Summary
تعرض هذه المقالة بروتوكول لبذر السكان الشحيحة للخلايا باستخدام ماصة-نصائح لأجهزة موائع جزيئية الحبرية من أجل توفير مستوى أعلى من الكفاءة تغليف الخلايا في قطرات.
Abstract
يوفر الحبرية-ميكروفلويديكس بين مختلف التصاميم منصة موائع جزيئية كثيرا ما تستخدم لتحليل الخلوية، أداة قوية لعزل وتحليل الخلايا على مستوى الخلايا المفردة من خلال القضاء على تأثير العوامل الخارجية على الخلوي المكروية. تغليف الخلايا في قطيرات تمليه توزيع بواسون كدالة لعدد الخلايا الموجودة في كل قطره ومتوسط عدد الخلايا في حجم التجميعية. يمكن أن تكون الخلايا الأولية، لا سيما الخلايا المناعية، أو العينات السريرية النادرة وتغليف أقل خسارة من خلايا لا تزال صعبة. في هذه الورقة، نقدم منهجية جديدة يستخدم ماصة-نصائح لتحميل خلايا للأجهزة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية دون فقدان كبير للخلايا. مع مختلف أنواع الخلايا، علينا أن نظهر تغليف خلية فعالة في قطرات يتوافق عن كثب مع كفاءة التغليف التي تنبأ بها توزيع بواسون. لدينا أسلوب يضمن تحميل الخسارة أقل من الخلايا إلى منصات موائع جزيئية ويمكن تكييفها بسهولة لتحليل المتلقين للمعلومات من خلية مفردة، مثلاً، فك التفاعلات الخلوية بين أنواع مختلفة من الخلايا.
Introduction
في السنوات الأخيرة، استخدام ميكروفلويديكس كمنصة قوية ومرنة لتحليل الخلوية على مستوى الخلية الواحدة على زيادة سرعة1. وتوفر هذه المنصات الفرز الفائق للخلايا المفردة والجزيئات البيولوجية مع عالية الدقة والحساسية باستخدام عينة صغيرة جداً حجم2،،من34. من بين أنواع مختلفة من التصاميم موائع جزيئية، تمكين الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية التحليل الفائق للخلايا المفردة بعزلهم في الحبرية مرحلة مائي محاط بمرحلة قابلة للامتزاج الذي يسمح بالتحكم الخلوي دقيقة ودقيقة المكروية5،6. ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية يعطي المرونة لعزل مفردة أو متعددة الخلايا في كليهما، مائي وقطرات المائية وهي ذات قيمة في سبر السلوك الخلوية المعقدة، مثل البروتين إفراز أو الخلوية التفاعلات7، 8 , 9-الإشارات وعبر الحديث بين الخلايا المناعية يمكن أن يتأثر بالتفاعل مع خلايا أخرى في المكروية10. عزل الخلايا المفردة في قطرات يوفر مختبر خالية من الضوضاء تحليلية فعالة، خالية من تأثير العوامل البيئية الخارجية لأكثر كفاءة ودقة النتائج11،12. تعديل تصميم منصة الحبرية-موائع جزيئية مع مداخل متعددة تسمح تغليف العديد من أنواع الخلايا لدراسة التفاعلات الخلوية عن طريق الأقران الخلية12،13.
عملية تغليف الخلايا في قطرات عشوائية ويمكن تحديد معدل تغليف الخلايا إحصائيا باستخدام صيغة ال14،توزيع Poisson15. يمكن أن تقدر بالنظر في المعدل المتوسط لوصول الخلايا عند مفرق الحبرية هذا المعدل لتغليف وافتراض أن وصول كل خلية مستقلة عن وصول أخرى خلايا16. على الرغم من أنه لا يمكن ضمان وصول خلية مستقلة، وفي حالات قليلة توزع الخلايا، يمكن اعتبار افتراض الاستقلال ويمكن التنبؤ باحتمال معالجة تجميعية تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا كدالة لعدد الخلايا موجودة في كل قطره ومتوسط عدد الخلايا كل قطره16،17. نظراً لهذا التقدير لتغليف الخلوية في قطرات اعتماداً على عدد الخلايا الموجودة في كل قطره، واحد يمكن أن تشير إلى أن زيادة تركيز الخلايا في المدخل سيزيد متوسط عدد الخلايا الموجودة في كل قطره 16. لذلك، لضمان تغليف خلية مفردة، تركيزات الخلية يجب خفض لكن هذا كثيرا ما يؤدي إلى عدد كبير من قطرات فارغة18.
فقدان الخلايا أثناء التحميل بالمرفقات، الترسيب، و/أو التثاقل في المحاقن، أنابيب، أو إنتاج الجهاز عيب مشتركة مسؤولة عن انحراف القيم الفعلية تغليف من القيم المتوقعة تغليف19 . يحصل على زيادة مبالغ هذه المشكلة عند البذر الخلايا المناعية النادرة أو العينات السريرية كما هم بالفعل نادرة في السكان والتغليف من بضع خلايا فقط، أقل بكثير مما كان متوقعا، لا توفر بيانات كافية لتحليل تجريبي. بلاسماسيتويد الخلايا الجذعية (pDCs) هي مجموعة فرعية نادرة من الخلايا المناعية التي تشكل فقط حوالي 0.2-0.6 في المائة البيض كامل الدم خلية السكان20. هذه الخلايا تفرز كميات هائلة من النوع الأول من تداخلين عند التنشيط ومما لعب دوراً حاسما في الاستجابات المناعية21. عند دراسة سلوك هذه الخلايا النادرة في قطرات الخلوية، من الضروري لمنع فقدان الخلية خلال الخلية البذر والتغليف22. وهناك تصميم العديد من التطورات ذات الصلة التي كفلت التغليف للخلايا المفردة في استخدام أساليب التغليف النشطة التي تستخدم مختلف القوى المادية مثل القوات الصوتية أو الكهربائية لجيل قطرات تحتوي على قطرات خلايا مفردة23،24. ومع ذلك، هذه الأساليب قد القيود الخاصة بها من حيث إنتاج قطره16.
