de tranches, préparer une solution de découpe en ajoutant 1 mM d’acide kynurénique.
- Avant de trancher, préparer une trousse de dissection contenant ciseaux iris fine, deux spatules, pinces, ciseaux chirurgicaux, un disque de papier filtre et colle cyanoacrylate.
- Utilisez coupe glacée solution saturée d’O2/co2 (95/5 %) et le refroidissement de la chambre de coupe à-20 ° C.
- Anesthésier la souris avec un petit papier essuie-tout imbibé d’isoflurane. Après environ 2 min, assurez-vous que la souris est sous anesthésie profonde en vérifiant l’absence de réponse à la patte de pincement.
- Rapidement décapiter la souris. Enlever le cuir chevelu et ouvrir le crâne. Extraire le cerveau avec soin et le placer dans un petit bécher rempli d’une solution coupe glacée (~ 4 ° C) oxygénée avec O2/co2.
- Enlever la chambre de coupe des conditions de-20 ° C et l’humidité avec une serviette en papier.
- Soigneusement disséquer le cerveau pour isoler la zone d’intérêt, collez-la sur la chambre de coupe et ajouter la coupe glacée solution oxygénée avec O2/co2.
- Couper des tranches épaisses de 300 µm en utilisant un vibratome. Transférez-les dans une chambre de repos remplie de solution de découpe oxygéné à température ambiante et leur permettre de récupérer pendant au moins 0,5 h.
7. seule cellule RT-PCR après enregistrement Patch-clamp
- Le système de perfusion régulièrement avec ~ 100 mL de solution de 30 % H2O2 et rincer abondamment avec de ~ 500 mL d’eau distillée pour éviter la croissance de bactéries, comme c’est une source de contamination de la RNase.
- La chloration du filament avec une pipette de patch remplie d’eau de Javel concentré chaque jour de récolte. Ne pas utiliser une micropipette pour remplir la pipette mais plutôt un 20 µL longue, fine et souple embout attaché à une seringue de 1 mL. Ensuite, rincer abondamment à l’eau libre de RNase et séchez-le avec un chiffon de gaz.
- Préparer une petite boîte de glace contenant 5 x RT-mix et 20 x DTT aliquotes. Stocker les aliquotes inhibiteur RTase et RNase à-20 ° C dans un refroidisseur de benchtop.
- Transférer une tranche dans la chambre d’enregistrement perfusée à 1 à 2 mL/min avec FSCA oxygéné.
- Tirez les pipettes de patch (1 à 2 µm ouvrir le diamètre de bout, MΩ de 3 – 5) en verre borosilicate avec des gants et remplir l’un d’eux avec 8 μL de solution interne. N’oubliez pas que les boutons de l’extracteur de pipette sont une source de contamination de la RNase.
- Placez la pipette dans le porte-pipette tout en portant des gants neufs et ne touche ne pas le filament avec les doigts.
- Approcher la pipette avec une pression positive et effectuer l’enregistrement de cellules entières afin de caractériser les cellules ciblées (Figure 4).
- Afin de préserver les ARNm, limiter le temps en configuration cellule entière à 20 min41.
- À la fin de l’enregistrement, préparer un tube PCR de 500 µL rempli avec 2 µL de 5 x RT Mix et 0,5 µL de 20 x DTT, pivoter et placez-le sur la glace.
- Récolter le cytoplasme de la cellule en appliquant une légère pression négative (Figure 4). Contrôle visuellement que le contenu de la cellule comprend à l’intérieur de la pipette tout en conservant une bonne étanchéité.
- Éviter autant que possible, recueillir le noyau si certains gènes d’intron-moins sont considérés. Dans ce cas toujours inclure une série d’amorces visant à amplifier l’ADNg pour détecter la contamination génomique.
- Si le noyau est venue près de la pointe de la pipette, relâcher la pression négative et placer la pipette loin du noyau. S’assurer que le joint étanche est préservé et redémarrer pour collecter le cytoplasme dans le nouvel emplacement de la pipette.
- Arrêter la récolte lorsque aucun matériau plus n’est à venir et/ou avant de perdre le joint étanche.
