Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

En Pipette-Tip baseret metode for såning celler til dråbe mikrofluid platforme

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol for såning sparsomme befolkning af celler ved hjælp af pipette-tips til dråbe mikrofluid enheder for at give højere indkapsling effektivitet af celler i dråber.

Abstract

Blandt forskellige mikrofluid platform design ofte brugt for cellulære analyse, giver droplet-mikrofluidik en robust værktøj til at isolere og analysere celler i én celle-niveau ved at fjerne eksterne faktorers påvirkning på trådløse mikromiljø. Indkapsling af celler i dråber er dikteret af Poisson-fordeling som en funktion af antallet af celler i hver dråbe og det gennemsnitlige antal celler pr. volumen af droplet. Primærelementer, især immunceller, eller kliniske prøver kan være knappe og tab-mindre indkapsling af celler er stadig en udfordring. I dette papir præsenterer vi en ny metode, der bruger pipette-tips til ladning celler til droplet-baserede mikrofluid enheder uden betydelige tab af celler. Med forskellige celletyper demonstrere vi effektiv celle indkapsling i dråber, der nøje svarer til indkapsling effektivitet forudsagt af Poisson-fordelingen. Vores metode sikrer tab-mindre belastning af celler til mikrofluid platforme og nemt kan tilpasses til downstream enkelt celle analyse, f.eks., at afkode cellulære vekselvirkninger mellem forskellige celletyper.

Introduction

I de seneste år har brugen af mikrofluidik som en robust og alsidig platform for cellulære analyser på enkelt celle hurtigt øget1. Disse platforme giver high throughput screening af enkelt celler og biologiske molekyler med høj præcision og følsomhed ved hjælp af meget lille udsnit volume2,3,4. Blandt forskellige typer af mikrofluid designs aktiverer droplet-baserede platforme høj overførselshastighed analyse af enkelt celler ved at isolere dem i en vandig fase dråbe omgivet af en ikke-blandbare fase, der giver mulighed for præcis og nøjagtig kontrol over trådløse mikromiljø5,6. Droplet-baserede mikrofluidik giver fleksibilitet til at isolere én eller flere celler i, både vandige og hydrogel dråber og er værdifulde i sondering komplekse cellulære adfærd, såsom protein sekretion eller cellulære vekselvirkninger7, 8 , 9. signal- og cross-talk blandt immunceller kan være påvirket af interaktioner med andre celler i mikromiljø10. Isolering af enkelt celler i dråber giver en effektiv støj-fri analytiske laboratorium, fri for påvirkning af ydre miljømæssige faktorer for mere effektiv og præcis resultater11,12. Ændre designet af en droplet-mikrofluid platform med flere fjorde tillader indkapsling af flere celletyper til at studere cellulær interaktioner via celle-parring12,13.

Processen med indkapsling af celler i dråber er tilfældige og satsen for indkapsling af celler statistisk kan bestemmes ved hjælp af formlen for Poisson-fordelingen14,15. Denne sats af indkapsling kan estimeres ved at betragte den gennemsnitlige sats for ankomsten af celler ved droplet krydset og antages det, at ankomsten af hver celle er uafhængig fra ankomsten af andre celler16. Selv om uafhængige celle ankomst ikke kan garanteres, i tilfælde af tyndt fordelt celler, kan betragtes som forudsætning af uafhængighed og sandsynligheden for et slipværktøj, som indeholder en eller flere celler kan forudsiges som en funktion af antallet af celler stede i hver dråbe og det gennemsnitlige antal celler pr. droplet16,17. Da denne vurdering af cellulære indkapsling i dråber er afhængig af antallet af celler i hver dråbe, kan man foreslå at øge koncentrationen af celler på fjorden vil øge den gennemsnitlige antal celler i hver dråbe 16. derfor, for at sikre enkelt celle indkapsling, celle koncentrationer skal reduceres men dette ofte fører til et stort antal tomme dråber18.