في هذه الدراسة، قمنا بإنشاء أسلوب قوي ومباشر أن تلتف أوجه قصور الأساليب التقليدية لتحميل خلايا مفردة أو متعددة للأجهزة موائع جزيئية. أسلوبنا، مستوحاة من رو et al.، يستخدم نصائح ماصة الحجم بشكل مختلف لبذر كميات صغيرة من الخلايا المناعية النادرة إلى منصات موائع جزيئية الحبرية دون فقدان عينة كبيرة، وأسفرت عن نتائج متسقة مع النظرية 25من التنبؤات. هذه المنهجية يمكن بسهولة بنجاح تكييفها للعديد من التطبيقات التي تشمل ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية وتطبيقها لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أو حتى المجهرية الدقيقة.
Protocol
1-3-مدخل تصنيع جهاز بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)
- قياس 40 غ قاعدة PDMS في خلاط تكييف كأس وإضافة 4 غرام عامل علاج PDMS إلى الكاشف الأساسي في الكأس، بعناية، باستخدام قطارة.
- ضع الكأس في صاحب خلاط تكييف وقياس الوزن الكلي للكأس مع الحامل. تعيين قيمة الوزن التوازن في أجهزة الطرد المركزي في خلاط تكييف وفقا لذلك.
- مزيج القاعدة وعلاج عامل في خلاط تكييف 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة تليها إزالة رغوة 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
- إعداد زورق ألومنيوم، يبلغ قطرها تقريبا بنفس حجم من رقاقة السيليكون 100 مم. ضع رقاقة السيليكون، ملفقة للنسخة المتماثلة صب العملية، في قارب الألومنيوم ووضع هذا الإعداد في طبق بتري (قطرها = 120 مم، الارتفاع = 20 مم).
ملاحظة: حجم صحن بيتري يعتمد على حجم رقاقة السيليكون. - إزالة الكأس من الحامل وصب الخليط PDMS قبل الشفاء (محتويات الكأس)، بعناية، على رقاقة السيليكون.
- ضع طبق بيتري، التي تحتوي على رقاقة السيليكون مع خليط PDMS قبل الشفاء، في مجفف لحوالي 20 دقيقة لإزالة جميع فقاعات الهواء.
- إزالة طبق بيتري بعد 20 دقيقة والتحقق من وجود أي فقاعات الهواء المتبقية التي يمكن إزالتها.
- ضع طبق بيتري في فرن، تعيين عند 65 درجة مئوية، على الأقل 3 ح.
- إزالة طبق بيتري من الفرن بعد ح 3 وقشر بعناية PDMS شُفي من رقاقة السيليكون.
- قطع أجهزة PDMS على غرار قطع، باستخدام سكين أو مشرط. لكمه ثقوب في مداخل ومخرج لكل جهاز باستخدام تثقيب 1.2 مم. قم بتنظيف كل جهاز PDMS مع اﻻسكتلندي لإزالة أي أجزاء من PDMS الغبار أو المتبقية.
- بشكل اختياري، ضربة بالنيتروجين لإزالة القطع PDMS المتبقية.
- إعداد الشرائح الزجاجية بتنظيفها بالصابون-الماء، متبوعة بالكحول والجافة مع النيتروجين.
- السندات جهاز PDMS نظيفة مع شريحة زجاجية نظيفة في بلازما أشر إغلاق خطوط التدفق. استخدم الإعدادات التالية: السلطة: 50 ث، الوقت: 45 ثانية، تنزف تأخير الوقت: 2 s، والغاز عملية: 1 الغازات (الهواء)، وتنفيس: كلا الصمامات، المقيدة التنفيس عن الوقت: 60 ثانية، تدور مضخة أسفل الوقت: 10 ق، تنفيس عقد وقت: 0 ثانية، الوقت منع تسرب الغاز: 1 s، توربو الضخ تمكين : 0-قطع جميع خطوط الغاز أخرى.
ملاحظة: الإعدادات المستخدمة للبلازما أشر يمكن أن تختلف وفقا لنوع البلازما أشر المستخدمة. - إعداد الحل سيلاني بإضافة 50 ميليلتر من silane (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-بيرفلوروكتيلتريثوكسيسيلاني) إلى 950 ميليلتر من المفلورة النفط.
ملاحظة: سيلاني السامة. الرجاء تعمل تحت غطاء الدخان. - رسم الحل سيلاني المعدة في حقنه، التي تتصل أنابيب تفلون.
- سالينيزي الجهاز بالتنظيف الحل سيلاني المعدة من خلال المنفذ للجهاز.
- ضع الجهاز في فرن، في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة الجهاز الملحية من الفرن ومسح سيلاني الزائدة خارج الجهاز مع النفط المفلورة.
- وضع الجهاز مرة أخرى في فرن، في 65 درجة مئوية، وعلى الأقل 1 ح لإتمام عملية الربط.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
2. تغليف الخلية الخسارة أقل
-
حصاد الخلية
- تعليق إعادة الخلايا T جوركات في معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) متوسط تركيزات 1.0x106 خلايا/مل، 2.0x106 خلايا/مل، 4.0x106 خلايا/مل و 8.0x106 خلايا/مل؛ pDCs في المكونة للدم خالية من المصل ثقافة وسائل الإعلام (على سبيل المثال، 15 س-فيفو) تركيزات 1.3x106 خلايا/مل، 3.0x106 خلايا/مل و 13.0x106 خلايا/مل؛ خلايا A549 في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) بتركيز 1.0x106 خلايا/مل.