- Retirer la pipette doucement pour former un patch extérieur-out de limiter la contamination par les débris extracellulaire (Figure 4) et de favoriser la fermeture de la membrane cellulaire pour des analyses histochimiques subséquentes.
- Gardez à l’esprit que les boutons, micromanipulateurs, clavier d’ordinateur, ou la souris d’ordinateur sont des sources potentielles de contamination de la RNase. Si ils ont été touchés lors de l’enregistrement, les changer.
- Attacher la pipette à l’expeller et expulser son contenu dans le tube PCR en appliquant une pression positive (Figure 1).
- Casser l’embout de la pipette dans le tube PCR pour aider à la collection de son contenu.
- Brièvement Centrifuger le tube, ajouter 0,5 µL d’inhibiteur de RNase et 0,5 µL de RTase, mélanger doucement, centrifuger à nouveau et incuber une nuit à 37 ° C.
- Tourner le tube et le stocker à-80 ° C pendant plusieurs mois jusqu'à l’analyse PCR.
- Effectuer la première étape d’amplification directement dans le tube contenant le ~ 10 µL de produits RT en ajoutant de l’eau (q.s., 80 µL), 10 µL de tampon de x 10 et 0,5 µL (2,5 U) de la Taq polymérase. Ensuite, suivez les instructions décrites dans la procédure 4.8.2–4.8.8.
8. coloration histochimique de la cellule enregistrée (en option)
- Après les enregistrements électrophysiologiques, maintenir la tranche de 20 min en oxygéné FSCA pour permettre la diffusion de la biocytine dans l’arborescence axonal et dendritique.
- Placer la tranche dans un puits d’une plaque 24 puits et fix il nuit à 4 ° C avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % à 0,1 M tampon Phosphate.
- Laver les tranches 4 fois, 5 min chacun, avec 1 mL de Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Dans le même bien, permeabilize et saturer la tranche pendant 1 h à température ambiante avec 1 mL de PBS additionné de gélatine de X-100 et de 0,2 % de Triton 0,25 % de peau de poisson d’eau froide (PBS-GT).
- Incuber pendant la nuit avec une avidine fluorescent étiqueté diluée au 1/400 à 250 – 500 µL de PBS-GT.
- Laver 5 fois, 5 min chacun, avec 1 mL de PBS et monter les tranches.
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Representative Results
Une validation représentative de RT-PCR multiplex est illustrée à la Figure 3. Le protocole a été conçu pour sonder simultanément l’expression des gènes différents 12. Le vGluT1 du transporteur vésiculaire glutamate a été pris comme un témoin positif de neurones glutamatergiques42. Le GABA de synthèse des enzymes (GAD65 et GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) et la somatostatine (SOM) ont été utilisés comme marqueurs de GABAergique interneurones3,5,11. L’enzyme cyclo-oxygénase-2 (COX-2) a été utilisé comme marqueur des cellules pyramidales sous-population3,16.
ATP1α1-3 sous-unités de la Na+/k+ ATPase et les sous-unités Kir6.2 et SUR1 des canaux sensibles à l’ATP K+ ont été choisies pour évaluer la relation entre l’activité neuronale et États métaboliques43. Kir6.2 étant un gène sans intron, l’intron SOM a été incluse comme un contrôle de la génomique. Le protocole a été testé sur 1 ng de l’inverse transcrit ARN total extrait de cerveau entier de souris, ce qui correspond environ à la transcription de 20 cellules44. La PCR multiplex produit des 12 amplicons de la taille attendue (Figure 3 et tableau 1) démontrant la sensibilité et l’efficacité du protocole. Le contrôle négatif effectué sans RNA ne produit aucun amplicon (données non présentées).
Un neurone pyramidal de la couche V a été identifié visuellement par ses grand soma et une dendrite apicale proéminente (Figure 5 a, encart). Enregistrement de germes entiers a révélé des propriétés électrophysiologiques typiques de la couche V ordinaire de fortification neurones5,45,46 avec, notamment, une faible résistance d’entrée, les potentiels d’action longue durée et spike prononcé adaptation de fréquence (Figure 5 a). L’analyse moléculaire de ce neurone a révélé l’expression de la vGluT1 (Figure 5 b), confirmant son glutamatergique phénotype42,46. Ce neurone a également exprimé SOM, ATP1α1 et 3 sous-unités de la Na+/k+ ATPase. La biocytine étiquetage des neurones enregistrés confirmé une morphologie pyramidale (Figure 5).
