Summary
כאן, אנו מתארים את אינדוקציה של תסמונת נפרוטית ניסויי בעכברים 129S1/SvImJ על ידי זריקה retrobulbar מהירה של דוקסורוביצין. נתייחס גם עכברים נפרוטית עם שחרור מתמשכת כדורי המכיל aprotinin לעכב את השתן סרין פרוטאז פעילות ולמנוע נתרן השמירה.
Abstract
תסמונת נפרוטית הביטוי הקיצוני ביותר של מחלת כליות proteinuric, המאופיין פרוטאינוריה כבד, hypoalbuminemia, בצקת עקב השמירה נתרן, היפרליפידמיה. ללמוד הפתופיזיולוגיה של תסמונת זו, מכרסם פותחו מודלים בהתבסס על ההזרקה של חומרים רעילים כמו דוקסורוביצין גרימת נזק podocyte. בעכברים, רק כמה זנים רגישים למודל זה. בעכברים 129S1/SvImJ wildtype, הממשל של דוקסורוביצין בזריקה תוך ורידי מהירה אל הסינוס retrobulbar גורם תסמונת נפרוטית ניסיוני הכולל כל הסימפטומים של מחלות אנושיות כולל שימור נתרן של בצקת. לאחר תחילתה של פרוטאינוריה, השתן סרין פרוטאז פעילות שמוביל ההפעלה של נתרן אפיתל ערוץ (ENaC) ושמירה נתרן מוגברת עכברים בנספח. עיכוב תרופתי של השתן סרין פרוטאזות על ידי הטיפול עם שחרור מתמשכת aprotinin abrogates ההפעלה ENaC ומונעת נתרן השמירה. מודל זה הינו אידיאלי ללמוד הפתופיזיולוגיה של proteasuria, כלומר., הפרשה של פעיל סרין פרוטאזות הגורמות ENaC ההפעלה על-ידי proteolysis של שלה γ-יחידה משנית. זה יכול היה להיחשב המנגנון העיקרי של הפעלת ENaC ושמירה נתרן במחלת כליות proteinuric.
Introduction
תסמונת נפרוטית מאופיין פרוטאינוריה כבד, hypoalbuminemia, בצקת, היפרליפידמיה, יכול היה להיחשב הביטוי הקיצוני ביותר של מחלת כליות proteinuric. בחולדות, תסמונת נפרוטית הניסיונית יכולה להיגרם על ידי זריקה אחת של anthracyclines או puromycin אשר מוביל לפגיעה podocyte, דומה האדם שינויים מזעריים ומחלת glomerulosclerosis סגמנטלי מוקד (FSGS)1. לאחר תיאור הראשון שלה בשנת 1955 על ידי פרנק ואח. 2, puromycin nucleoside מיתרים ממחלת כליות (PAN) בחולדות הפך מודל סטנדרטי לחקור הפתופיזיולוגיה של תסמונת נפרוטית אינספור מחקרים3,4,5,6. בעכברים, המודל המתאים יכולה להיגרם על ידי דוקסורוביצין anthracycline7. עם זאת, יש זן-תלות חזקה גנטית, שנקבעה על ידי לפחות שני אתרים המקודדים גנטי8. בנוסף, קיימים הבדלים ב תגובה proteinuric ו כמובן של תסמונת נפרוטית9,10. באמצעות מהירה תוך ורידיות דוקסורוביצין ועכברים 129S1/SvImJ דרך הסינוס retrobulbar, פרוטאינוריה תגובות להגיע ערכים שאינם מספיק כדי לגרום את תכונות אופייניות של תסמונת נפרוטית, במיוחד שמירה אחסון המאופיינת על ידי מיימת, כמעט ללא נתרן בשתן7. אצירת נתרן תסמונת נפרוטית ניסיוני בחזקת להיות התוצאה של הפעלת של תעלת נתרן אפיתל (ENaC) בתוך צנורית דיסטלי מאת המסוננות aberrantly סרין פרוטאזות כגון פלסמין גורם proteolysis של שלה γ-יחידה משנית4 11, ,12. לאחרונה, המושג הזה הוכח בעכברים נפרוטית אשר היו מוגנים מפני הפעלת ENaC הפרוטאוליטי ושמירה נתרן על ידי טיפול עם aprotinin מעכב של סרין פרוטאז זה היה יעיל באותה מידה כמו ENaC חוסם amiloride13. כדי להבטיח משלוח. צנורית דיסטלי רציף, aprotinin היה מנוהל באמצעות כדורי subcutaneously מושתל שחרור מתמשכת. מחקרים עתידיים נדרשים לזהות סרין פרוטאזות האחראים להפעלת ENaC הפרוטאוליטי תסמונת נפרוטית המניחים מקבילי המצב האנושי. למטרה זו, תסמונת נפרוטית דוקסורוביצין-induced הוא מודל ערך שניתן להשתמש בפראי-סוג עכברים או התרחב עכברים מהונדסים גנטית. היתרונות כוללים עלות נמוכה של הסם, המורכבות נמוך יותר של ניהול טוב הפארמצבטית14.