ملاحظة: يمكن أن تختلف نوع الخلايا وتركيز الخلايا استناداً إلى التجربة. وضع العلامات من الخلايا يمكن أيضا أن يتم استناداً إلى التجربة.
- تعليق إعادة الخلايا T جوركات في معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) متوسط تركيزات 1.0x106 خلايا/مل، 2.0x106 خلايا/مل، 4.0x106 خلايا/مل و 8.0x106 خلايا/مل؛ pDCs في المكونة للدم خالية من المصل ثقافة وسائل الإعلام (على سبيل المثال، 15 س-فيفو) تركيزات 1.3x106 خلايا/مل، 3.0x106 خلايا/مل و 13.0x106 خلايا/مل؛ خلايا A549 في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) بتركيز 1.0x106 خلايا/مل.
-
تحميل تلميح لتوليد مائي الحبرية
- إعداد النفط المفلورة مع خليط الفاعل متوافق حيويا 3% بإضافة 3 مل السطح إلى 2 مل من زيت المفلورة.
ملاحظة: يحدد تركيز الفاعل إضافة إلى النفط المفلورة استقرار المستحلب لفترات حضانة مختلفة. تركيز السطح يختلف اعتماداً على الوسائط المستخدمة لأنواع معينة من الخلايا. - رسم الخليط مرحلة النفط في حقنه (1 مل). إزالة فقاعات الهواء من المحاقن وتوصيله بأنابيب تفلون للطول المناسب.
- تحضير حقنه عينة بالرسم الزيوت المعدنية متوافق حيويا في حقنه. إزالة فقاعات الهواء والاتصال حقنه أنابيب تفلون للطول المناسب.
- لكمه المكونات PDMS التي يبلغ قطرها 5 مم من لوح PDMS علاجه.
ملاحظة: يمكن إعداد لوح PDMS علاجه باستخدام الخطوات 1.1 إلى 1.9. استخدام رقاقة سيليكون عادي بدلاً من رقاقة سيليكون ملفقة. - لكمه ثقب آخر في مركز المكونات مع تثقيب 1 مم.
- إدراج المكونات في تلميح 200 ميليلتر ماصة، من نهاية أكبر، مثل يتم احتواؤها بشكل محكم.
ملاحظة: استخدام تلميح ماصة ميليلتر 1,000 لحجم عينة أكبر وأكبر من الخلايا. لنصيحة ماصة ميليلتر 1,000، يمكن استخدام سدادات قطرها يتراوح بين 5 و 7 ملم. مع المكونات قطرها 5 مم، حجم عينة حوالي 400 ميليلتر ويمكن أن يستنشق في تلميح ماصة. إذا كان توصيل لقطر أكبر المستخدمة (7 ملم)، يمكن أن يستنشق المزيد من حجم العينة (حوالي 900 ميليلتر). - إدراج الأنبوب، الذي يرتبط حقنه، في سد PDMS، الذي تم إدخاله في تلميح ماصة. دفع المكبس حقنه ببطء لملء نصيحة ماصة متصلة مع الزيوت المعدنية. طرد جميع الهواء المتبقي من طرف ماصة.
- أدنى تلميح ماصة، متصلاً بالمحاقن، في حل عينة ونضح حوالي 150 ميليلتر من عينة في التلميح.
- كرر الخطوات من 2.2.4 إلى 2.2.8 لإعداد حقنه عينة ثانية.
- بعناية بوضع جميع المحاقن استعداد ثلاثة على ضخ حقنه.
- قم بإدراج كل النصائح ماصة، المحتوية على العينة، في مداخل الداخلية اثنين من شرائح PDMS. إدراج الأنبوب الذي يحتوي على خليط المرحلة النفطية في المدخل الخارجي.
- تعيين قيمة معدلات التدفق على مضخة الحقن على النحو التالي: حل المرحلة المستمر: 600 ميليلتر/ح، خلية عينات: 100 ميليلتر/ح، كل. أدخل وتعيين أبعاد المحاقن.
ملاحظة: قطر سوف تختلف إعدادات استناداً إلى النوع المحاقن. - بدء تشغيل المضخة لمسح عينة الحل عن طريق القنوات الداخلية المرحلة الجهاز والنفط من خلال القناة الخارجي للجهاز.
- قم بتوصيل أنابيب طول المناسب إلى المنفذ البدء في جمع القطرات عند تشكيل الحبرية مستقرة. ويختلف وقت جمع استناداً إلى التجربة.
- جمع قطرات في أنبوب قفل. إضافة 200 ميليلتر من ربمي المتوسطة (دون المصل) على رأس قطرات المجمعة واحتضان العينة.
ملاحظة: الاحتضان يختلف وقت قطرات جمعها استناداً إلى التجربة. يتم جمع قطرات في أنبوب قفل عند إجراء التحليل التدفق الخلوي أو العزلة بعد استرداد الخلايا من قطرات بكسر في شكل مستحلب. فمن الممكن لجمع القطرات في حجرة زجاجية إذا التجربة يتطلب التحليل المجهري في الحبرية.
- إعداد النفط المفلورة مع خليط الفاعل متوافق حيويا 3% بإضافة 3 مل السطح إلى 2 مل من زيت المفلورة.
-
مستحلب استرجاع كسر وخلية لتحليل تدفق سيتوميتريك
- إعداد 20% 1 ح، ح 1، ح 2، ح 2-Perfluoro-1-تفريق الأوكتانول (مكتب تمويل البرامج) الحل (v/v) في النفط المفلورة بإضافة 2 مل من مكتب تمويل البرامج في 10 مل زيت فلوريناتيد.