Tab af celler under indlæsning af enten vedhæftet fil, bundfældning, sammenklumpning i sprøjten, slanger eller produktion enhed er en fælles ulempe ansvarlig for afvigelsen mellem faktiske indkapsling værdier fra den forudsagte indkapsling værdier19 . Dette problem får yderligere overdrevet når såning sjældne immunceller eller kliniske prøver, som de allerede knappe i befolkningen og indkapsling af kun få celler, meget lavere end forventet, giver ikke tilstrækkelige data for eksperimentel analyse. Plasmacytoid dendritiske celler (PDC'er) er en sjælden undersæt af immunceller, der kun udgør cirka 0,2 - 0,6 procent af den hele hvide blod celle befolkning20. Disse celler udskiller massive mængder af type I-Interferoner ved aktivering og dermed spille en kritisk rolle i immunrespons21. Når man studerer den cellulære opførsel af sådanne sjældne celler i dråber, er det nødvendigt at forhindre celletab under celle såning og indkapsling22. Der er flere design relaterede udviklinger, der har sikret indkapsling i enkelt celler i dråber aktive indkapsling metoder, der anvender forskellige fysiske kræfter såsom akustiske eller elektriske kræfter for generation af dråber, der indeholder Single-celler23,24. Men disse metoder har deres egne begrænsninger med hensyn til droplet produktion16.

I denne undersøgelse etableret vi en robust og ligetil metode, der omgår manglerne af traditionelle metoder til indlæsning af en eller flere celler til mikrofluid enheder. Vores metode, inspireret af Rho et al., udnytter anderledes størrelse pipette tips til såning små mængder af sjældne immunceller til dråbe mikrofluid platforme uden betydelige prøve tab og givet resultater, der er sammenhængende med teoretiske forudsigelser25. Denne metode kan være let og med held tilpasset for flere ansøgninger, der involverer droplet-baserede mikrofluidik og anvendes til en lang række celletyper eller endda mikropartikler.

Protocol

1. 3-indløb Polydimethylsiloxan (PDMS) enhed fabrikation

  1. Måle 40 g af PDMS base i en conditioning mixer cup og tilføje 4 g af PDMS hærder til den base reagens i cup, omhyggeligt, ved hjælp af en pipette.
  2. Placer kop i indehaveren af conditioning mixer og måle den samlede vægt af cup med indehaveren. Indstille værdien af centrifuge balance vægt på conditioning mixer i overensstemmelse hermed.
  3. Bland basen og hærdning agent i conditioning mixer ved 2.000 omdrejninger i 2 min. efterfulgt af de fråde 2,000 rpm i 2 min.
  4. Forberede en aluminium båd, med en diameter på cirka den samme størrelse som en 100 mm silicium wafer. Placer silicium wafer, fabrikeret for replikaen molding proces i aluminium båd og sætte denne opsætning i en petriskål (diameter = 120 mm, højde = 20 mm).
    Bemærk: Størrelsen af petriskålen afhænger af størrelsen af silicium wafer.
  5. Fjern kop fra indehaveren og hæld før cured PDMS blandingen (indholdet af kop), omhyggeligt, på silicium wafer.
  6. Placer petriskål, som indeholder silicium wafer med før cured PDMS blandingen i en ekssikkator i ca 20 min. til at fjerne alle luftboblerne.
  7. Fjerne petriskålen efter 20 min og kontrollere for eventuelle resterende luftbobler, der kan fjernes.
  8. Placer petriskålen i en ovn, indstillet på 65 ° C i mindst 3 timer.
  9. Fjern petriskålen fra ovnen efter 3 h og omhyggeligt skræl den hærdede PDMS fra silicon wafer.
  10. Skære PDMS enheder langs de stiplede linjer, ved hjælp af en kniv eller en skalpel. Punch huller på indløb og udløb af hver enhed ved hjælp af en 1,2 mm puncher. Ren hver PDMS enhed med scotch tape til at fjerne noget støv eller resterende stykker af PDMS.
    1. Du kan eventuelt slag med kvælstof til at fjerne resterende PDMS stykker.
  11. Forbered glas dias ved at rense dem med sæbevand, efterfulgt af isopropanol og tør med kvælstof.
  12. Bond en ren PDMS enhed med et rent glas dias i en plasma asher lukke flow linjer. Brug følgende indstillinger: Power: 50 W, tid: 45 s, bløder forsinkelsestid: 2 s, proces gas: Gas 1 (luft), Vent: begge ventiler, begrænset lufte tid: 60 s, pumpe spin ned tid: 10 s, Vent hold tid: 0 Sørensen, Gas afspærring tid: 1 s, Turbo pumpning aktiveret : 0. Frakobl alle andre gasledninger.
    Bemærk: Indstillingerne anvendes til plasma asher kan variere afhængigt af mærke af plasma asher anvendes.
  13. Forbered silan løsning ved at tilføje 50 µL af silan (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) til 950 µL af fluorholdige olie.
    Bemærk: Silan er giftigt. Venligst operere under stinkskab.
  14. Tegne rede silan løsning i en sprøjte, der er tilsluttet en Teflon slanger.
  15. Salinize enheden ved gennemskylning rede silan løsning gennem outlet af enheden.
  16. Placer enheden i en ovn, indstillet på 65 ° C i 30 min.
  17. Fjerne den salinized enhed fra ovnen og skylle overskydende silan ud af enheden med fluorholdige olie.
  18. Placer enheden tilbage i en ovn, indstillet på 65 ° C i mindst 1 time at fuldføre limning processen.
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