במאמר זה נדגים את אינדוקציה של תסמונת נפרוטית ניסיוני מהירה תוך ורידיות דוקסורוביצין אל הסינוס retrobulbar, השרשה של שחרור-מתמשכת כדורי המכיל aprotinin לעכב השתן סרין פרוטאז פעילות כפי שנמדד עם וזמינותו הדפסות כסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות נערכו על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך עבור הטיפול, השימוש של חיות מעבדה והחוק הגרמני לרווחתם של בעלי חיים, הן אושרו על ידי רשויות מקומיות (Regierungspräsidium טיבינגן).
1. אינדוקציה של תסמונת נפרוטית ניסיוני בזריקה דוקסורוביצין אל הסינוס Retrobulbar
- להכין מזרק 0.5 mL עם בצינורית 30G הנטען על ידי סימון המיקום stop של הבוכנה.
- חישוב נפח הזרקה של דוקסורוביצין עבור זכר (7.25 µL/גרם משקל (bw) שווה ל- 14.5 µg/g bw דוקסורוביצין) ועכברים הנשי (µL 6.9/g bw שווה ל- 13.8 דוקסורוביצין bw µg/g) לפי משקל הגוף מן הבוקר.
הערה: המינון נתון מתאימה עבור אינדוקציה של תסמונת נפרוטית. שינויים קלים במינון להוביל קורס שונה מכריע של כלייתית להגיע ממחלת כליות כרונית קלה עם שינויים קטנים בלבד במחיר glomerular סינון (12.6 µg/g bw דוקסורוביצין) (15.4 µg/g bw דוקסורוביצין) אי ספיקת כליות חריפה7, 15. - חממו את הסכום המחושב של דוקסורוביצין פתרון (2 µg/µL) תא חם 37 º C.
התראה: דוקסורוביצין מזיק אם בלע, יכול לגרום לסרטן. תמיד ללבוש כפפות אם עובד עם דוקסורוביצין, הימנע מכל מגע העור. - Prefill את המזרק עם דוקסורוביצין פתרון עד נקודת סימון ולהגדיר את האיזון אפס. . תמלא את המזרק עם נפח הזרקה, בדוק את עוצמת הקול על-ידי שקילה את המזרק.
- Narcotize בעכבר עמוקות עם כרך 5% איזופלוריין באמצעות מכשיר אידוי זרימת חמצן 2 ל'/min.
- אל תשתמש משחה על העיניים לפני הזריקה. המפעיל צריך תצוגה ברורה של חלל מסלולית עבור ביצוע זריקת retrobulbar מוצלחת ובטוחה.
- להעריך את רמת ההרדמה על-ידי רפלקס פדלים ולהתאים הרדמה משלוח במידת הצורך לפני תחילת ההזרקה.
- למקם את העכבר recumbency הימנית גבו מול הגוף של המפעיל, ראשה פונה על ידי הזרקה של המפעיל.
הערה: התהליך מתואר אדם ימני, עבור אנשים שמאליים ביצוע ההזרקה עם יד שמאל זה קל יותר לעשות את המיקום והשאיר הזרקת הפוך הזכות. - בזהירות בולטות השמאלי גלגל העין של העכבר של ארובת העין על ידי הפעלת לחץ עדין על העור, הגבי ו הגחון לעין.
- לנקב הסינוס retrobulbar השמאלי של זווית העין הפנימית (commissure palpebral המדיאלי). להימנע מכל מגע עם גלגל העין mouse´s.
- מעט להטות את המזרק, להזריק בכל אמצעי האחסון בבת אחת. ודא כי אמצעי האחסון מוזרק ללא התנגדות וללא סימנים של extravasation כגון exopthalmus או זליגות ההזרקה.