- إزالة فائض من النفط من الجزء السفلي من أنبوب جمع، التي تحتوي على القطرات، استخدام المحاقن.
- إضافة 100 ميليلتر من حل مكتب تمويل البرامج 20% مستحلب لكسر المستحلب، وإطلاق سراح الخلايا مغلفة في مرحلة مائي. والاستفادة من مزيج بإيجاز. عدم دوامة عند هذه النقطة. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
ملاحظة: مقدار مكتب تمويل البرامج وأضاف يعتمد على كمية إنتاج قطرات. تبقى مضيفاً إضافية مكتب تمويل البرامج حتى يذوب في طبقة النفط تماما. نضع في اعتبارنا أن مكتب تمويل البرامج السامة للخلايا وأن تركيزات عالية جداً من مكتب تمويل البرامج أو حضانة طويلة جداً في مكتب تمويل البرامج قد تؤدي إلى زيادة في موت الخلايا. - تدور الحل قريبا في إطار التعاون الإقليمي ممكن أدنى لمدة 30 ثانية.
- إعداد 100 مل الحل فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) الباردة وتستكمل مع 2% مصل العجل الجنين (FCS) (2 مل من سفح المنحدر القاري في مل 98 من برنامج تلفزيوني).
- "الماصة؛" ميليلتر 550 الكسر مائي، فورا بعد الطرد المركزي وتحويلها إلى أنبوب قفل جديد يحتوي على 500 ميليلتر من حل برنامج تلفزيوني الباردة تكملها FCS 2%، كما أعد الخطوة 2.3.5. السماح لأي بقايا النفط بالوعة إلى الجزء السفلي من الأنبوب لوك جديد.
- نضح ميليلتر 950 المرحلة مائي تحتوي على الخلايا من هذا الأنبوب لوك، بعناية، دون يسفط أي بقايا النفط ونقل الحل إلى أنبوب لوك جديد.
- زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في الأنبوب قفل جديد لمدة 10 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايا في 300 ميليلتر من حل برنامج تلفزيوني الباردة تكملها FCS 2%، كما أعد الخطوة 2.3.5.
ملاحظة: الخلايا يمكن أيضا إعادة تعليق في أي حل مناسب أخرى مثل وسائل الإعلام اعتماداً على التجربة. وصمة عار في الخلايا، واستنادا إلى التجربة، بالنسبة للتحليل باستخدام التدفق الخلوي.
3-خلية الأقران
-
خلية الحصاد وتلطيخ
- حساب عدد الخلايا جوركات T، من ثقافة قارورة، وتدور أسفل الخلايا في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وتعليق إعادة 1.0x106 خلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني للحصول على تركيز 1.0x106 خلايا/مل. مبلغ أضيف برنامج تلفزيوني يعتمد على عدد الخلايا.
- كرر الخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.2 بإعداد عينة ثانية من الخلايا T جوركات مع تركيز الخلية نفسها.
- تغسل كل العينات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق عينة خلية واحدة مع 1.25 مكم كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر (CFSE) صبغ والعينة خلية أخرى مع 1.25 مكم الآن أحمر صبغ أو خلية ميكرومتر 1.25 انتشار صبغة بتركيز خلية 1.0x106 خلايا/مل. إجمالي تلوين الحل 1 مل 1.0x106 خلايا.
ملاحظة: يمكن أن يوصفوا الخلايا بصبغات مختلفة تبعاً لعوامل التصفية المتوفرة في سيتوميتير التدفق أو مجهر الأسفار. - احتضان عينات الخلايا مع الأصباغ لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- وقف رد الفعل المصبوغة بإضافة 1 مل السفح الجليد الباردة بعد 10 دقائق.
- تغسل العينات خلية مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق خلية العينات في وسائط الإعلام ربمي بتركيز 10.0x106 خلايا/مل، لكل لون.
-
تحميل تلميح لإنتاج قطرات المائية [اغروس] للاقتران خلية
ملاحظة: للخلية الاقتران استخدام القطرات المائية [اغروس]، المحافظة على درجة حرارة النظام بين 27 درجة مئوية و 37 درجة مئوية طوال عملية توليد وجمع الحبرية لمنع التبلور من الهلاميات المائية وتضمن سلامة الخلوية9.- حل منخفضة للغاية [اغروس] درجة حرارة التبلور بالتدفئة تصل إلى 75 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني بتركيز 4% (w/v) ويقلب الخليط لمدة 20 دقيقة.
- مزيج الحل [اغروس] مع المسمى جوركات تي الخلايا تؤتي بتركيز [اغروس] 2% (w/v). كرر هذه العملية للعينة الأخرى مع الخلايا المسمى بشكل مختلف.
- إعداد النفط المفلورة مع خليط الفاعل 2% بإضافة 20 مل السطح إلى 30 مل من زيت المفلورة (خليط المرحلة النفط).
- اتبع الخطوات 2.2.2-2.2.14.
ملاحظة: بسبب طبيعة لزجة [اغروس] انصهار منخفضة وضمان إنتاج الحبرية مستقرة، بتعيين قيمة معدلات التدفق على مضخات الحقن كما يلي: النفط مزيج المرحلة: 2,000 ميليلتر/ح، خلية العينات: 200 ميليلتر/ح. أدخل وتعيين أبعاد المحاقن. - جمع القطرات في أنبوب قفل واحتضان قطرات عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
-
مستحلب كسر واسترجاع حبة [اغروس] لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية
- بعد حضانة قطرات لمدة 60 دقيقة، إزالة فائض من النفط من أنبوب قفل، تحتوي على القطرات، استخدام المحاقن.
- إضافة 200 ميليلتر من مكتب تمويل البرامج لإزالة الطور البيني النفط من القطرات.