2. tab-mindre celle indkapsling

  1. Celle høst
    1. Genopslæmmes Jurkat T-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium i koncentrationer på 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, 4.0x106 celler/mL og 8.0x106 celler/mL; Fremdaterede i hæmatopoietisk serumfrit kultur medier (f.eks., X-VIVO 15) i koncentrationer på 1.3x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL og 13.0x106 celler/mL; A549 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) i en koncentration på 1.0x106 celler/mL.
      Bemærk: Typen celler og koncentration af celler kan variere afhængigt af eksperimentet. Mærkning af celler kan også gøres baseret på forsøget.
  2. Tip-loading for vandige droplet generation
    1. Forberede fluorholdige olie med 3% biokompatible overfladeaktivt blanding ved tilsætning af 3 mL overfladeaktivt stof til 2 mL af fluorholdige olie.
      Bemærk: Koncentrationen af det overfladeaktive stof tilføjes fluorholdige olie bestemmer stabilitet af emulsion for forskellige inkubation perioder. Koncentrationen af det overfladeaktive stof varierer afhængigt af mediet bruges til specifikke celletyper.
    2. Tegne fase olieblanding i en sprøjte (1 mL). Fjerne luftbobler fra sprøjten og tilsluttes en Teflon slanger i passende længde.
    3. Forbered en prøve sprøjte ved tegning biokompatible mineralsk olie i en sprøjte. Fjerne luftbobler og tilslutte sprøjten til en Teflon slanger i passende længde.
    4. Punch et PDMS plug med en diameter på 5 mm fra en hærdet PDMS slab.
      Bemærk: Den hærdede PDMS slab kan forberedes ved hjælp af trin 1.1 til 1.9. Brug en almindelig silicium wafer i stedet for en opdigtet silicium wafer.
    5. Punch et hul i midten af plug med en 1 mm puncher.
    6. Sæt stikket i en 200 µL pipette tip, fra den større ende, således at det passer stramt.
      Bemærk: Brug en 1.000 µL pipette tip for større stikprøve volumen og større celler. For 1.000 µL pipette tip, kan stik med en diameter på mellem 5 og 7 mm bruges. Med et stik af diameter 5 mm, et sample volumen på ca. 400 µL kan være indsugning i pipette tip. Hvis et stik af større diameter er brugt (7 mm), kan være indsugning mere sample volumen (omkring 900 µL).
    7. Indsæt slangen, som er forbundet med sprøjte, i PDMS-stik, som er blevet indsat i pipette tip. Skubbe sprøjte stemplet langsomt til at fylde den tilsluttede pipette spids med mineralsk olie. Skubbe ud alle de resterende luft fra pipette tip.
    8. Sænke pipette tip, tilsluttet sprøjten i prøveopløsningen og Opsug omkring 150 µL af prøven i spidsen.
    9. Gentag trin 2.2.4 til 2.2.8 til at forberede en anden prøve sprøjte.
    10. Omhyggeligt placere alle de tre rede sprøjter på sprøjten pumpe.
    11. Indsætte begge pipette tips, der indeholder eksemplet i de to indre fjorde PDMS chip. Indsæt rør indeholdende olie fase blanding i den ydre Fjord.
    12. Angiv værdien af strømningshastigheder på sprøjten pumpe som følger: kontinuerlig fase løsning: 600 µL/h, celle prøver: 100 µL/h, hver. Indtast og angive dimensionerne af sprøjten.
      Bemærk: Diameter indstillinger vil variere baseret på typen af sprøjten.
    13. Start pumpen til at skylle prøveopløsningen via indre kanaler af enhed og olie gennem den ydre kanal for enheden.
    14. Tilslut en slange af passende længde til outlet at starte indsamling dråberne når droplet-dannelse er stabil. Tidspunktet for indsamlingen varierer baseret på forsøget.
    15. Saml dråber i en lock tube. Tilføje 200 µL RPMI medie (uden serum) på toppen af de indsamlede dråber og inkuberes prøven.
      Bemærk: Inkubation tid af de indsamlede dråber varierer baseret på forsøget. Dråber opsamles i en lock tube, når strømmen flowcytometri-baserede analyse eller isolering udføres efter hentning af celler fra dråber ved at bryde emulsionen. Det er muligt at indsamle dråber i et glas kammer, hvis eksperimentet kræver i droplet mikroskopisk analyse.
  3. Emulsion breaking og celle hentning for flow cytometric analyse
    1. Forberede 20% 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (PFO) løsning (v/v) i fluorholdige olie ved tilsætning 2 mL af PFO i 10 mL af flourinated olie.
    2. Fjern overskydende olie fra bunden af collection tube, som indeholder dråber, ved hjælp af en sprøjte.
    3. Tilføje 100 µL af 20% PFO løsning til emulsion til at bryde emulsionen og frigive de indkapslede celler i den vandige fase. Tryk og bland kortvarigt. Gøre ikke vortex på dette punkt. Inkuber i 1-2 min.
      Bemærk: Mængden af PFO tilføjet afhænger af mængden af dråber produceret. Holde tilføje yderligere PFO indtil olien lag er helt opløst. Husk på at PFO er giftigt for celler og at alt for høje PFO koncentrationer eller for lang inkubationstid i PFO kan føre til øget celledød.
    4. Spin løsning kort på de laveste mulige genbrugsfibre for 30 s.
    5. Forberede 100 mL koldt Phosphate-Buffered saltvand (PBS) løsning suppleret med 2% føtal kalv Serum (FCS) (2 mL af FCS i 98 mL PBS).
    6. Afpipetteres 550 µL af den vandige del, umiddelbart efter centrifugering og overføre det til en ny lock tube indeholder 500 µL af kolde PBS løsning suppleret med 2% FCS, som er udarbejdet i trin 2.3.5. Lad enhver resterende olie synke til bunden af den nye lock tube.
    7. Opsug 950 µL af den vandige fase, der indeholder celler fra denne lock tube, omhyggeligt, uden sugning enhver resterende olie og opløsningen overføres til en ny lock tube.
    8. Spin ned celler i den nye lock tube i 10 min.
    9. Cellerne genopslæmmes i 300 µL koldt PBS løsning suppleret med 2% FCS, som er udarbejdet i trin 2.3.5.
      Bemærk: Cellerne kan også re suspenderes i enhver anden egnet løsning såsom medier afhængigt af eksperimentet. Pletten celler, baseret på eksperimentet, for analyse ved hjælp af flowcytometri.