- מאז דוקסורוביצין הוא חומר רעיל מאוד, לבדוק רווחה לפחות פעם ביום באמצעות גיליון הניקוד לפי. מורטון, גריפיתס et al. 16 ו לשלם תשומת לב מיוחדת ההזרקה. אם סימנים של extravasation כמו exopthalmus, סגירת העפעף לקוי או סימני נמק כמו קורות נגעים בעור או נפיחות לאחר ההזרקה או בימים הבאים, צריך להיות מורדמים העכבר.
2. ההשתלה של שחרור-מתמשכת כדורי המכיל Aprotinin
- להזמין כדורי עם המינון הרצוי לכל משך היום. ומשחררים מראש. במקרה של aprotinin, לבחור מינון של 1 מ ג ליום להשתחרר במשך 10 ימים.
הערה: במחקר זה, כדורי aprotinin מכילים מינון של 10 מ ג.- לאחסן את כדורי בתנאים יבשים ולהימנע מכל חשיפה לחות.
- היכונו הפריטים הנדרשים הניתוח, כולל שיער מספריים, מספריים הכנת העור, אזמל, פינצטה כירורגית, שני זוגות של רקמות פינצטה, המחט, 15 ס מ monofile בתפר הלא resorbable.
- לחטא את המכשירים באמצעות של חום מעקר עבור 5 דקות ב 240 מעלות צלזיוס. לפני השימוש על כלי הנגינה, המתן 5 דקות עד שיגיעו לטמפרטורת החדר.
- הימנע מכל מגע של מכשיר סטיריליים טיפים משטחים nonsterile.
- הימנע צריבה בעור על ידי מכשירים חם.
- לחטא את המכשירים באמצעות של חום מעקר עבור 5 דקות ב 240 מעלות צלזיוס. לפני השימוש על כלי הנגינה, המתן 5 דקות עד שיגיעו לטמפרטורת החדר.
- Narcotize עכבר עם איזופלוריין כרך 5% ואחריו 1.5% vol באמצעות מכשיר אידוי וחמצן זרם של 2 ל'/min.
- הנח את העכבר במצב של שכיבה על התקן התחממות כדור הארץ מכוסים בשכבה של גזה כדי למנוע פציעות תרמי העכבר. טמפרטורת פני השטח הוא כ 37 מעלות צלזיוס.
- להגן על העיניים עם משחה.
- להסיר השיער באמצע חזרה באזור של 0.5 ס מ2 באמצעות מספריים או מכונת תספורת לשיער, לחטא את העור שיער עם חיטוי מתאים לחיטוי העור. להסיר שיער פחות ככל האפשר כך זה נשאר קשה יותר עבור העכבר כדי להגיע את הפצע ומסתיים הליך משנה אחר כך, כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
- תחתכי את העור שיער עם איזמל בכיוון קרניו-סימטרית באורך של 5 מ מ. הכן נרתיק הלטראלי השמאלי של 1 ס מ עומק רקמת החיבור התת עורית באמצעות הכנה בוטה.
- להעריך את רמת ההרדמה על-ידי רפלקס פדלים ולהתאים הרדמה משלוח במידת הצורך לפני תחילת הניתוח.
- הכנס צניפה שחרור 10 יום אחד התיק מוכן הלטראלי השמאלי באמצעות פינצטה רקמות סטריליים. יוצאים בגדר בתחתית התיק בעמדה מישוריים.
- הימנע מכל מגע של בגדר כדי נוזלים ולחות עד להציב את התיק מוכן.
- סגור את העור עם 2-3 תפרים. רק להשאיר קצוות פתיל קצר מאוד לעשות את זה קשה יותר עבור העכבר כדי לפתוח התפרים על-ידי מכרסם.
- הצב והעכברים בנפרד כדי להפחית מצוקה שלאחר הניתוח, כדי למנוע פתיחה של התפרים על ידי מכרסם. שמור את העכבר בתצוגה עד זה שהכרתו מספקת לאחר הרדמה.
הערה: יש צורך לניהול כאב לאחר הניתוח, שכן התערבות זו הוא נסבל היטב ללא כל סימנים של אי נוחות או כאב. לחלופין מומלץ משככי כאבים אקטואלי, למשל טיפת נמשך על החתך לפני הסגר אשר יספק עד 8 שעות של שיכוך כאבים.