Comme prévu depuis les neurones glutamatergiques, l’analyse moléculaire des cellules pyramidales de la couche V 26 a révélé expression de VGluT1, mais ni les deux GADs (Figure 5). Marqueurs d’interneurones ont été rarement observés5,42,46. COX-2, principalement exprimées par couche II-III cellules pyramidales3,16, n’a pas été détecté dans les cellules pyramidales de la couche V. La ATP1α1 et 3 sous-unités ont été plus fréquemment observées à la sous-unité de ATP1α23. Les sous-unités Kir6.2 et SUR1 sont rarement détectées dans neurones pyramidaux de la couche V, qui est conforme à leur expression préférentielle dans les couches supérieures3,43. On a veillé ne pas de récolter les noyaux, ce qui entraîne une détection rare des introns SOM (cellules 3 des 26, soit12 %).
Figure 1 : zone dédiée d’une cellule unique RT-PCR. Liste des matières réservées aux RT-PCR après patch clamp. (1) capillaires en verre borosilicaté, long (2) 20 µL, pointes fines, souples, (3) 20 µL micropipette, expeller (4) faits maison, tubes PCR (5) 500 µL, pointes à filtre aérosol résistant (6) 10 µL et marqueurs (7) permanents. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : stratégie de conception des amorces PCR. (A) Représentation schématique de la séquence codante de l’ADNc de COX 2 alignée à la séquence du chromosome 2 souris contenant le gène COX 2. Exons sont représentés par des boîtes noires et les introns sur ADNg de cases blanches. Notez les lacunes de l’ADNc correspondant aux séquences intronic sur ADNg. Exemples représentatifs d’oligonucléotides mauvaises et bonnes représentées par des flèches rouges et vertes, respectivement. Flèches droite et gauche correspondent aux amorces et inverses. (B) des séquences et des structures secondaires des oligonucléotides montrés en (A). Panneaux gauche et droit indiquent la formation self-complémentarité et auto-dimère en épingle à cheveux, respectivement. L’oligonucléotide B1 affiche les deux une forte épingle self-complémentarité et dimère formation alors que l’oligonucléotide B2 ne montre que la formation de dimères. Les oligonucléotides fois B3 et B4 ont aucune épingle self-complémentarité et aucune formation de dimères ; ils sont intron overspanning (A) et ont été choisis comme amorces potentielles (voir tableau 1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Validation de PCR multiplex. 1 ng d’ARN total de cerveau entier de souris a été soumis à une transcription inverse suivie de deux tours de l’amplification par PCR. Les 12 produits PCR ont été résolus dans des couloirs séparés par électrophorèse sur gel d’agarose en parallèle avec Φx174 digérée par HaeIII. Les produits PCR deuxième avaient des tailles (en PB) prédites par les séquences : 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1) et 182 (SOMint). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Patch-clamp de la récolte dans des tranches de cerveau. Une fois qu’une cellule est identifiée visuellement, la pipette d’enregistrement est abordée avec une pression positive pour éviter toute contamination des débris cellulaires à l’extrémité de la pipette. Notez la cavité sur la membrane de ce neurone. Pression positive est alors interrompue afin de former une configuration cellule-attachée avec un joint étanche Gigaohm. Brefs succions sont appliquées pour passer en configuration cellule entière. À la fin de l’enregistrement, le cytoplasme est récolté en appliquant une légère pression négative dans la pipette tout en conservant le joint étanche. Note le rétrécissement