3. celle parring

  1. Celle høst og farvning
    1. Tælle Jurkat T celler, fra kultur kolbe, og spin-ned celler på 1.500 rpm i 5 min.
    2. Fjern supernatanten og genopslæmmes 1.0x106 celler i 1 mL PBS til at få en koncentration af 1.0x106 celler/mL. PBS tilføjet afhænger af celletal.
    3. Gentag trin 3.1.1 til 3.1.2 til at forberede en ny proeve af Jurkat T-celler med den samme celle koncentration.
    4. Vaske begge prøver to gange med 1 mL PBS på 1.500 rpm i 5 min.
    5. Genopslæmmes én celle prøve med 1,25 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) farvestof og andre celle prøven med 1,25 µM langt rødt farvestof eller 1,25 µM celle spredning farvestof i en celle koncentration på 1.0x106 celler/mL. Alt farvning løsning er 1 mL til 1.0x106 celler.
      Bemærk: Celler kan mærkes med forskellige farvestoffer afhængigt af de filtre, der er tilgængelige i flow forskellige eller fluorescens mikroskop.
    6. Inkuber celle prøver med farvestoffer i 10 minutter ved 37 ° C.
    7. Farvning reaktionen standses ved tilsætning af 1 mL af is kold FCS efter 10 min.
    8. Vask celle prøver to gange med 1 mL PBS på 1.500 rpm i 5 min.
    9. Genopslæmmes celle prøver i RPMI medier i en koncentration på 10.0x106 celler/mL, for hver farve.
  2. Tip-loading til produktion af Agarosen hydrogel dråber til celle parring
    Bemærk: For celle parring ved hjælp af Agarosen hydrogel dråber, holde temperaturen af ordningen mellem 27 ° C og 37 ° C under hele droplet generation og samling at forhindre geldannende af hydrogels og garanterer cellulære levedygtighed9.
    1. Opløses Ultra-Low geldannende temperatur Agarosen ved varme det op til 75 ° C i PBS ved en koncentration på 4% (w/v) og rør blandingen i 20 min.
    2. Bland Agarosen løsning med mærket Jurkat T celler for at give en Agarosen koncentration 2% (w/v). Gentag dette for anden prøven med forskelligt mærkede celler.
    3. Forbered fluorholdige olie med 2% overfladeaktivt stof blanding ved at tilføje 20 mL af overfladeaktive stoffer til 30 mL af fluorholdige olie (olieblanding fase).
    4. Følg trin 2.2.2 - 2.2.14.
      Bemærk: På grund af den tyktflydende karakter af lav smeltepunkt Agarosen og at sikre stabile droplet produktion, angive værdien af strømningshastigheder på sprøjten pumper som følger: olie fase blanding: 2.000 µL/h, celle prøver: 200 µL/h. Angiv og angive dimensionerne af sprøjten.
    5. Saml dråber i en lock tube og inkuberes dråber ved 4 ° C i 60 min.
  3. Emulsion bryde og Agarosen perle hentning for FACS analyse
    1. Efter inkubation af droplets til 60 min, fjerne overskydende olie fra lock tube, som indeholder dråber, ved hjælp af en sprøjte.
    2. Tilføje 200 µL af PFO til at fjerne olie interphase fra dråber.
      Bemærk: Mængden af PFO føjet til røret afhænger af mængden af dråber produceret. Holde tilføje yderligere PFO indtil olien lag er helt opløst.
    3. Vask de indsamlede Agarosen perler to gange med 1 mL koldt PBS til at fjerne olie helt ved centrifugering ved 1.500 rpm i 10 min.
    4. Analysere indsamlet Agarosen perler ved hjælp af flowcytometri.
      Bemærk: Det er også muligt at observere perler under et fluorescens mikroskop.