3. הערכת אינדוקציה דגם, סימנים של תסמונת נפרוטית, רווחה
- איסוף שתן הבוקר (08:00) לתוך כוס התגובה (1.5 מ ל) כל יום מיום הזריקה על ידי עיסוי שלפוחית השתן.
- למדוד פרוטאינוריה באמצעות שיטת ברדפורד, לנרמל את קריאטינין.
הערה: עבור אינדוקציה של תסמונת נפרוטית, פרוטאינוריה אמורים להגיע לסף מסוים של קריאטינין 120 מ ג/מ ג בין יום 7 ו- 10 לאחר ההזרקה דוקסורוביצין.
- למדוד פרוטאינוריה באמצעות שיטת ברדפורד, לנרמל את קריאטינין.
- חפשו את התפתחות מיימת. בדוק להגדלת היקף בטן או האגפים לראשיכם.
- שוקלים את העכבר, באוכל שלהן, על בקבוק שתיה הבוקר (08:00) כל יום.
- לבדוק רווחה לפחות פעם ביום באמצעות גיליון ציון על פי מורטון, גריפיתס ואח. 16
4. מדידה של השתן סרין פרוטאז עם Assay הדפסות כסף
- להכין את הפתרון עובד המצע על-ידי הוספת 15 מ"ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) בקבוק של 25 מ ג של מצע הדפסות כסף lyophilised S-2251, מניב ריכוז של 2 מ מ. להמיס aprotinin ב- PBS להשגת פתרון aprotinin עם ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
- חנות מוכנה פתרונות ב-20 ° C. זה מאט משמעותית האוטומטי-ההשפלה של S-2251. אל תשתמש פתרונות הישן עם גוון חזק של צהוב.
- שימוש טרי מוכן או הקרת הפתרון עובד המצע, לחמם את זה בחדר חום 37 º C.
- הפשרת דגימות שתן בטמפרטורת החדר.
- למנוע השפלה פרוטאז על ידי הימנעות חוזרות מפשיר קפוא. מאגר דגימות שתן ב-20 ° C.
- השתמש צלחת 96 microwell מתאים למדידה הפוטומטרי באולם התצוגה. להוסיף 3 µL של שתן מדולל בכל אחד שתי בארות ולהוסיף 50 µL של הפתרון עובד המצע עם 3 µL של פתרון PBS או aprotinin הבארות. מכסים את הצלחת עם סילר לאיטום צלחת.
- דגירה את הצלחת microwell מכוסה למשך 60 דקות בחדר חום 37 º C.
- למדוד את הצפיפות האופטית של כל טוב-450 nm באמצעות קורא microplate.
- קח את ההבדל בין OD ללא aprotinin ועם aprotinin השתן תלויית aprotinin סרין פרוטאז פעילות.
הערה: מדידה של מדגם מזווג עם ובלי aprotinin מגביר יחודיות של וזמינותו מאז גם יכול להיות ביקע את המצע על ידי אחרים פרוטאזות לא משחק תפקיד pathophysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר אינדוקציה של הרדמה איזופלוריין, דוקסורוביצין הוזרק במהירות דרך הסינוס retrobulbar השמאלי. בכל אמצעי האחסון של 7.25 µL/g bw הוזרק ללא כל התנגדות, extravasation מוכיח לתקן מיקום תוך ורידי הצינורית. העכבר התאוששה במהירות הרדמה ולא היה שום ליקוי באותו יום ולאחר מכן. במיוחד, לא היה כל סימן של נזק בעין שמאל. לאחר דוקסורוביצין הזרקה, מזון ונוזלים צריכת ירד על 3 הימים הראשונים בשל תופעת רעילים כללי של דוקסורוביצין, התאושש לאחר מכן (איור 1 א'). במהלך 3 הימים הראשונים לאחר ההזרקה, העכבר איבד 3.4% ממשקל גופה בשל inappetence (איור 1b). החל ב-th 5 ביום, העכבר פיתח מסומן פרוטאינוריה (איור 1 c) כי בעקבות ירידה מסיבית של הפרשת נתרן השתן למרות צריכת מזון נאותים (איור 1 א', ב'). זה שמירה נתרן להוביל רווח מסיבית של משקל הגוף על ידי 22.2% מיום 3 עד ליום 10, היה מלווה מיימת. כתוצאה פרוטאינוריה, פיתח העכבר hypoalbuminemia (איור 1 c). מדגם פלזמה נלקחה ביום 10, היפרליפידמיה היה גלוי. נתונים אלו מראים כי דוקסורוביצין שניתנו על ידי הסינוס retrobulbar במהירות, באופן מרשים גורם תסמונת נפרוטית במלוא מובן המילה בעכברים 129S1/SvImJ wildtype.