ملاحظة: مقدار مكتب تمويل البرامج إضافة إلى الأنبوب يعتمد على كمية إنتاج قطرات. تبقى مضيفاً إضافية مكتب تمويل البرامج حتى يذوب في طبقة النفط تماما. - أغسل حبات جمعها [اغروس] مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إزالة النفط تماما بالطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
- تحليل الخرز [اغروس] التي تم جمعها باستخدام التدفق الخلوي.
ملاحظة: من الممكن أيضا لمراقبة الخرز تحت مجهر الأسفار.
Representative Results
لتجاربنا، استخدمنا جهاز يستند إلى موائع جزيئية PDMS 3-مدخل مع ارتفاع 25 ميكرون (الشكل 1). في هذا الإعداد الجهاز، استخدمنا المدخل الخارجي للتنظيف على النفط مع الفاعل والمداخل الداخلية اثنين للتنظيف في مراحل مائي مع تعليق خلية أو وسائل الإعلام. بعد جيل، وجمع القطرات هي المحتضنة لبضع ساعات قبالة رقاقة قبل تحليل المتلقين للمعلومات باستخدام التدفق الخلوي. خلال فترة الحضانة، يمكن أن تتفاعل مع السطح المصل المكونات الموجودة في وسائل الإعلام ويسبب قطرات تصبح غير مستقرة وتتفكك. ولذلك من المهم إضافة تركيز أمثل للفاعل للنفط المفلورة. قمنا باختبار استقرار قطرات مونوديسبيرسيد التي تحتوي على المكونة للدم خالية من المصل الثقافة الإعلامية تستكمل مع 2% مصل الإنسان بتركيزات مختلفة من السطح في النفط المفلورة. يمكن الاستدلال على ذلك من الشكل 2 قطرات مونوديسبيرسيد هذه هي الغاية مستقرة لمدة 24 ساعة على الأقل عند السطح 3% إضافة إلى مرحلة النفط. تم الحصول على نتائج مماثلة مع وسائط الإعلام ربمي مع أو بدون إضافة 10% FCS (البيانات لا تظهر). ولذلك، الاستقرار الحبرية اعتماداً كبيرا على تركيزات الفاعل الأمثل عند العمل مع مصادر مختلفة من وسائط الثقافة ومكونات المصل.
تثبت كفاءة تغليف نهجنا نحن المصنف أول الخلايا باستخدام أنابيب متصلة بالحقن، وهو النهج الأكثر تقليدية لبذر الخلايا (الشكل 3أ). نحن حصاد الخلايا T جوركات بتركيزات مختلفة من 1.0x106 خلايا/مل و 2.0x106 خلايا/مل 4.0x106 خلايا/مل وحصل على كفاءة تغليف الذي كان أقل من القيم المتوقعة (الشكل 3ب). في 1.0x106 خلايا/مل، كان جزء صغير قطرات يحتوي على خلية واحدة 2.5%، الذي لم يزد حتى عند استخدام تركيزات أعلى الخلية. لزيادة كفاءة تحميل الخلية، تعديل نهجنا السابق وشنت الأنبوب في نصف المدة ترايبود مرتفعة وتحميل تعليق خلية في النصف الذي تم إرفاقه الجهاز PDMS (الشكل 4أ). باستخدام هذا النهج، ونحن تغليف الخلايا T جوركات بتركيزات مختلفة من 1.0x106 خلايا/مل، 2.0x106 خلايا/مل، و 4.0x106 خلايا/مل، وأيضا pDCs نادرة بتركيزات مختلفة من 1.0x106 خلايا/مل، 2.0x106 خلايا/مل، و 12.0x106 خلايا/مل. كنا نتوقع معدلات تحسين التغليف بمنع الترسب الخلية مع هذا الأسلوب. ومع ذلك، في جميع التركيزات التي اختبرت، النتائج التجريبية كانت أقل بكثير أن بواسون توقع القيم (الشكل 4ب و الشكل 4ج).
باستخدام نهج تحميل تلميح لدينا نحن الأمثل أسعارنا تغليف الخلايا للحصول على النتائج التجريبية متسقة مع القيم المتوقعة إحصائيا (الشكل 5ألف). للحصول على تركيزات مختلفة من خلايا تي جوركات، مطابقة كفاءة التغليف التي يتم الحصول عليها لدينا القيم المحسوبة في جميع التركيزات (الشكل 5ب). بشكل ملحوظ، حتى مع خلايا ملتصقة مثل الخلايا السرطانية A549، التي تميل إلى أجمة، لاحظنا من كفاءة تغليف تحسنا طفيفا في تركيز خلوية من 1.0x106 خلايا/مل (الشكل 5ج). ونحن أيضا بتقييم فعالية نظامنا لتغليف أقل من pDCs المتوفرة والنادرة بتركيزات مختلفة من الخلية 1.0x106 خلايا/مل، 3.0x106 خلايا/مل و 13.0x106 خلايا/مل (الشكل 5د). لتيسير تحميل وحدات التخزين الأكبر ربما تتجاوز 200 ميليلتر، مثلاً، عند العمل مع خطوط الخلايا أو الخلايا المناعية الأولية أكثر وفرة، نحن أيضا التحقيق في كفاءة تغليف الخلية باستخدام 1000 ميليلتر نصائح (أزرق). أظهرنا أن هذه النصائح ميليلتر 1,000 قدم من كفاءة تغليف مماثل بالمقارنة مع نصائح 200 ميليلتر (أصفر) (الشكل 5ه).