Representative Results

For vores eksperimenter brugte vi en 3-indløb PDMS baseret mikrofluid enhed med højden af 25 mikron (figur 1). I denne Enhedsopsætning brugte vi den ydre indløb til at skylle olie med overfladeaktivt stof og de to indre fjorde for rødmen vandfase med celle suspensioner eller medier. Efter generation og samling inkuberes dråber i et par timer off chip før downstream analyse ved hjælp af flow flowcytometri. Under inkubationstiden, kan serum komponenter i medierne interagere med det overfladeaktive stof og forårsage droplets til at blive ustabilt og smuldre. Det er derfor vigtigt at tilføje en optimeret koncentration af overfladeaktive stoffer til fluorholdige olie. Vi har testet stabiliteten af monodispersed dråber indeholdende hæmatopoietisk serumfrit kultur medier suppleret med 2% human serum med forskellige koncentrationer af det overfladeaktive stof i fluorholdige olie. Det kan udledes fra figur 2 , at disse monodispersed dråber er yderst stabil i op til 24 timer, når mindst 3% overfladeaktivt stof er føjet til olie-fase. Lignende resultater blev opnået med RPMI medier med og uden tilsætning af 10% FCS (data ikke vist). Derfor er droplet stabilitet stærkt afhængige af optimal overfladeaktivt koncentrationer når du arbejder med forskellige kilder af dyrkningsmedier og serum komponenter.

For at demonstrere indkapsling effektiviteten af vores tilgang seedede vi først celler ved hjælp af slange tilsluttet sprøjter, som er den mest konventionelle tilgang til såning celler (fig. 3A). Vi høstede Jurkat T-celler ved forskellige koncentrationer af 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL og 4.0x106 celler/mL og opnået en indkapsling effektivitet, der var lavere end de forventede værdier (fig. 3B). På 1.0x106 celler/mL var brøkdel af dråber, der indeholdt en enkelt celle 2,5%, som ikke steg selv ved hjælp af højere celle koncentrationer. For at øge celle-loading effektivitet, vi ændret vores tidligere tilgang og monteret slangen på halv længde til en forhøjet stativ og indlæst cellesuspension i den halvdel, der var knyttet til PDMS enhed (figur 4A). Brug denne fremgangsmåde, indkapslet vi Jurkat T-celler ved forskellige koncentrationer af 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, og 4.0x106 celler/mL, og også sjældne fremdaterede ved forskellige koncentrationer af 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, og 12.0x106 celler/mL. Vi forventede forbedrede indkapsling priser ved at forhindre cell bundfældning med denne metode. Men ved alle koncentrationer testet, de eksperimentelle resultater var meget lavere, at den forudsagte Poisson værdier (fig. 4B og figur 4C).