אצירת נתרן תסמונת נפרוטית ניסיוני היה קשור להפעלת ENaC על-ידי סינון aberrant של סרין פרוטאזות כגון פלסמין11,12. אם הרעיון הזה נכון, עיכוב של השתן סרין פרוטאזות מאת aprotinin צריך להגן מפני הפעלה ENaC ושמירה נתרן. ללמוד את השפעת aprotinin על ההפעלה ENaC, נתייחס בעכבר נפרוטית עם aprotinin. כפי aprotinin מנוקה במהירות על-ידי סינון glomerular, בחרנו והתרופות האמריקני באמצעות גלולה שחרור-מתמשכת כדי להבטיח זמינות רציפה של aprotinin בתוך צנורית דיסטלי למעלה מ- 10 ימים. ביום השלישי לאחר ההזרקה דוקסורוביצין, עכבר אחד. היה מושתל של גלולה המכילה aprotinin והתקבלו עכבר שליטה גלולה פלצבו תחת הרדמה איזופלוריין. חיות התאושש במהירות טופס הרדמה, הפצע נרפא ללא כל בעיות. יום 5 ואילך פרוטאינוריה שפותחה בעכברים שני במידה דומה (איור 2 א). עם זאת, רק הפלצבו שטופלו נפרוטית העכברים חוו נתרן השמירה (איור 2b), עלייה במשקל הגוף (איור 2 c) המציין ENaC הפעלה. לעומת זאת, העכבר שטופלו aprotinin היה מוגן מפני נתרן השמירה ולהשיג משקל הגוף (איור 2b, ג). זה מדגים בבירור כי השתן סרין פרוטאז פעילות הוא הגורם של נתרן השמירה תסמונת נפרוטית.
ריכוז aprotinin בתאריך פלזמה ושתן נמדדה עם אליסה. כפי שמוצג באיור 3a, ריכוז השתן aprotinin הגיעה לשיאה מיד לאחר ההשתלה, היה קבוע לאחר מכן. כלומר ריכוז השתן aprotinin היה ± 29 207 µg/mL (32 ± 4 מיקרומטר) ואילו ריכוז הפלסמה aprotinin לאחר 10 ימים של טיפול µg 13/מ"ל (2 מיקרומטר), אשר דומה לדקל ריכוז הפלסמה בתאריך חולים שטופלו aprotinin17. השפעת aprotinin על צינור השתן סרין פרוטאז פעילות נמדדה עם וזמינותו הדפסות כסף באמצעות דגימות שתן במהלך של תסמונת נפרוטית ניסיוני. Assay הזה מבוסס על הידרוליזה של קשר פפטידי במצע שחרור p-nitroaniline שניתן לאתר בקלות על ידי photometry ב-450 ננומטר. כפי שמוצג באיור 3b, סרין פרוטאז פעילות גדל במהירות בשתן הפלצבו שטופלו בעכבר נפרוטית מקבילים תחילתה של פרוטאינוריה. לעומת זאת, השתן סרין פרוטאז פעילות היה עכבות לחלוטין שטופלו aprotinin העכבר נפרוטית בד בבד עם מניעת הפעלה ENaC ושמירה נתרן שמוצג באיור 2b, ג.