تعتمد على رقاقة تصميم وبحث المسألة في متناول اليد، يمكن استخدام تلميح لدينا تحميل تقنية تحميل الخلايا عن طريق مدخل واحد، للتحقيق في عدم تجانس الخلوية، أو مداخل متعددة في نفس الوقت، لفك التفاعلات الخلوية. قارنا تحميل خلايا T جوركات (بتركيز 10.0x106 خلايا/مل) من مدخل واحد إلى اثنين من السكان توسم بشكل مختلف الخلايا T جوركات (بتركيز المجمعة 10.0 x106 خلايا/مل) من مداخل اثنين (الشكل 6 A و الرقم 6ب). القطرات تم إنشاؤها أثناء التغليف، باستخدام منخفضة للغاية [اغروس] درجة حرارة التبلور، وتبلور بعد الإنتاج للنموذج الخرز المائية [اغروس] أن يسمح تحليل المتلقين للمعلومات اللاحقة عن طريق الفحص المجهري والتدفق الخلوي (الرقم 6 ج و الشكل 6د). وكشف التحليل المجهري تحقق المزاوجة الخلية في تركيبات مختلفة تشير إلى خلية إنتاجية عالية الأقران (الشكل 6ج). وعلاوة على ذلك، كشف تحليل لنفس السكان من حبات المائية بالتدفق الخلوي أنه يمكن فصل الخرز دون خلايا من الخرز مع الخلايا استناداً إلى الأمام متميزة (منتدى التعاون الأمني، الحجم) وسيديوارد (SSC، الحبوبية) نمط مبعثر (رقم 6 د). النابضة على سكان حبات دون خلايا أكدت عدم تغليف خلية غياب إشارات الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، النابضة بالسكان حبة مع خلايا كشفت عن وجود الإرشادية السكان الفرعية متعددة لتغليف الخلايا T جوركات المسمى بشكل مختلف. نتائجنا تثبت أن الخلية فعالة الأقران يمكن أن يتحقق، استناداً إلى كل مجهرية سيتوميتريك تحليل تدفق وأظهر من كفاءة تغليف زيادة طفيفة مقارنة بالتنبؤ بواسون (الشكل 6ه).
الشكل 1 . PDMS أساس الحبرية موائع جزيئية الجهاز مع ثلاثة مداخل ومخرج واحد. الجهاز يتكون من ثلاثة مداخل لمرحلة النفط مستمر وخلية ثقافة وسائل الإعلام، وتعليق خلية، على التوالي. يتم جمع قطرات الذي تم إنشاؤه عند المنفذ. النماذج تدفق لامينارلي إلى مفترق تركز تدفق حيث أنها هي مغلفة في قطرات. في المداخل، هياكل تصفية الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات أو المجاميع الخلية مرة أخرى. يتم الإشارة إلى قطر الفجوات في بنية التصفية بخطوط زرقاء. يتم الإشارة إلى قطر القنوات في فوهة الإنتاج بخطوط حمراء. كان ذروة القناة على رقاقة كامل 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الحبرية الاستقرار أكثر من 24 ساعة. تظهر الرسوم البيانية مجال قطرات تحتوي على وسائط ثقافة خالية من المصل المكونة للدم + 2% مصل الدم البشري، على مر الزمن لثلاثة تركيزات مختلفة من السطح A) 0.5% ب) 3% ج) 5%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . وتقوم أنابيب خلية تحميل نهج. الخلايا جوركات-T يتم تحميلها بتركيزات مختلفة للجهاز باستخدام حقنه متصلة بالأنابيب. A) يظهر التوضيح الإعداد التجريبية ب) معدل تغليف الخلايا كما يحدده الفحص المجهري الخفيفة. النقاط: يحدد تجريبيا القيم؛ إغلاق خطوط: توزيع بواسون. يمثل الشريط خطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تغليف لمختلف أنواع الخلايا بتركيزات مختلفة باستخدام أنبوب عمودي تحميل نهج. تم تغليف الخلايا T جوركات و pDCs (من تركيزات مختلفة) لتحديد كفاءة تغليف خلية. A) يظهر التوضيح الإعداد التجريبية لأنبوب عمودي تحميل نهج. ب) الرسم البياني يظهر كفاءة تغليف تي جوركات الخلايا. ج) الرسم البياني يظهر كفاءة تغليف pDCs. النقاط: يحدد تجريبيا القيم؛ إغلاق خطوط: توزيع بواسون. يمثل الشريط خطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . نصيحة تحميل نهج لتغليف أنواع خلايا مختلفة. A) التخطيطي الرسم التوضيحي من طرف تحميل تقنية. ب) الرسم البياني يظهر كفاءة تغليف الخلايا جوركات. ج) الرسم البياني يظهر كفاءة خلايا A549 التغليف. د) الرسم البياني يظهر كفاءة تغليف pDCs. ه) الرسم البياني يظهر كفاءة تغليف تي جوركات الخلايا باستخدام 200 ميليلتر ماصة نصائح (أصفر) ونصائح ماصة ميليلتر 1,000 (أزرق). النقاط: يحدد تجريبيا القيم؛ إغلاق خطوط: توزيع بواسون. يمثل الشريط خطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . خلية الأقران في قطرات. A) التخطيطي الرسم التوضيحي من طرف تحميل نهج لإقران خلايا متميزة من مداخل 2 في قطرات. ب) يظهر الرسم البياني تغليف تي جوركات الخلايا باستخدام مدخل واحد أو اثنين من مداخل بالتوازي. تركيز خلية لطرف واحد 2.0x106 خلايا/مل وتركيز خلية لمدة سنتين ونصائح كلا 1.0x106 خلايا/مل. النقاط: يحدد تجريبيا القيم؛ إغلاق خطوط: توزيع بواسون. ج) Fluorescence التراكبات مجهرية الخرز المائية والمسمى تي جوركات الخلايا. د) الرسم البياني يبين تحليل تدفق سيتوميتريك الخلايا المزدوجة في الخرز المائية [اغروس]. يوضح المؤامرة مبعثر إلى الأمام ومبعثر سيديوارد. ه) مقارنة بين أرقام الخلية في المائية [اغروس] الخرز كما الكشف عنها بواسطة fluorescence مجهرية والتدفق الخلوي. أشرطة: تعني القيمة؛ شعرات: الخطأ القياسي لمتوسط، n ≥ 4. يمثل الشريط خطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أسلوب فعال ومباشر لتحميل وتغليف الخلايا في قطرات للتحليل الفائق، خلية واحدة وأداء الخلية التي تسيطر عليها الأقران للدراسات الخلوية التفاعل. وعلاوة على ذلك، لدينا مقارنة العديد من النهج التقليدية لتحميل خلايا لأجهزة موائع جزيئية وأظهرت أن لدينا نصيحة تحميل نهج أسلوب أكثر كفاءة مقارنة بالأساليب الأخرى.