du corps cellulaire au cours de la procédure de récolte. La pipette de l’enregistrement est ensuite délicatement retirée pour former un patch extérieur-out, ce qui favorise la fermeture de la membrane cellulaire pour la révélation de la biocytine ultérieures et la préservation de matériel de récolte dans la pipette. Reproduit de Cauli et Lambolez47 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : caractérisation des cellules pyramidales néocorticales couche V. (A) Membrane de réaction potentielle d’une cellule pyramidale de la couche V induite par des impulsions de courant -100 -40, -10, + 60, + 120 et + 500 pA (traces de fond). Le neurone affiche une faible déviation potentielle après l’intervention initiale hyperpolarisante (traces supérieures). En réponse à une dépolarisation supraliminaires, le neurone déchargé des potentiels d’action durables avec se développant lentement après-hyperpolarisation (trace en haut). Près de saturation, le neurone déchargée à une faible fréquence et présentait une adaptation prononcée (trace grise supérieure). Encart: les images infrarouges du neurone pyramidal enregistré couche V. La surface pial est à la hausse. Barre d’échelle : 20 µm (B) RT-PCR Multiplex analyse révélant l’expression de vGluT1, SOM, ATP1α1 et ATP1α3. (C) profil d’expression génique dans un échantillon de 26 couches V cellules pyramidales. vGluT1 a été exprimé dans tous les neurones tandis que GAD65, GAD67 et COX2 n’étaient jamais détecté. NPY, SOM, Kir6.2, SUR1 et SOMint ont été rarement observés. Cellules pyramidales expriment ATP1α3, 1 sous-unité de la Na+/k+ ATPase et ATP1α2 dans une moindre mesure. Maximum (D) projection d’intensité des images confocales montrant la biocytine étiquetage du neurone enregistré en (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Gène / GenBank nombre | Amorces externes | Taille (bp) | Amorces internes | Taille (bp) | ||
| vGlut1 NM_182993 |
Sens, -113 | 259 | Sens, -54 | 153 | ||
| GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC | ATTCGCAGCCAACAGGGTCT | |||||
| Anti-sens, 126 | Anti-sens, 79 | |||||
| CCAGCCGACTCCGTTCTAAG | TGGCAAGCAGGGTATGTGAC | |||||
| GAD65 NM_008078 |
Sens, 99 | 375 | Sens, 219 | 248 | ||
| CCAAAAGTTCACGGGCGG | CACCTGCGACCAAAAACCCT | |||||
| Anti-sens, 454 | Anti-sens, 447 | |||||
| TCCTCCAGATTTTGCGGTTG | GATTTTGCGGTTGGTCTGCC | |||||
| GAD67 NM_008077 |
Sens, 529 | 598 | Sens, 801 | 255 | ||
| TACGGGGTTCGCACAGGTC | CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC | |||||
| Anti-sens, 1109 | Anti-sens, 1034 | |||||
| CCCAGGCAGCATCCACAT | AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC | |||||
| COX 2 NM_011198 |
Sens, 199 | 268 | Sens, 265 | 181 | ||
| CTGAAGCCCACCCCAAACAC | AACAACATCCCCTTCCTGCG | |||||
| Anti-sens, 445 | Anti-sens, 426 | |||||
| CCTTATTTCCCTTCACACCCAT | TGGGAGTTGGGCAGTCATCT | |||||
| MP : NM_023456 |
Sens, 16 | 294 | Sens, 38 | 220 | ||
| CGAATGGGGCTGTGTGGA | CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT | |||||
| Anti-sens, 286 | Anti-sens, 236 | |||||
| AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT | GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA | |||||
| SOM NM_009215 |
Sens, 43 | 208 | Sens, 75 | 146 | ||
| ATCGTCCTGGCTTTGGGC | GCCCTCGGACCCCAGACT | |||||
| Anti-sens, 231 | Anti-sens, 203 | |||||
| GCCTCATCTCGTCCTGCTCA | GCAAATCCTCGGGCTCCA | |||||
|
ATP1Α1 NM_144900 |
Sens, 1287 | 288 | Sens, 1329 | 183 | ||
| CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA | TAAGCGGGCAGTAGCGGG | |||||
| Anti-sens, 1556 | Anti-sens, 1492 | |||||