איור 1: קורס של מזון ונוזלים צריכת (א), נתרן השתן הפרשה וגוף משקל (ב) ו פרוטאינוריה ופלסמה ריכוז אלבומין (ג) לפני ואחרי אינדוקציה של תסמונת נפרוטית ניסיוני. אחרי ירידה ב צריכת הנוזלים ואוכל במשך שלושת הימים הראשונים לאחר דוקסורוביצין, עכברים מראים על צריכת כמעט קבוע. לאחר חמישה ימים, התפתחות פרוטאינוריה מתחיל, מגיע לגודל הסף נפרוטית בין יום 7 ו- 10, שמוביל תסמונת נפרוטית במלוא מובן המילה עם היווצרות בצקת, נתרן השמירה, hypoalbuminemia. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: קורס של פרוטאינוריה (א), הפרשת נתרן בדרכי השתן (b), משקל הגוף (ג) ב עכבר התיחס לכל אחד עם aprotinin או פלצבו גלולה ביום השלישי לאחר ההזרקה דוקסורוביצין. למרות ההתפתחות של פרוטאינוריה ב גבול דומה aprotinin מגן מפני השמירה נתרן היווצרות בצקת הנגרמת על ידי הפעלת ENaC במהלך תסמונת נפרוטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קורס ריכוז השתן aprotinin לאחר ההשתלה של בגדר עם ריכוז הפלסמה של aprotinin. קורס של השתן סרין פרוטאז פעילות נמדד עם הדפסות כסף וזמינותו המתוארים בשלב 4. ריכוז השתן aprotinin פיקס מיד לאחר ההשתלה, היא קבועה לאחר מכן. סרין פרוטאז פעילות גדל במהירות בשתן במהלך תסמונת נפרוטית, המקביל תחילתה של פרוטאינוריה. Aprotinin ויוו מונע נגד עלייה בפעילות השתן סרין פרוטאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הנה, נדגים דוקסורוביצין הזרקת באמצעות הזרקת סינוס retrobulbar גורם תסמונת נפרוטית ניסויי בעכברים 129S1/SvImJ עם פרוטאינוריה, נתרן השמירה, hypoalbumenia, היפרליפידמיה. עם זאת, ישנם שני בעיות קריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במודל זה. ראשית, אינדוקציה דגם בקפדנות המינון תלוי, הסטיות של דוקסורוביצין במינון קטן כמו µg 0.3/g להשפיע על התגובה של עכברים15. כאשר הזריקו במינון נמוך כגון µg 14/g bw או להלן, דוקסורוביצין גורמת רק שאינם נפרוטית פרוטאינוריה שאינו מקושר עם נתרן עבירה השמירה, מיימת, היפרליפידמיה. לעומת זאת, הזרקת מינון גבוה יותר מוביל לאי ספיקת כליות חריפה ותמותה חריפה גבוהים. על פי המינון התגובה של העכברים, גורם דוקסורוביצין מסלול דמוי אי-ספיקת כליות חריפה אנושי (אקי), מחלת כליות כרונית עם נשמר סינון glomerular לדרג (CKD שלב G1-3) או מחלת כליות כרונית מתקדמת עם מופחת סינון glomerular קצב (CKD G4-5) שמוביל אורמיה7,15.
שנית, מודל זה מוגבל זנים מסוימים העכבר, המתח C57Bl/6 בשימוש נרחב הוא עמיד8. יתר על כן, לזיהום גנטי כפי שהם עשויים להיות נוכח בזמן backcross עלול להוביל קצב התגובה באופן משמעותי נמוך יותר. זה ניתן למנוע במידה מסוימת על ידי הגדלת המינון דוקסורוביצין. עם זאת, המינון של דוקסורוביצין המשמש אינדוקציה דגם (µg 14.5/g bw) הוא כבר קרוב ld 50 המתואר בין 15-17 µg/g bw זה זן7,18.
השימוש של מודל זה העכבר פותחת את האפשרות ללמוד חדשניים ביותר שאלות שונות הנוגעות תסמונת נפרוטית, להגיע של פרוטאינוריה היווצרות בצקת dysregulations בבעיות אנדוקרינולוגיות ואנמיה כליות15. במובן זה, דוקסורוביצין-induced כלייתית משתרע על ספקטרום רחב של CKD אנושי והוא מהווה חלופה טובה המודלים הנוכחיים מנוצל נפרולוגיה מחקר כזה 5/6-כריתת כליה-19,-20 או שופכן חד-צדדית מצדו21. יתר על כן, זה אפשרי להחיל את המודל על עכברים מהונדסים גנטית כדי ללמוד את התפקיד של גן מסוים עניין במהלך הדגם כגון חוסר קינאז בסרום-glucocorticoid 1 (SGK1)7 או רבים אחרים.