Brug vores tip-loading tilgang vi optimeret vores celle indkapsling satser for at opnå eksperimentelle resultater sammenhængende med de statistisk beregnede værdier (figur 5A). Forskellige koncentrationer af Jurkat T-celler matchede de opnåede indkapsling effektivitet vores beregnede værdier ved alle koncentrationer (figur 5B). Bemærkelsesværdigt, selv med vedhængende celler som A549 tumorceller, som har tendens til at klumpe, konstaterede vi en lidt forbedret indkapsling effektivitet ved en cellulær koncentration på 1.0x106 celler/mL (figur 5C). Vi vurderede også effekten af vores system til at indkapsle mindre tilgængelige og knappe fremdaterede ved forskellige koncentrationer af 1.0x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL og 13.0x106 celler/mL (fig. 5D). For at lette læsning af muligvis større mængder overstiger 200 µL, f.eks., når du arbejder med cellelinjer eller mere rigelige primære immunceller, vi også undersøgt celle indkapsling effektivitet ved hjælp af 1000 µL tips (blå). Vi viste, at disse 1.000 µL tips gav et lignende indkapsling effektivitet i forhold til de 200 µL tips (gul) (figur 5E).

Afhængig af chip design og forskning spørgsmålet ved hånden, vores tip loading teknik kan bruges til at indlæse celler gennem enten en indløb, for sondering ind i cellulære heterogenitet, eller flere fjorde parallelt for at afkode cellulære vekselvirkninger. Vi sammenlignede indlæsningen af Jurkat T-celler (i en koncentration på 10.0x106 celler/mL) fra én indgang til to anderledes mærket populationer af Jurkat T-celler (i en samlet koncentration på 10,0 x106 celler/mL) fra to fjorde (figur 6 A og figur 6B). Under indkapsling, blev dråber genereret ved hjælp af ultra-lav geldannende temperatur Agarosen og geléagtig efter produktionen til form Agarosen hydrogel perler, der tillod efterfølgende downstream analyse via mikroskopi og flow flowcytometri (figur 6 C og figur 6D). Mikroskopisk analyse afslørede, at celle parring blev opnået på forskellige kombinationer med angivelse for høj overførselshastighed celle parring (figur 6C). Derudover analyse af den samme befolkning af hydrogel perler ved flowcytometri afslørede, at perler uden celler kunne adskilles fra perler med celler baseret på de forskellige frem (FSC, størrelse) og sideward (VSK, granulering) scatter mønster (figur 6 D). Gating på befolkningen i perler uden celler bekræftet en mangel på celle indkapsling af fraværet af fluorescerende signaler. Derudover afsløret gating på befolkningens perle med celler eksistensen af flere delpopulationer vejledende for indkapsling af forskelligt mærket Jurkat T-celler. Vores resultater viser, at effektiv celle parring kan opnås, baseret på både mikroskopiske og flow cytometric analyse, og viste en let øget indkapsling effektivitet i forhold til Poisson forudsigelse (fig. 6E).