دراسة العينات السريرية أو أنواع نادرة من الخلايا النادرة في عدد من ميكروفلويديكس على أساس الحبرية تمتلك بعض التحديات الكامنة. مثل قد أثبتنا أيضا، خلايا تميل إلى الرواسب في المحاقن وسطح الأنابيب، وبالتالي منع تغليف الخلوية لتتوافق مع القيم المتوقعة. لتجنب هذه المشكلة، استخدام بعض الجماعات أشرطة التحريك في الحقن. عند استخدام خلية نادرة ومحدودة السكان، حجم الخلية إجمالي غير أيضا محدودة، وبالتالي الحد من استخدام المحاقن الكبيرة وآثاره على أشرطة. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا استبدال الأنابيب الأكثر استخداماً مع تفلون المغلفة الأنابيب لمنع المرفقات الخلية ولكن هذا الأسلوب لم تتحسن النتائج وإذا الأنبوب طويل جداً، تفاقم مشكلة إرفاق الخلية (البيانات لا تظهر). بدلاً من ذلك، قمنا باستخدام أنبوب عمودي تحميل نهج حيث تم تحميل الخلايا في الأنبوب وليس في المحاقن الحيلولة دون فقدان الخلايا بكميات كبيرة من المحاقن. باستخدام هذا الأسلوب، خلايا ذات حجم عينة صغير يمكن تحميله، pDCs مثلاً، ونادرة ومحدودة. أيضا، يتم تحميل العينة من الأنبوب إلى الجهاز عمودياً لمنع الترسب الخلية. الأنابيب المستخدمة للخلية بذر ذات أبعاد صغيرة ويمكن مقارنة ميكروتشانيلس. تتدفق في الأنبوب الضغط مدفوعة ويتبع سرعة مكافئ الشخصية26. وهذا يعني أن سرعة تدفق الحد الأقصى في مركز الأنبوب والسرعة الحد الأدنى في حواف الأنابيب27. عند مسح أن خلايا عن طريق الأنابيب، التدرج السرعة يتسبب في الخلايا دفع نحو الحواف حيث أنها تستقر لأن السرعة في الحدود قريبة من الصفر. الترسب أو تسوية للخلايا في الأنبوب، وبالتالي يقلل من كفاءة تغليف كما هو موضح في نتائج تمثيلية حيث لا تطابق البيانات التجريبية باستخدام نموذج التنبؤ.
حل آخر تكييف شيوعاً المستخدمة من قبل العلماء، وتعمل مع ميكروفلويديكس الحبرية، زيادة كثافة وسائل الإعلام ثقافة الخلية بالإضافة لكثافة مطابقة الكواشف مثل إيوديناكسول لمنع الترسب الخلية في المحاقن19. ومع ذلك، كثافة مطابقة الكواشف يمكن أن تؤثر في سلوك الخلوية وسلبيا يؤثر على إفراز سيتوكين الخلايا (البيانات لا تظهر)28.
على الرغم من أن عدة تعديلات صغيرة وكبيرة في الخلية التقليدية تحميل تقنيات أظهرت تحسن طفيف في تغليف الكفاءة، النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها لا تزال لم تتطابق مع الحسابات النظرية. بيد مع تلميح تحميل نهج أننا يمكن في التغلب على خاضعة لقيود الأساليب السابقة والكفاءة التغليف حسب إحصاءات بواسون. هذا الأسلوب ليس فقط مفيداً لتحميل خلايا تعليق ولكن يمكن أيضا تطبيقها لتحميل خلايا ملتصقة، مثل الخلايا الكيراتينيه الأولية و A549 لرقائق موائع جزيئية. عند استخدام خطوط الخلايا وفيرة، على سبيل المثال A549، K562، و ما إلى ذلك، يمكن استخدام حجم عينة أكبر. ولذلك، تبعاً لحجم العينة، يمكن أيضا أن تستخدم ماصة الحجم مختلفة--نصائح وهذا تقنية بسيطة يمكن تكييفها لتغليف وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا التغليف.