תכונה מיוחדת של המודל הציג היא המופע של proteasuria, כלומר., הפרשה של פעיל סרין פרוטאזות הגורמות ENaC ההפעלה על-ידי proteolysis של שלה γ-יחידה משנית. זה מוביל הפרשת כמעט ללא נתרן השתן ונפח השמירה מאופיין על ידי הגוף מהירה במשקל ופיתוח של מיימת לאחר התחלתה של proteasuria. עם זאת, תופעה זו הוא חולף, והן לאחר 15 ימים, עכברים באופן ספונטני רופף מיימת משקל למרות פרוטאינוריה נמשכת. הסיבה, עם זאת, נשאר חמקמק. התנהגות פרדוקסלית זו נצפתה גם מחקרים עם חולדות נפרוטית4 ונראה לייצג תכונה כללית של תסמונת נפרוטית ניסויים בחולדות.
השתן סרין פרוטאז פעילות נמדדה עם assay הדפסות כסף כי היא פשוטה ומהירה. הוא מבוסס על הידרוליזה של הקשר אמיד של p-nitroaniline קשורה פפטיד באורך 4 חומצות אמינו, זה יכול להיות ביקע על ידי פרוטאזות שונים. באופן כללי, מצעים הדפסות כסף אינם ספציפיים עבור פרוטאז מסויימים, ויש חפיפה ניכרת של פרוטאזות זה קליב מצע מסוים. המצע בשימוש כאן הוא מצע מועדף של טריפסין כמו סרין פרוטאזות כגון פלסמין או פלזמה kallikrein22. כדי להגדיל ירידה לפרטים, פעילות פרוטאז צריך תמיד להיות נחוש מתוך מדגם מזווג עם ובלי23,מעכב24. במחקר זה, aprotinin היה משמש להגדרת הפעילות של טריפסין כמו סרין פרוטאזות. על-ידי חישוב הפעילות aprotinin רגיש מן ההבדל, הפעילות של פרוטאזות אחרות מבוטלות. העכבר נפרוטית שטופלו aprotinin ויוו, השתן סרין פרוטאז פעילות לא גדל, והכי חשוב בד בבד עם עקירת נתרן השמירה. וכך, בדרכי השתן סרין פרוטאז פעילות אינה רק סיבתי עבור שימור נתרן תסמונת נפרוטית, אך יכול גם להיחשב סמן כדי לחזות את היעילות של מעכב פרוטאז סרין תסמונת נפרוטית, אשר עשוי להפוך חדש רפואית לגשת ב טיפול תסמונת נפרוטית. במחקר על-ידי Bohnert et al. 13, סרין פרוטאז מעכב camostat ו- plasminogen המרת מעכבי tranexamic החומצה היו לא יעיל במניעת השמירה נתרן אשר בד בבד עם כישלון לנרמל את השתן סרין פרוטאז פעילות.
למרות דוקסורוביצין הוא חומר רעיל, הזרקת retrobulbar היא לא משויכים נזק מניסיון לרווחתם של החיה ובטוחה. אפשר לטעון כי הזרקת וריד הזנב יהיה בגישה מתאימה יותר בהפחתת מצוקה בעלי חיים. במחקר השוואתי, גילינו כי אינדוקציה באמצעות הזרקת וריד הזנב של דוקסורוביצין היה נחות retrobulbar כביש בשל שיעור גבוה יותר של עכברים לא לפתח תסמונת נפרוטית (34% שאינם-המשיב) בהשוואה לאלו שנגזרות (מסלול retrobulbar 0-15% שאינם-המשיב). בנוסף, פרוטאינוריה בזריקה וריד הזנב היה נמוך המוביל נתרן הקלוש השמירה. זו עשויה להיות מוסברת על ידי ההבדלים פרמקוקינטיקה, ריכוז שיא גבוה יותר של דוקסורוביצין מושגת לאחר ההזרקה retrobulbar מהירה חיונית אינדוקציה דגם על ידי נזק podocyte. עם זאת, יש להדגיש כי הזרקת retrobulbar צריך מפעיל מיומן ומנוסה כדי למנוע סיבוך הקשור extravasation של כמויות אפילו דקה של דוקסורוביצין.
לסיכום, תסמונת נפרוטית ניסיוני מאת דוקסורוביצין היא דוגמנית תכליתי של מחלת כליות proteinuric בעכברים 129S1/SvImJ המאפשרת לחקור שאלות מדעיות הנוכחי מאוד, והכי חשוב proteasuria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק מטעם קרן מחקר גרמני (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