Figure 1
Figur 1 . PDMS baseret dråbe mikrofluid enhed med tre fjorde og med en indbyrdes centerafstand. Enheden består af tre fjorde for kontinuerlig olie fase, celle Kulturmedier og cellesuspension, henholdsvis. De genererede dråber er indsamlet ved afgangen. Prøverne flow laminarly strøm-fokusere krydset hvor de er indkapslet i dråber. På fjorde, filter strukturer hold store partikler som protein eller celle aggregater tilbage. Diameteren af hullerne i filter strukturen er angivet med blå linjer. Diameteren af kanaler på dysens produktion er markeret med røde streger. Kanal højden på hele chip var 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Droplet stabilitet over 24 timers. Graferne viser området af dråber indeholdende hæmatopoietisk serumfrit kultur medier + 2% human serum, over tid for tre forskellige koncentrationer af det overfladeaktive stof A) 0,5% B) 3% C) 5%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Slangen baseret celle lastning tilgang. Jurkat-T-celler er indlæst i forskellige koncentrationer til enheden ved hjælp af en sprøjte tilsluttet slanger. A) i illustration vises opsætningen af eksperimenterende B) indkapsling cellehastighed som bestemt ved lysmikroskopi. Prikker: bestemmes eksperimentelt værdier; Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Fejllinje repræsenterer standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Indkapsling af forskellige celletyper i forskellige koncentrationer ved hjælp af et lodret rør lastning tilgang. Jurkat T-celler og fremdaterede (af forskellige koncentrationer) var indkapslet for at bestemme effektiviteten af cellen indkapsling. A) i illustration viser den eksperimentelle setup for den lodrette rør lastning tilgang. B) grafen viser indkapsling effektiviteten af Jurkat T celler. C) grafen viser fremdaterede indkapsling effektivitet. Prikker: bestemmes eksperimentelt værdier; Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Fejllinje repræsenterer standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Tip lastning tilgang til at indkapsle forskellige celler typer. A) skematisk illustration af spidsen loading teknik. B) grafen viser indkapsling effektiviteten af Jurkat celler. C) grafen viser indkapsling effektiviteten af A549 celler. D) grafen viser fremdaterede indkapsling effektivitet. E) grafen viser indkapsling effektiviteten af Jurkat T celler ved hjælp af 200 µL pipette tips (gul) og 1.000 µL pipette tips (blå). Prikker: bestemmes eksperimentelt værdier; Lukket linjer: Poisson-fordelingen. Fejllinje repræsenterer standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Celle parring i dråber. A) skematisk illustration af spidsen lastning tilgang til parring særskilte celler fra 2 fjorde i dråber. B) grafen viser indkapsling af Jurkat T celler ved hjælp af en indgang eller to fjorde parallelt. Den celle koncentration af et tip er 2.0x106 celler/mL og celle koncentration for to tips begge 1.0x106 celler/mL. Prikker: bestemmes eksperimentelt værdier; Lukket linjer: Poisson-fordelingen. C) The fluorescens mikroskopiske overlays hydrogel perler og mærkede Jurkat T-celler. D) Grafen viser flow cytometric analyse af parret celler i Agarosen hydrogel perler. Plottet viser både forward scatter og sidelæns scatter. E) sammenligning af celle numre i Agarosen hydrogel perler som opdaget af Fluorescens mikroskopi og flow flowcytometri. Barer: mener værdi; Whiskers: standard fejl af mean, n ≥ 4. Fejllinje repræsenterer standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne protokol, har vi vist en effektiv og enkel teknik til at indlæse og indkapsle celler i dråber for høj overførselshastighed, encellede analyse og til at udføre kontrollerede celle parring af cellulære interaktion undersøgelser. Desuden har vi sammenlignet flere konventionelle metoder til at indlæse celler til mikrofluid enheder og viste, at vores tip lastning tilgang er en mere effektiv teknik i forhold til andre metoder.

At studere kliniske prøver eller sjældne celletyper knappe i antallet af droplet-baserede mikrofluidik besidder nogle iboende udfordringer. Som vi også har demonstreret, celler har tendens til at sediment i sprøjter og overfladen af slangen, derved, at forhindre cellulære indkapsling i overensstemmelse med de forventede værdier. For at omgå dette problem, bruge nogle grupper omrøring barer i sprøjter. Når du bruger sjældne og begrænset cellepopulationer, er den samlede cellevolumen dog også begrænset, derved begrænse brugen af store sprøjter og omrøring barer. Desuden, vi også erstattet mere almindeligt anvendte slanger med Teflon belagt slanger for at forhindre cell vedhæftet fil, men denne metode forbedre ikke resultaterne og hvis slangen er for lang, problemet med celle vedhæftet fil forværrer (data ikke vist). Alternativt, brugte vi et lodret rør lastning tilgang hvor cellerne blev indlæst i slangen og ikke sprøjte til at forhindre tab af celler i stor sprøjte diskenheder. Brug af denne teknik, kan celler med lille udsnit volumen indlæses, fx fremdaterede, som er sjældne og begrænset. Også, prøve fra slangen er lastet til enheden vertikalt til at forhindre cell sedimentering. Slangen anvendes til celle såning har små dimensioner og kan sammenlignes med microchannels. Flowet i slangen er pres drevet og følger en parabolsk velocity profil26. Dette indebærer, at den maksimale flow hastighed er i midten af slangen og mindste hastighed er på kanten af slangen27. Når skylning en befolkning af celler gennem slangen, får velocity gradient cellerne til at blive skubbet mod kanterne hvor de slå sig ned fordi hastigheden på grænsen er tæt på nul. Bundfældning eller bilæggelse af celler i slangen, dermed reducerer indkapsling effektivitet, som vist i de repræsentative resultater, hvor eksperimentelle data ikke stemte overens med den forventede model.

En anden almindeligt tilpasset løsning bruges af forskere, arbejder med slipværktøj mikrofluidik, er at øge tætheden af celle kultur medier ved tilsætning af tæthed matchende reagenser som Iodinaxol at hindre celle bundfældning i sprøjter19. Men tæthed matchende reagenser kan påvirke cellulære adfærd og negativt påvirker cytokin sekretion af celler (data ikke vist)28.