| CCGTGGAGAAGGATGGAGC | AGGTGTTTGGGCTCAGATGC | |||||
| ATP1Α2 NM_178405 |
Sens, 1392 | 268 | Sens, 1430 | 213 | ||
| AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG | AAATCCCCTTCAACTCCACCA | |||||
| Anti-sens, 1640 | Anti-sens, 1623 | |||||
| ACAGAAGCCCAGCACTCGTT | GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC | |||||
| ATP1Α3 NM_144921 |
Sens, 127 | 216 | Sens, 158 | 128 | ||
| CGGAAATACAATACTGACTGCGTG | TGACACACAGTAAAGCCCAGGA | |||||
| Anti-sens, 324 | Anti-sens, 264 | |||||
| GTCATCCTCCGTCCCTGCC | CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA | |||||
| Kir6.2 NM_010602 |
Sens, 306 | 431 | Sens, 339 | 24 S | ||
| CGGAGAGGGCACCAATGT | CATCCACTCCTTTTCATCTGCC | |||||
| Anti-sens, 719 | Anti-sens, 663 | |||||
| CACCCACGCCATTCTCCA | TCGGGGCTGGTGGTCTTG | |||||
| SUR1 NM_011510 |
Sens, 1867 | 385 | Sens, 2041 | 211 | ||
| CAGTGTGCCCCCCGAGAG | ATCATCGGAGGCTTCTTCACC | |||||
| Anti-sens, 2231 | Anti-sens, 2231 | |||||
| GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | |||||
| SOMint X51468 |
Sens, 8 | 240 | Sens, 16 | 182 | ||
| CTGTCCCCCTTACGAATCCC | CTTACGAATCCCCCAGCCTT | |||||
| Anti-sens, 228 | Anti-sens, 178 | |||||
| CCAGCACCAGGGATAGAGCC | TTGAAAGCCAGGGAGGAACT | |||||
Tableau 1. Les séquences des amorces PCR de premier et deuxième. La position de chaque amorce PCR et leurs séquences sont donnés de 5' à 3'. À l’exception de l’intron de la somatostatine, la position 1 correspond à la première base du codon start de chaque gène.
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Discussion
Single cell RT-PCR multiplex après que patch clamp peut sonder, simultanément et de manière fiable, l’expression de plus de 30 gènes dans les cellules identifiées rhinophore5. Analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique nécessite des amorces PCR hautement efficaces. Une des étapes plus limitants est la collection de contenu de la cellule. Son efficacité dépend du diamètre de l’embout de la pipette de patch, qui doit être aussi large que possible tout en correspondant à la taille de la cellule. Pipettes avec un diamètre de bout ouvert 1 à 2 µm ont été prouvés pour convenir à des types plus neuronales. Il est également essentiel de s’assurer que seul le contenu cellulaire est recueilli et pas les tissus environnants. Ceci est réalisé en contrôlant rhinophore la préservation d’un joint étanche pendant les vendanges. La formation d’une configuration de patch extérieur-out lors du retrait de la pipette plus protège le cytoplasme récolté de débris cellulaires. Le taux de réussite de la cellule unique RT-PCR multiplex dépend aussi de l’abondance ARNm du type cellulaire étudié. Par exemple, le rendement obtenu avec les astrocytes, qui expriment les ARNm en quantités relativement faibles de3, est généralement inférieur à celui obtenu avec les neurones et nécessite donc augmenter la taille d’échantillon,15,16. La transcriptase inverse, qui a une faible efficacité en tubes48, est la réaction limite du single cell RT-PCR multiplex. Il est donc essentiel d’utiliser des réactifs de qualité supérieure, de les stocker sous forme de parties aliquotes à-80 ° C et de les n'utiliser que pour une journée. Enfin, l’activité de l’ADN polymérase de la RTase est souvent une source de formation de dimères amorce. Pour résoudre ce problème, effectuer un démarrage à chaud avec des amorces est essentiel pour accroître l’efficacité de l’amplification. En outre, cela réduira l’effet inhibiteur du RTase sur la Taq DNA polymérase activité49.
La technique de RT-PCR multiplexe unicellulaire est très polyvalente. Il a été largement utilisé dans les rongeurs10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,,du5354 mais peut être adapté aux modèles pratiquement tous les animaux et les gènes en supposant que les séquences de tissu et de gène sont disponibles. Diverses solutions de patch clamp peuvent être utilisées tant qu’ils n’interfèrent pas avec la RT-PCR sur des essais gratuits de cellules. Par exemple des solutions internes basées sur K+ ou Cs+ cations, Cl– ou gluconate ont été utilisés avec succès6,36,41,55.
Des résultats faussement négatifs classiques proviennent de contamination RNase du filament pipette patch et/ou solution interne patch clamp. Soigneusement le filament de chloration et de valider la solution interne généralement résolvent ce problème. Des résultats faussement négatifs peuvent également survenir lorsqu’un gène est exprimé à un niveau faible unicellulaire, puisque seule une partie du cytoplasme est récoltée. La qualité de récolte peut être augmentée à l’aide de pipettes plus gros et/ou en réduisant le temps de l’enregistrement de la cellule entière. Qualité de la récolte peut être évaluée en incluant un gène appelé à s’exprimer à un niveau bas en cellules individuelles20. Des résultats faussement positifs peuvent se produire avec une qualité de tissu mauvais, dans lequel la quantité de débris cellulaires de contamination est élevée. Tester la présence de débris se fait en insérant une pipette de correctif dans la tranche sans effectuer tout scellement et en relâchant la pression positive avant le retrait de la pipette. La présence de matériaux amplifiables est ensuite sondée par de RT-PCR multiplex42. Silaniser la pipette a également été utilisé pour réduire la collection des contaminants extracellulaire56. Monocellulaire PCR est une technique très sensible qui peut détecter aussi peu qu’une seule copie du double brin ADN57. Dans le cas des gènes de l’intron-moins, l’ADNg contenue dans le noyau peut aussi produire des faux positifs. Évitant la collection de gDNA en plaçant la pipette loin du noyau lors de la récolte contribue à résoudre ce problème. La présence d’ADNg peut être sondée fiable en amplifiant une séquence intronic25.
La détection de molécules d’ARNm par RT-PCR devient peu fiable à 10 exemplaires44, probablement en raison de la faible efficacité des RTase48et peut conduire à une sous détection des transcriptions de faible abondance26,,42. Cela peut être problématique dans le cas des gènes de l’intron-moins. En effet, en évitant la récolte du noyau réduit la quantité de cytoplasme qui peut être collecté et, par conséquent, la sensibilité de détection. La combinaison de single-cell RT-PCR après patch clamp avec la biocytine étiquetage exige que la forme de la cellule est maintenue autant que possible (Figure 3). Inévitablement, cela réduit la quantité de matériel pouvant être collectées, ce qui réduit le taux de réussite. Un compromis entre le cytoplasme collecte et la conservation de la morphologie des cellules est obligatoire.
Données de RT-PCR multiplexes unicellulaires ne sont pas quantitatives, car ils donnent seulement des informations si ADNc sont présents ou absents dans le matériel recueilli. Toutefois, en raison des limites de détection décrites ci-dessus, l’apparition de détection au niveau des populations peut refléter l’abondance des gènes au niveau de la cellule unique. Approches alternatives permettent la génération de données quantitatives plus, mais les contraintes techniques imposées par leurs stratégies d’amplification spécifique (c.-à-d.quantification relative des gènes homologues ou RT-qPCR) largement limitent le nombre de les gènes qui peuvent être simultanément analysé41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. L’Association récente des enregistrements de patch clamp et seule cellule RNaseq, dénommé Patch-seq30,31, permet analyse transcriptomique quantitative des cellules rhinophore caractérisée. C’est une approche nouvelle et prometteuse, mais cela nécessite un accès à haut débit séquenceurs et les données générées requièrent une analyse de votre temps.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Alexandre Mourot pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003 ; ANR-15-CE16-0010 et ANR-17-CE37-0010-03), BLG est pris en charge par la bourse de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Nous remercions l’animalerie de le couples (Paris, France).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
| BT10 Series - 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
| BT20 Series - 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
| BT200 Series - 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
| BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
| ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
| EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
| Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
| Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
| 5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
| Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |
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