بينما خلية منخفض التركيز مطلوب لضمان التغليف للخلايا المفردة في قطرات، المرغوب فيها تركيزات أعلى من الخلايا لزيادة متوسط عدد الخلايا مغلفة في كل قطره للدراسات المتصلة بالخلية الأقران. هناك العديد من الطرق الخلايا المفردة التي قد وصفت سابقا للخلايا المناعية زوج على رقائق موائع جزيئية أو ميكروفابريكاتيد نانوويلس29،،من3031. في ميكروفلويديكس الحبرية، يملي الإحصاءات Poisson تلك الخلية 1:1 الأقران لنوعين من خلايا مختلفة يمكن أن يتحقق بتركيزات الخلية أمثل. استناداً إلى التنبؤ بواسون، هناك أيضا احتمال أن قطرات قد تحتوي على تركيبات أخرى. بينما الأقران الخلية 1:1 يمكن أن تكون مرغوبة لدراسة التفاعلات الخلوية على مستوى الخلية الواحدة والنتائج في زيادة فهم الخلوية، الاقتران خلية متعددة أيضا مزايا رئيسية. أنها تسمح لفهم تأثير خلايا متعددة من نوع واحد من الخلايا على نوع الخلية الأخرى. عبر نقاش بين الخلايا المناعية المختلفة يساعد على توليد استجابة مناعية فعالة ضد العديد من الأمراض ومسببات الأمراض وأيضا يضيف متانة ل الجهاز المناعي لدينا32. على هذا النحو، يمكن استجوابه الاتصالات الخلوية بدقة عالية في سياقات مختلفة، مثلاً، 1:1، 2:1، 1:2، 2:2، 3:1، إلخ. فهم زيادة الغلة في كيفية واحدة أو أزواج من الخلايا التحكم تحريض الاستجابات المناعية. هذا مثير للاهتمام لا سيما لدراسة قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا cytotoxic T بقتل متسلسل على الخلايا الهدف منها على سبيل المثال.
كما تمت مناقشته، لتغليف متعددة الخلايا في قطرات، المرغوب فيها تركيزات أعلى الخلية. ومع ذلك، عند تحميل خلايا من مدخل واحد لتغليف الخلايا، يمكن أن يسبب تركيزات أعلى من عينة خلية الخلايا للتجميع في المدخل. هذه النتائج في انخفاض أسعار التغليف والانحراف أعلى من القيم النظرية. لتجنب هذه المشكلة، يمكن تحميل الخلايا من مداخل منفصلة اثنين كذلك. نظرياً، سيكون من الممكن لتطوير أجهزة موائع جزيئية أخرى مع مداخل متعددة لتحقيق مستويات أعلى لتغليف الخلايا حيث ما يبرره في متوسط على x عدد الخلايا. أننا في هذه الدراسة التحقيق في كفاءة تغليف الخلايا T جوركات عند تحميلها من مدخل واحد واثنين من مداخل استخدام نفس التركيز الكلي والحصول على كفاءة تغليف مماثل. ويسمح هذا التعديل الباحثون إلى أنواع مختلفة من الخلايا زوج على رقاقة.
بينما الإيدز هذا الأسلوب في تحميل خلايا لأجهزة موائع جزيئية دون فقدان كبير للخلايا، هناك بعض الاحتياطات التي يلزم أن يوضع في الاعتبار. عند ملء المحاقن مع الزيوت المعدنية ويسفط العينة الخلية في نصائح ماصة، وينبغي تجنب إدماج فقاعات الهواء والنظام بأكمله ينبغي أن تكون خالية من الهواء. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أنه لا ينبغي خلط الزيوت المعدنية مع العينة. ينبغي إدراج نصائح ماصة، التي تحتوي على عينات، راسخا في مداخل الجهاز موائع جزيئية، مع أقصى درجات الحيطة، لمنع التسرب، وكذلك إدماج فقاعات الهواء. وباختصار، هو تلميح-تحميل تقنية مباشرة، ومع ذلك، قوية تسمح بتحليل الفائق للسلوك الخلوية عن طريق التغليف خلية دون خسارة كبيرة للخلايا بطريقة فعالة من حيث التكلفة. عند استخدامها مع تركيزات العينة المثلى عند المدخل، هذا النهج لتحميل خلايا ماصة-نصائح مرنة جداً ويمكن تكييفها لأنواع خلايا مختلفة، خاصة بالنسبة للخلايا المناعية الأولية نادرة، للحصول على مستوى أعلى من الكفاءة التغليف، قريبة نماذج التنبؤ.
Disclosures
ليس لدينا شيء الكشف عنها.
Acknowledgments
ونحن نشكر "جامعة آيندهوفن للتكنولوجيا" لدعم سخي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol | Sigma-Aldrich | 171468-5G | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane | Fluorochem/UK | S13150 | Silane (toxic) |
| Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten | Fisher Scientific | 10630694 | Syringe |
| Biopsy Punch 1.2 mm | Harris Uni-Core | ||
| Cell Proliferation Dye eFluro 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| CellTrace Far Red Cell | Invitrogen | C34564 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendrof Tubes | Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL | |
| Glass Slide | Sigma Aldrich | CLS294775X38-72EA | Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm |
| Harvard Pumps | Harvard Apparatus | C-400750; C-400727 | Syringe pumps |
| HFE-7500 3M Novec Engineered fluid | Fluorochem/UK | 51243 | Flourinated oil |
| Kai Biopsy Punch 5 mm | Amstel Medical | 1980130 | |
| Luer stub | Instechlabs/USA | LS20S | Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile |
| Mineral oil (Light) | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Tablets |
| Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) | Sphere Fluidics | 020317-09 | Surfactant |
| Plasma Asher | Emitech | K1050X | Plasma asher |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Silicone Elastomer Base 184 | Sylgard | 9355218 | PDMS base |
| Silicone Elastomer Curing Agent | Sylgard | 9355218 | Curing Agent |
| Stainless steel catheter coupler | Instechlab/USA | SC20/15 | 20ga x 15mm, non-sterile |
| TFE Teflon Tubing | Sigma-Aldrich | 58696-U | PTFE Tubing L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in. |
| Thinky mixer ARE-250 | EX-4025F | Conditioning mixture |
References
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
- Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
- Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P.
- Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
- den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
- Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S.
- Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
- Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
- Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
- Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
- Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
- Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
- Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
- Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
- Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
- Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
- Whitesides, G. M., Stroock, A. D.
- Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
- Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
- Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
- Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
- Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