Selv om adskillige små og store ændringer i konventionel celle lastning teknikker viste små forbedringer i indkapsling effektivitetsfordele, de opnåede forsøgsresultater stadig svarede ikke til de teoretiske beregninger. Dog med spidsen lastning tilgang kunne vi at overvinde begrænsningerne af tidligere metoder og indkapsling effektivitet omfattet af Poisson statistik. Denne teknik er ikke kun en fordel for lastning suspension celler, men kan også anvendes til at indlæse vedhængende celler, såsom primær keratinocytter og A549 til mikrofluid chips. Når du bruger rigelige cellelinjer, for eksempel A549, K562, etc., kan større stikprøve volumen bruges. Derfor, afhængigt af mængden af prøven, forskellige størrelse pipette-tips kan også bruges og denne enkle teknik kan tilpasses for både enkelt-celle indkapsling og flere celle indkapsling.

Mens lav celle koncentration er forpligtet til at sikre indkapsling i enkelt celler i dråber, er højere celler koncentrationer ønsket at øge den gennemsnitlige antal celler indkapslet i hver dråbe for undersøgelser i forbindelse med celle parring. Der er flere encellede metoder, der har været tidligere beskrevet at par immunceller på mikrofluid chips eller microfabricated nanowells29,30,31. Droplet mikrofluidik dikterer Poisson statistik at 1:1 celle parring af to forskellige celletyper kan opnås ved optimal celle koncentrationer. Baseret på Poisson forudsigelse, er der også en sandsynlighed for at små dråber kan indeholde andre kombinationer. 1:1 celle parring kan være ønskeligt at studere cellulær interaktioner på enkelt celle niveau og resulterer i øget cellulær forståelse, har flere celle parringen også store fordele. Det giver mulighed for at forstå flere celler i én celletype indflydelse på andre celletype. Cross talk mellem forskellige immunceller bidrage til at skabe en effektiv immunrespons mod flere infektioner og patogener og også tilføjer robusthed til vores immunsystem32. Som sådan kan være afhørt cellulære kommunikation med høj præcision i forskellige sammenhænge, fx 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, osv. højtydende øget forståelse om, hvordan single eller par af celler, styre induktion af immunrespons. Dette er især interessant at studere for eksempel kapacitet af naturlige dræberceller eller cytotoksiske T-celler til at seriefremstillede dræbe deres respektive målceller.

Som drøftet for flere indkapsling af celler i dråber, er højere celle koncentrationer ønsket. Men når lastning celler fra et indløb til celle indkapsling, højere koncentrationer af celle prøven kan forårsage celler til samlet på fjorden. Dette resulterer i lavere indkapsling priser og højere afvigelse fra de teoretiske værdier. For at omgå dette problem, kan cellerne indlæses fra to separate fjorde samt. Teoretisk set, ville det være muligt at udvikle andre mikrofluid enheder med flere indløb til at opnå endnu højere niveauer af celle indkapsling hvor et gennemsnit på x antal celler er berettiget. I denne undersøgelse undersøgte vi indkapsling effektiviteten af Jurkat T celler når indlæst fra både et indløb og to indløb ved hjælp af den samme samlede koncentration og opnået lignende indkapsling effektivitet. Denne ændring gør det muligt for forskere at par forskellige celletyper på chip.

Mens denne metode aids i indlæsning af celler til mikrofluid enheder uden betydelige tab af celler, er der visse forholdsregler, der skal holdes for øje. Ved påfyldning af sprøjter med mineralsk olie og sugning celle prøven i pipette tips, inkorporering af luftbobler undgås og hele systemet skal være luft-fri. Det er også vigtigt at huske, at mineralsk olie ikke bør blandes med prøven. Pipette tips, der indeholder prøver, bør indsættes fast i fjorde i mikrofluid indretning, med yderste forsigtighed, at forhindre lækage og yderligere inkorporering af luftbobler. For at opsummere, er tip-loading en enkel, men effektiv teknik, der giver mulighed for høj overførselshastighed analyse af cellulære adfærd gennem celle indkapsling uden betydelige tab af celler på en omkostningseffektiv måde. Når det bruges med optimal prøve koncentrationer på fjorden, denne fremgangsmåde for at indlæse celler med pipette-tips er meget fleksibel og kan tilpasses til forskellige celletyper især for sjældne primære immunceller, at opnå højere indkapsling effektivitet, tæt på forudsagte modeller.

Disclosures

Vi har intet at videregive.

Acknowledgments

Vi takker Eindhoven University of Technology for gavmilde støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Tags

Teknik spørgsmålet 144 dråber mikrofluidik Tip lastning Poisson-fordelingen celle indkapsling celle-parring cellulære vekselvirkninger
En Pipette-Tip baseret metode for såning celler til dråbe mikrofluid platforme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter