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Engineering

एक पिपेट-टिप आधारित Microfluidic प्लेटफार्मों छोटी बूंद के लिए कोशिकाओं को बोने के लिए विधि

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं की दुर्लभ जनसंख्या बोने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है-microfluidic उपकरणों छोटी बूंद को बूंदों में कोशिकाओं की उच्च encapsulation दक्षता प्रदान करने के लिए युक्तियां ।

Abstract

विभिन्न microfluidic मंच डिजाइन के बीच अक्सर सेलुलर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, छोटी बूंद-microfluidics सेलुलर पर बाहरी कारकों के प्रभाव को नष्ट करने के द्वारा एकल-कोशिका स्तर पर कोशिकाओं को अलग और विश्लेषण के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है microenvironment । बूंदों में कोशिकाओं के encapsulation प्रत्येक छोटी बूंद में मौजूद कोशिकाओं की संख्या और छोटी बूंद की मात्रा प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या के एक समारोह के रूप में Poisson वितरण द्वारा तय किया जाता है । प्राथमिक कोशिकाओं, विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, या नैदानिक नमूनों दुर्लभ हो सकता है और हानि-कोशिकाओं के कम encapsulation चुनौतीपूर्ण रहता है. इस पत्र में, हम कोशिकाओं की महत्वपूर्ण हानि के बिना छोटी बूंद-आधारित microfluidic उपकरणों के लिए कोशिकाओं को लोड करने के लिए पिपेट-सुझावों का उपयोग करता है कि एक नई पद्धति प्रस्तुत करते हैं । विभिंन प्रकार के सेल के साथ, हम बूंदों में कुशल कोशिका encapsulation है कि बारीकी से encapsulation Poisson वितरण द्वारा भविष्यवाणी की क्षमता से मेल खाती है प्रदर्शन करते हैं । हमारे विधि microfluidic प्लेटफार्मों के लिए कोशिकाओं की हानि कम लोड हो रहा है और आसानी से बहाव एकल सेल विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, विभिन्न कोशिका प्रकार के बीच सेलुलर बातचीत को समझाना सुनिश्चित करता है ।

Introduction

हाल के वर्षों में, एकल सेल स्तर पर सेलुलर विश्लेषण के लिए एक मजबूत और बहुमुखी मंच के रूप में microfluidics के उपयोग तेजी से1बढ़ गया है । इन प्लेटफार्मों उच्च परिशुद्धता और संवेदनशीलता बहुत छोटे नमूना मात्रा2,3,4का उपयोग कर के साथ एकल कोशिकाओं और जैविक अणुओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं । microfluidic डिजाइन के विभिन्न प्रकारों के बीच, छोटी बूंद-आधारित प्लेटफार्मों एक जलीय चरण एक immiscible चरण है कि सेलुलर पर सटीक और सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है से घिरा हुआ छोटी बूंद में उन्हें अलग करके एकल कोशिकाओं के उच्च प्रवाह विश्लेषण सक्षम microenvironment5,6. छोटी बूंद-आधारित microfluidics में एकल या कई कोशिकाओं को अलग करने के लिए लचीलापन देता है, दोनों, जलीय और hydrogel बूंदों और प्रोटीन स्राव या सेलुलर बातचीत के रूप में जटिल सेलुलर व्यवहार की जांच में मूल्यवान है,7, 8 , 9. संकेत और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पार बात microenvironment10में अंय कोशिकाओं के साथ बातचीत से प्रभावित किया जा सकता है । बूंदों में एकल कोशिकाओं का अलगाव एक प्रभावी शोर मुक्त विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला, और अधिक कुशल और सटीक परिणाम11,12के लिए बाहरी पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव से मुक्त प्रदान करता है । एक छोटी बूंद के डिजाइन को संशोधित-एकाधिक के साथ microfluidic मंच-सेल के माध्यम से सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई सेल प्रकार के encapsulation की अनुमति देता है12,13युग्मन ।

बूंदों में कोशिकाओं के encapsulation की प्रक्रिया यादृच्छिक है और कोशिकाओं के encapsulation की दर सांख्यिकीय Poisson वितरण14,15के लिए सूत्र का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । encapsulation की यह दर छोटी बूंद जंक्शन पर कोशिकाओं के आगमन की औसत दर को देखते हुए अनुमान लगाया जा सकता है और यह सोचते है कि प्रत्येक कोशिका के आगमन के16अंय कोशिकाओं के आगमन से स्वतंत्र है । भले ही स्वतंत्र सेल आगमन की गारंटी नहीं किया जा सकता है, विरल वितरित कोशिकाओं के मामलों में, स्वतंत्रता की धारणा पर विचार किया जा सकता है और एक या अधिक कोशिकाओं से युक्त एक छोटी बूंद की संभावना कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में भविष्यवाणी की जा सकती प्रत्येक छोटी बूंद में और16,17प्रति छोटी बूंदों की कोशिकाओं की औसत संख्या में मौजूद । बूंदों में सेलुलर encapsulation के इस आकलन के बाद से प्रत्येक छोटी बूंद में मौजूद कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर है, एक सुझाव दे सकते हैं कि प्रवेश पर कोशिकाओं की एकाग्रता में वृद्धि प्रत्येक छोटी बूंद में मौजूद कोशिकाओं की औसत संख्या बढ़ जाएगा 16. इसलिए, एक सेल encapsulation सुनिश्चित करने के लिए, कोशिका सांद्रता कम किया जाना चाहिए, लेकिन यह अक्सर खाली बूंदों की एक बड़ी संख्या18की ओर जाता है ।

या तो लगाव, अवसादन, और/सिरिंज, टयूबिंग, या उत्पादन डिवाइस में झुरमुट द्वारा लोडिंग के दौरान कोशिकाओं की हानि एक आम दोष भविष्यवाणी की है encapsulation मूल्यों से वास्तविक encapsulation मूल्यों के विचलन के लिए जिंमेदार है19 . यह समस्या आगे अतिरंजित हो जाता है जब दुर्लभ प्रतिरक्षा कोशिकाओं या नैदानिक नमूनों बोने के रूप में वे पहले से ही जनसंख्या में दुर्लभ है और केवल कुछ ही कोशिकाओं के encapsulation, बहुत कम उम्मीद से, प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान नहीं करता है. Plasmacytoid वृक्ष कोशिकाओं (पीडीसी) प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक दुर्लभ सबसेट है कि केवल लगभग ०.२-पूरे सफेद रक्त कोशिका जनसंख्या20के ०.६ प्रतिशत का गठन कर रहे हैं । इन कोशिकाओं को मैं सक्रियण पर interferons प्रकार की भारी मात्रा में स्राव और इस तरह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं21में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । बूंदों में ऐसी दुर्लभ कोशिकाओं के सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करते समय, सेल सीडिंग और22encapsulation के दौरान सेल नुकसान को रोकने के लिए यह अनिवार्य है । कई डिजाइन संबंधित घटनाओं है कि बूंदों में एकल कोशिकाओं के encapsulation को सुनिश्चित किया है कि सक्रिय encapsulation तरीकों का उपयोग कर रहे है कि ऐसी बूंदों के उत्पादन के लिए ध्वनिक या बिजली के बलों के रूप में विभिंन शारीरिक बलों का इस्तेमाल एकल-कोशिकाओं23,24। हालांकि, इन पद्धतियों की छोटी बूंद उत्पादन16के संदर्भ में अपनी सीमाएं हैं ।

इस अध्ययन में, हम एक मजबूत और सरल तरीका है कि microfluidic उपकरणों के लिए एकल या एकाधिक कोशिकाओं को लोड करने के लिए पारंपरिक तरीकों की कमियों को दरकिनार की स्थापना की । हमारे विधि, Rho एट अलसे प्रेरित है, अलग तरह का इस्तेमाल करता है-दुर्लभ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छोटी मात्रा के बोने के लिए पिपेट युक्तियों के आकार के महत्वपूर्ण नमूना हानि के बिना microfluidic प्लेटफार्मों छोटी बूंद और परिणाम है कि सैद्धांतिक के साथ सुसंगत हैं भविष्यवाणियों25. इस पद्धति को आसानी से किया जा सकता है और कई अनुप्रयोगों के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित छोटी बूंद-आधारित microfluidics और सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता या यहां तक कि microparticles के लिए लागू ।

Protocol

1.3-प्रवेश Polydimethylsiloxane (PDMS) डिवाइस निर्माण

  1. एक कंडीशनिंग मिक्सर कप में PDMS बेस के ४० जी उपाय और कप में बेस रिएजेंट के लिए PDMS इलाज एजेंट के 4 जी जोड़ने के लिए, ध्यान से, एक ड्रॉपर का उपयोग कर.
  2. कप को कंडीशनिंग मिक्सर के होल्डर में रखें और होल्डर के साथ कप के कुल वजन को नाप लें । तदनुसार कंडीशनिंग मिक्सर पर केंद्रापसारक संतुलन वजन के मूल्य निर्धारित करें ।
  3. 2 मिनट के लिए २,००० rpm पर de-फोम के द्वारा पीछा के लिए २,००० rpm पर कंडीशनिंग मिक्सर में बेस और इलाज एजेंट मिश्रण ।
  4. एक एल्यूमीनियम नाव तैयार, एक व्यास लगभग एक १०० mm सिलिकॉन वेफर के रूप में एक ही आकार के साथ । सिलिकॉन वेफर प्लेस, प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रिया के लिए गढ़े, एल्यूमीनियम नाव में और एक पेट्री डिश में इस सेटअप डाल (व्यास = १२० mm, ऊंचाई = 20 मिमी) ।
    नोट: पेट्री डिश का आकार सिलिकॉन वेफर के आकार पर निर्भर करता है ।
  5. धारक से कप निकालें और पूर्व ठीक PDMS मिश्रण (कप की सामग्री), ध्यान से, सिलिकॉन वेफर पर डालना ।
  6. पेट्री डिश प्लेस, पूर्व के साथ सिलिकॉन वेफर युक्त PDMS मिश्रण ठीक है, के बारे में 20 मिनट के लिए एक desiccator में सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए ।
  7. 20 मिनट के बाद पेट्री डिश निकालें और किसी भी शेष हवा बुलबुले कि हटाया जा सकता है के लिए जांच करें ।
  8. पेट्री डिश को एक ओवन में रखें, ६५ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, न्यूनतम 3 घंटे के लिए ।
  9. 3 ज के बाद ओवन से पेट्री डिश निकालें और ध्यान से सिलिकॉन वेफर से ठीक PDMS पील ।
  10. कट लाइनों के साथ PDMS उपकरणों में कटौती, एक चाकू या एक स्केलपेल का उपयोग कर. की सुविधा देता है और एक १.२ mm पंच का उपयोग कर प्रत्येक डिवाइस के आउटलेट पर छेद पंच । PDMS के किसी भी धूल या अवशिष्ट टुकड़े को दूर करने के लिए स्कॉच टेप के साथ प्रत्येक PDMS डिवाइस साफ ।
    1. वैकल्पिक, नाइट्रोजन के साथ उड़ा अवशिष्ट PDMS टुकड़े को दूर करने के लिए ।
  11. इन्हें साबुन-पानी से साफ करके कांच की स्लाइड्स तैयार करें, जिसके बाद isopropanol और ड्राई होकर नाइट्रोजन के साथ लें ।
  12. एक प्लाज्मा आशेर में एक साफ गिलास स्लाइड के साथ एक साफ PDMS डिवाइस बंधन प्रवाह लाइनों को बंद करने के लिए । निंन सेटिंग्स का उपयोग करें: पावर: ५० W, समय: ४५ s, खून देरी समय: 2 एस, प्रक्रिया गैस: 1 गैस (हवा), वेंट: दोनों वाल्व, प्रतिबंधित वेंट समय: ६० एस, पंप स्पिन समय नीचे: 10 एस, वेंट पकड़ समय: 0 एस, गैस शटऑफ समय: 1 एस, टर्बो पंपिंग सक्षम : 0. सभी अंय गैस लाइनों डिस्कनेक्ट ।
    नोट: प्लाज्मा आशेर के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स प्लाज्मा आशेर इस्तेमाल के ब्रांड के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
  13. silane के ५० µ l को जोड़कर silane समाधान तैयार करें (एक ज, ज, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) µ तेल के ९५० fluorinated l को.
    नोट: Silane विषाक्त है । कृपया धुएं हुड के तहत संचालित ।
  14. एक सिरिंज, जो एक Teflon टयूबिंग से जुड़ा है में तैयार silane समाधान ड्रा ।
  15. डिवाइस के आउटलेट के माध्यम से तैयार silane समाधान को फ्लश कर के Salinize ।
  16. 30 मिनट के लिए, ६५ डिग्री सेल्सियस पर सेट एक ओवन में डिवाइस प्लेस ।
  17. salinized डिवाइस को ओवन से निकालें और fluorinated ऑयल के साथ अतिरिक्त silane को डिवाइस से बाहर फ्लश करें ।
  18. डिवाइस को वापस एक ओवन में रखें, ६५ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, बॉन्डिंग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कम से 1 h.
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

2. हानि-कम सेल encapsulation

  1. सेल हार्वेस्टिंग
    1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) में Jurkat टी कोशिकाओं को पुनः निलंबित 1.0 x106 कोशिकाओं की सांद्रता पर मध्यम/एमएल, 2.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, 4.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 8.0 x106 कोशिकाओं/ पीडीसी में टेम सीरम-मुक्त संस्कृति मीडिया (जैसे, X-VIVO 15) की सांद्रता पर 1.3 x106 कोशिकाओं/एमएल, 3.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 13.0 x106 कोशिकाओं/ Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) में A549 कोशिकाओं 1.0 x106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर/
      नोट: प्रयोग के आधार पर कक्षों के प्रकार और कक्षों की एकाग्रता में भिन्नता हो सकती है. प्रयोग के आधार पर कोशिकाओं का लेबलिंग भी किया जा सकता है ।
  2. टिप-जलीय छोटी बूंद पीढ़ी के लिए लोड हो रहा है
    1. 3% fluorinated तेल के 2 मिलीलीटर के surfactant के 3 मिलीलीटर जोड़कर surfactant मिश्रण के साथ fluorinated तेल तैयार करें ।
      नोट: surfactant की एकाग्रता fluorinated तेल में जोड़ा अलग मशीन अवधि के लिए पायस की स्थिरता निर्धारित करता है । surfactant की एकाग्रता विशिष्ट कोशिका-प्रकारों के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया के आधार पर बदलती रहती है.
    2. एक सिरिंज (1 मिलीलीटर) में तेल चरण मिश्रण ड्रा. सिरिंज से हवा के बुलबुले निकालें और उचित लंबाई की एक Teflon ट्यूबिंग करने के लिए कनेक्ट.
    3. एक सिरिंज में संगत खनिज तेल ड्राइंग द्वारा एक नमूना सिरिंज तैयार करें । हवा के बुलबुले निकालें और उचित लंबाई की एक Teflon टयूबिंग के लिए सिरिंज कनेक्ट.
    4. एक ठीक PDMS स्लैब से 5 मिमी के व्यास के साथ एक PDMS प्लग पंच ।
      नोट: ठीक PDMS स्लैब चरण १.१ से १.९ का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है । एक सादे सिलिकॉन के बजाय एक गढ़े सिलिकॉन वेफर का प्रयोग करें ।
    5. एक 1 मिमी पंच के साथ प्लग के केंद्र में एक और छेद पंच ।
    6. डालें एक २०० µ एल पिपेट टिप में प्लग, बड़ा अंत से, इस तरह है कि यह कसकर फिट बैठता है ।
      नोट: बड़ा नमूना मात्रा और बड़े कक्षों के लिए १,००० µ l पिपेट tip का उपयोग करें । १,००० µ एल पिपेट टिप के लिए, 5 मिमी और 7 मिमी के बीच लेकर व्यास के प्लग का इस्तेमाल किया जा सकता है । व्यास के एक प्लग के साथ 5 मिमी, लगभग ४०० µ एल का एक नमूना मात्रा पिपेट टिप में aspirated जा सकता है. बड़ा व्यास का एक प्लग (7 मिमी) का उपयोग किया जाता है, तो अधिक नमूना मात्रा aspirated (लगभग ९०० µ एल) किया जा सकता है.
    7. डालने टयूबिंग, जो सिरिंज से जुड़ा है, PDMS प्लग में है, जो पिपेट टिप में डाला गया है । सिरिंज गोताख़ोर धीरे खनिज तेल के साथ जुड़े पिपेट टिप को भरने के लिए पुश । पिपेट टिप से सभी अवशिष्ट हवा बाहर धक्का ।
    8. पिपेट टिप कम, सिरिंज से जुड़े, नमूना समाधान में और महाप्राण के बारे में टिप में नमूना के १५० µ एल.
    9. एक दूसरा नमूना सिरिंज तैयार करने के लिए 2.2.8 करने के लिए कदम 2.2.4 दोहराएँ.
    10. ध्यान से सिरिंज पंप पर सभी तीन तैयार सिरिंज जगह.
    11. दोनों पिपेट युक्तियां डालें, नमूना युक्त, PDMS चिप के दो भीतर की सुविधा में । बाहरी प्रवेश में तेल चरण मिश्रण युक्त ट्यूब डालें ।
    12. इस प्रकार के रूप में सिरिंज पंप पर प्रवाह दरों के मूल्य निर्धारित करें: सतत चरण समाधान: ६०० µ एल/एच, सेल नमूने: १०० µ एल/एच, प्रत्येक । दर्ज करें और सिरिंज के आयामों को सेट करें.
      नोट: व्यास सेटिंग्स सिरिंज के प्रकार के आधार पर भिन्न हो जाएगा.
    13. डिवाइस के बाहरी चैनल के माध्यम से उपकरण और तेल चरण के भीतरी चैनलों के माध्यम से नमूना समाधान फ्लश करने के लिए पंप शुरू करो ।
    14. जब छोटी बूंद गठन स्थिर है बूंदों का संग्रह शुरू करने के आउटलेट के लिए उपयुक्त लंबाई की एक टयूबिंग में प्लग । संग्रह का समय प्रयोग के आधार पर बदलता रहता है ।
    15. एक लॉक ट्यूब में बूंदों लीजिए । एकत्र की गई बूंदों के शीर्ष पर RPMI मध्यम (बिना सीरम) के २०० µ एल जोड़ें और नमूना मशीन ।
      नोट: एकत्र की गई बूंदों की मशीन का समय प्रयोग के आधार पर बदलता रहता है । बूंदों को एक लॉक ट्यूब में एकत्र कर रहे है जब प्रवाह cytometry-आधारित विश्लेषण या अलगाव की बूंदों से कोशिकाओं को वापस लाने के बाद किया जाता है पायस तोड़कर । यह एक गिलास चैंबर में बूंदों को इकट्ठा अगर प्रयोग में छोटी बूंद सूक्ष्म विश्लेषण की आवश्यकता है संभव है ।
  3. इमल्शन तोड़ने और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए सेल पुनर्प्राप्ति
    1. PFO तेल के 10 मिलीलीटर में fluorinated के 2 मिलीलीटर जोड़कर PFO के तेल में 20% 1, 4, 2H, 2H-Perfluoro -1-octanol (flourinated) समाधान (वी/वी) तैयार करें ।
    2. संग्रह ट्यूब के नीचे से अतिरिक्त तेल निकालें, बूंदों से युक्त, एक सिरिंज का उपयोग कर ।
    3. पायस को तोड़ने और जलीय चरण में encapsulated कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए पायस के लिए 20% PFO समाधान के १०० µ एल जोड़ें । नल और संक्षेप में मिश्रण । इस बिंदु पर भंवर मत करो । 1-2 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: जोड़ा PFO की मात्रा उत्पादित बूंदों की मात्रा पर निर्भर करता है । तेल की परत को पूरी तरह से भंग होने तक अतिरिक्त PFO को जोड़ते रहें । ध्यान रखें कि PFO कोशिकाओं के लिए विषाक्त है और वह भी उच्च PFO सांद्रता या PFO में बहुत लंबे समय से मशीन वृद्धि कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
    4. समाधान स्पिन शीघ्र ही 30 एस के लिए सबसे कम संभव आरसीएफ पर
    5. तैयार १०० मिलीलीटर कोल्ड फास्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) (FCS के ९८ एमएल में पंजाब के 2 मिलीलीटर) के साथ पूरक ।
    6. पिपेट ५५० जलीय अंश के µ एल, तुरंत केंद्रापसारक के बाद और यह एक नया ताला ५०० ठंडे पंजाबियों समाधान के एल µ l युक्त 2% FCS के साथ पूरक के लिए स्थानांतरण, के रूप में चरण -6 में तैयार । नए लॉक ट्यूब के नीचे करने के लिए किसी भी अवशिष्ट तेल सिंक करते हैं ।
    7. महाप्राण ९५० जलीय इस लॉक ट्यूब से कोशिकाओं से युक्त चरण के µ एल, ध्यान से, किसी भी अवशिष्ट तेल aspirating के बिना और एक नया ताला ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण ।
    8. 10 मिनट के लिए नए लॉक ट्यूब में कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
    9. शीत पंजाबियों के ३०० µ एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित समाधान 2% FCS के साथ पूरक, के रूप में चरण -6 में तैयार.
      नोट: कोशिकाओं को भी किसी भी अंय उपयुक्त समाधान में फिर से निलंबित कर सकते है जैसे प्रयोग के आधार पर मीडिया । दाग कोशिकाओं, प्रयोग पर आधारित, विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग कर ।

3. सेल बाँधना

  1. सेल हार्वेस्टिंग और धुंधला
    1. Jurkat टी कोशिकाओं गिनती, संस्कृति कुप्पी से, और 5 मिनट के लिए १,५०० rpm पर नीचे स्पिन कोशिकाओं ।
    2. 1.0 x106 कोशिकाओं की एकाग्रता पाने के लिए 1 मिलीलीटर पंजाब में 1.0 x106 कोशिकाओं supernatant और पुन: निलंबित निकालें । पंजाब की राशि जोड़ा सेल गिनती पर निर्भर करता है ।
    3. एक ही कोशिका एकाग्रता के साथ Jurkat टी कोशिकाओं का एक दूसरा नमूना तैयार करने के लिए 3.1.2 के लिए कदम 3.1.1 दोहराएँ.
    4. 5 मिनट के लिए १,५०० rpm पर पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार दोनों नमूनों को धो लें ।
    5. १.२५ µ एम carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) डाई और १.२५ µ मीटर तक लाल डाई या १.२५ µ मीटर सेल प्रसार के साथ अन्य सेल नमूना के साथ एक सेल नमूना पुन: निलंबित 1.0 x106 कोशिकाओं की एकाग्रता/ कुल धुंधला समाधान 1.0 x106 कोशिकाओं के लिए 1 मिलीलीटर है ।
      नोट: कोशिकाओं के प्रवाह cytometer में या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में उपलब्ध फिल्टर के आधार पर विभिन्न रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रंजक के साथ सेल नमूने की मशीन ।
    7. 10 मिनट के बाद बर्फ शीत FCS के 1 मिलीलीटर जोड़कर दाग प्रतिक्रिया बंद करो ।
    8. 5 मिनट के लिए १,५०० rpm पर पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार सेल नमूने धो लें ।
    9. RPMI मीडिया में 10.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, प्रत्येक रंग के लिए की एकाग्रता पर सेल नमूने फिर से स्थगित ।
  2. टिप-सेल बाँधना के लिए agarose hydrogel बूंदों के उत्पादन के लिए लोड हो रहा है
    नोट: agarose hydrogel बूंदों का उपयोग कर सेल बाँधना के लिए, छोटी बूंद पीढ़ी और संग्रह प्रक्रिया के बीच प्रणाली के तापमान को बनाए रखने के लिए hydrogels के बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के लिए और सेलुलर व्यवहार्यता9वारंट करने के लिए ।
    1. (डब्ल्यू/वी) और 20 मिनट के लिए मिश्रण हलचल में पंजाब में ७५ ° c के लिए यह हीटिंग द्वारा अल्ट्रा कम बीच बढ़िया तालमेल तापमान agarose भंग ।
    2. 2% (w/v) के एक agarose एकाग्रता उपज के लिए लेबल Jurkat टी कोशिकाओं के साथ agarose समाधान मिश्रण । दूसरे नमूने के लिए भिंन लेबल वाले कक्षों के साथ इसे दोहराएं ।
    3. 2% surfactant मिश्रण के साथ fluorinated तेल तैयार fluorinated तेल के 30 मिलीलीटर (तेल चरण मिश्रण) के लिए surfactant के 20 मिलीलीटर जोड़कर ।
    4. चरण -8-2.2.14 का पालन करें ।
      नोट: क्योंकि कम पिघलने agarose के चिपचिपा प्रकृति के और स्थिर छोटी बूंद उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, सिरिंज पंपों पर प्रवाह की दर के मूल्य इस प्रकार सेट: तेल चरण मिश्रण: २,००० µ एल/एच, सेल नमूने: २०० µ एल/दर्ज करें और सिरिंज के आयाम सेट.
    5. एक लॉक ट्यूब में बूंदों लीजिए और ६० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बूंदें मशीन ।
  3. FACS विश्लेषण के लिए पायस तोड़कर और agarose मनका पुनर्प्राप्ति
    1. ६० मिनट के लिए बूंदों की मशीन के बाद, लॉक ट्यूब से अतिरिक्त तेल हटाने, बूंदों युक्त, एक सिरिंज का उपयोग कर ।
    2. बूंदों से तेल के चरण हटाने के लिए PFO के २०० µ l को जोड़ें ।
      नोट: ट्यूब में जोड़ी गई PFO की मात्रा उत्पादित बूंदों की मात्रा पर निर्भर करती है । तेल की परत को पूरी तरह से भंग होने तक अतिरिक्त PFO को जोड़ते रहें ।
    3. दो बार ठंडे पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ एकत्र agarose मोती धो 10 मिनट के लिए १,५०० rpm पर केंद्रापसारक द्वारा पूरी तरह से तेल हटाने के लिए ।
    4. एकत्र agarose मोती का उपयोग प्रवाह cytometry का विश्लेषण ।
      नोट: यह भी एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मोतियों का निरीक्षण करने के लिए संभव है ।

Representative Results

हमारे प्रयोगों के लिए, हम 25 माइक्रोन (चित्रा 1) की ऊंचाई के साथ एक 3-प्रवेश PDMS आधारित microfluidic डिवाइस का इस्तेमाल किया. इस उपकरण सेटअप में, हम surfactant और सेल निलंबन या मीडिया के साथ जलीय चरणों निस्तब्धता के लिए दो भीतर की मदद से तेल निस्तब्धता के लिए बाहरी प्रवेश करते थे । उत्पादन और संग्रह के बाद, बूंदों नीचे प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण से पहले चिप बंद घंटे के एक जोड़े के लिए मशीन हैं । मशीन अवधि के दौरान, मीडिया में मौजूद सीरम घटक surfactant के साथ सहभागिता कर सकते हैं और कारण बूंदें अस्थिर और विखंडित हो जाती हैं । इसलिए यह fluorinated तेल के लिए surfactant के एक अनुकूलित एकाग्रता जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । हम fluorinated तेल में surfactant के विभिंन सांद्रता के साथ 2% मानव सीरम के साथ पूरक टेम सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया युक्त monodispersed बूंदों की स्थिरता का परीक्षण किया । यह चित्रा 2 से आस्थगित किया जा सकता है कि इन monodispersed बूंदों अत्यधिक स्थिर है 24 घंटे तक के लिए जब तेल चरण में कम से कम 3% surfactant जोड़ा है । इसी तरह के परिणाम के साथ RPMI मीडिया के साथ और 10% FCS के अलावा बिना प्राप्त किया गया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इसलिए, छोटी बूंद स्थिरता उच्च संस्कृति मीडिया और सीरम घटकों के विभिंन स्रोतों के साथ काम करते समय इष्टतम surfactant सांद्रता पर निर्भर है ।

हमारे दृष्टिकोण के encapsulation दक्षता का प्रदर्शन करने के लिए हम पहले सीरिंज से जुड़े टयूबिंग का उपयोग कर कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त है, जो (चित्रा 3एक) बोने की कोशिकाओं के लिए सबसे पारंपरिक दृष्टिकोण है । हम Jurkat टी कोशिकाओं के विभिंन सांद्रता पर काटा 1.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, 2.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 4.0 x106 कोशिकाओं/एमएल और एक encapsulation दक्षता है कि मूल्यों की भविष्यवाणी की तुलना में कम था प्राप्त (चित्रा 3बी) । 1.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, बूंदों के अंश है कि एक एकल सेल निहित था २.५% है, जो उच्च कोशिका सांद्रता का उपयोग करने पर भी वृद्धि नहीं हुई । सेल-लोड क्षमता बढ़ाने के लिए, हम अपने पिछले दृष्टिकोण को संशोधित करने और एक ऊंचा तिपाई के लिए आधा लंबाई पर टयूबिंग घुड़सवार और छमाही कि PDMS डिवाइस (चित्रा 4ए) से जुड़ा था में सेल निलंबन भरी हुई । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम Jurkat टी कोशिकाओं के विभिंन सांद्रता पर समझाया 1.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, 2.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 4.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और भी दुर्लभ पीडीसी के विभिंन सांद्रता पर 1.0 x106 कोशिकाओं/ 2.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 12.0 x106 कोशिकाओं/ हम इस पद्धति के साथ सेल अवसादन को रोकने के द्वारा encapsulation दरों में सुधार की उंमीद । हालांकि, सभी सांद्रता का परीक्षण किया, प्रयोगात्मक परिणाम बहुत कम थे कि अनुमानित Poisson मूल्यों (चित्रा 4बी और चित्रा 4सी).

हमारे टिप-लोडिंग दृष्टिकोण का उपयोग हम अपने सेल encapsulation दरों को अनुकूलित करने के लिए सांख्यिकीय भविष्यवाणी मूल्यों के साथ सुसंगत प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त (चित्रा 5ए) । Jurkat टी कोशिकाओं के विभिंन सांद्रता के लिए, प्राप्त encapsulation दक्षता सभी सांद्रता (चित्रा 5ख) पर हमारे गणना मूल्यों का मिलान किया । उल्लेखनीय, यहां तक कि A549 ट्यूमर कोशिकाओं की तरह अनुयाई कोशिकाओं के साथ, जो झुरमुट के लिए करते हैं, हम एक सेलुलर एकाग्रता 1.0 x106 कोशिकाओं/एमएल (चित्रा 5सी) में थोड़ा सुधार encapsulation दक्षता मनाया । हम भी हमारे सिस्टम की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए कम उपलब्ध और दुर्लभ पीडीसी के विभिंन कोशिका सांद्रता पर 1.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, 3.0 x106 कोशिकाओं/एमएल, और 13.0 x106 कोशिकाओं/एमएल (चित्रा 5डी) । के लिए संभवतः बड़ा २०० µ एल से अधिक मात्रा की लोडिंग की सुविधा, जैसे, जब सेल लाइनों या अधिक प्रचुर मात्रा में प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ काम कर रहे, हम भी १००० µ l युक्तियां (नीला) का उपयोग करके सेल encapsulation दक्षता की जांच की । हमने प्रदर्शन किया कि इन १,००० µ l टिप्स ने २०० µ l टिप्स (yellow) (figure 5E) की तुलना में एक समान encapsulation दक्षता दी.

हाथ में चिप डिजाइन और अनुसंधान के सवाल पर निर्भर है, हमारे टिप लदान तकनीक के लिए या तो एक प्रवेश के माध्यम से कोशिकाओं को लोड किया जा सकता है, सेलुलर विविधता, या समानांतर में एकाधिक में मदद की जांच के लिए, सेलुलर बातचीत डिकोडिंग के लिए । हम Jurkat टी कोशिकाओं की लोडिंग की तुलना में (10.0 x106 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में/Jurkat टी कोशिकाओं के दो अलग लेबल आबादी के लिए एक प्रवेश से (१०.० x106 कोशिकाओं की एक संयुक्त एकाग्रता में/एमएल) दो से की सुविधा (चित्रा 6 A और figure 6B). encapsulation के दौरान, बूंदों अल्ट्रा कम बीच बढ़िया तालमेल तापमान agarose और gelled उत्पादन के बाद agarose hydrogel मोती है कि माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry के माध्यम से बाद में बहाव के विश्लेषण की अनुमति के रूप में उत्पंन किया गया (चित्रा 6 सी और फिगर 6डी). सूक्ष्म विश्लेषण से पता चला कि सेल बाँधना अलग उच्च प्रवाह सेल बाँधना के लिए संकेत संयोजनों पर हासिल किया गया था (चित्रा 6सी). इसके अलावा, प्रवाह cytometry द्वारा hydrogel मोतियों की ही आबादी का विश्लेषण से पता चला कि कोशिकाओं के बिना मोतियों को अलग आगे (FSC, आकार) और sideward (एसएससी, दानेदार) तितर बितर पैटर्न (6 चित्रा के आधार पर कोशिकाओं के साथ मोतियों से अलग किया जा सकता है घ). कोशिकाओं के बिना मोतियों की आबादी पर गेटिंग फ्लोरोसेंट संकेतों के अभाव द्वारा सेल encapsulation की कमी की पुष्टि की । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के साथ मनका जनसंख्या पर गेटिंग अलग लेबल Jurkat टी कोशिकाओं के encapsulation के लिए संकेत कई उप आबादी के अस्तित्व का पता चला । हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है कि कुशल सेल बाँधना, दोनों सूक्ष्म और प्रवाह cytometric विश्लेषण के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है, और एक थोड़ा बढ़ा encapsulation Poisson भविष्यवाणी (चित्रा 6ई) की तुलना में दक्षता दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1 . तीन की सुविधा और एक दुकान के साथ PDMS आधारित छोटी बूंद microfluidic डिवाइस । डिवाइस क्रमशः लगातार तेल चरण, सेल संस्कृति मीडिया, और सेल निलंबन के लिए तीन की सुविधा के होते हैं । जनरेट की गई बूंदों को आउटलेट पर एकत्र किया जाता है । नमूने प्रवाह-ध्यान केंद्रित जंक्शन जहां वे बूंदों में समझाया जाता है के लिए laminarly प्रवाह । सुविधा देता है, फिल्टर संरचनाओं प्रोटीन या सेल समुच्चय जैसे बड़े कणों को पकड़ वापस । फिल्टर संरचना में अंतराल का व्यास नीली रेखाओं द्वारा दर्शाया गया है । उत्पादन नोक पर चैनलों के व्यास लाल लाइनों से संकेत मिलता है । पूरी चिप पर चैनल की ऊँचाई २५ µm थी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . 24 घंटे से अधिक की छोटी बूंद स्थिरता । रेखांकन टेम सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया से युक्त बूंदों का क्षेत्र दिखा + 2% मानव सीरम, surfactant के तीन अलग सांद्रता के लिए समय पर एक) ०.५% B) 3% C) 5%. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . टयूबिंग आधारित सेल लोडिंग दृष्टिकोण । Jurkat-टी कोशिकाओं एक टयूबिंग से जुड़े सिरिंज का उपयोग कर डिवाइस के लिए अलग सांद्रता पर लोड कर रहे हैं. क) चित्रण प्रयोगात्मक सेटअप बी दिखाता है ) के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित सेल encapsulation दर । डॉट्स: प्रयोगात्मक निर्धारित मूल्यों; बंद लाइनें: Poisson वितरण । त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . एक ऊर्ध्वाधर ट्यूब लोड हो रहा है दृष्टिकोण का उपयोग कर विभिंन सांद्रता पर विभिंन कोशिका प्रकार के encapsulation । Jurkat टी कोशिकाओं और पीडीसी (अलग सांद्रता के) सेल encapsulation की क्षमता निर्धारित करने के लिए समझाया गया था । क) चित्रण ऊर्ध्वाधर ट्यूब लोड हो रहा है दृष्टिकोण के लिए प्रयोगात्मक सेटअप से पता चलता है । ख) ग्राफ Jurkat टी कोशिकाओं के encapsulation दक्षता से पता चलता है. ग) ग्राफ पीडीसी के encapsulation दक्षता से पता चलता है. डॉट्स: प्रयोगात्मक निर्धारित मूल्यों; बंद लाइनें: Poisson वितरण । त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . टिप लोडिंग दृष्टिकोण अलग कोशिकाओं प्रकार encapsulate करने के लिए । A) टिप लोडिंग तकनीक का योजनाबद्ध चित्रण । ख) ग्राफ Jurkat कोशिकाओं के encapsulation दक्षता से पता चलता है. ग) ग्राफ A549 कोशिकाओं के encapsulation दक्षता से पता चलता है. घ) ग्राफ पीडीसी के encapsulation दक्षता से पता चलता है । ई) ग्राफ २०० µ एल पिपेट टिप्स (पीला) और १,००० µ एल पिपेट टिप्स (ब्लू) का उपयोग कर Jurkat टी कोशिकाओं के encapsulation दक्षता से पता चलता है. डॉट्स: प्रयोगात्मक निर्धारित मूल्यों; बंद लाइनें: Poisson वितरण । त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 . बूंदों में सेल बाँधना । A) 2 बूंदों में से अलग कोशिकाओं बाँधना के लिए टिप लदान दृष्टिकोण के योजनाबद्ध चित्रण । ख) ग्राफ Jurkat टी एक प्रवेश या समानांतर में दो की सुविधा का उपयोग कर कोशिकाओं के encapsulation से पता चलता है । एक टिप के लिए सेल एकाग्रता 2.0 x106 कोशिकाओं/एमएल और दो सुझावों के लिए सेल एकाग्रता दोनों 1.0 x106 कोशिकाओं/ डॉट्स: प्रयोगात्मक निर्धारित मूल्यों; बंद लाइनें: Poisson वितरण । ग) hydrogel मोतियों और बला Jurkat टी कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति सूक्ष्म ओवरले । घ) ग्राफ agarose hydrogel मोतियों में युग्मित कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चलता है । साजिश को आगे तितर बितर और sideward तितर बितर दोनों प्रदर्शित करता है । ई) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry द्वारा पता चला के रूप में agarose hydrogel मोतियों में सेल संख्या की तुलना । सलाखों: मूल्य मतलब है; मूंछ: मतलब की मानक त्रुटि, n ≥ 4 । त्रुटि पट्टी माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम लोड और उच्च प्रवाह, एकल सेल विश्लेषण के लिए बूंदों में कोशिकाओं encapsulate और सेलुलर बातचीत के अध्ययन के लिए नियंत्रित सेल बाँधना प्रदर्शन करने के लिए एक कुशल और सरल तकनीक का प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, हम कई पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना की है microfluidic उपकरणों के लिए कोशिकाओं को लोड और पता चला है कि हमारे टिप लोड हो रहा है दृष्टिकोण अंय तरीकों की तुलना में एक अधिक कुशल तकनीक है ।

नैदानिक नमूनों या दुर्लभ सेल प्रकार की संख्या में छोटी बूंद से कम का अध्ययन-आधारित microfluidics कुछ निहित चुनौतियों के अधिकारी । हम भी प्रदर्शन किया है की तरह, कोशिकाओं सीरिंज और टयूबिंग की सतह में तलछट के लिए करते हैं, जिससे, अनुमानित मूल्यों के अनुरूप करने के लिए सेलुलर encapsulation को रोकने. इस समस्या से बचने के लिए, कुछ समूहों सीरिंज में सरगर्मी सलाखों का उपयोग करें । हालांकि, जब दुर्लभ और सीमित कोशिका आबादी का उपयोग कर, कुल कोशिका मात्रा भी सीमित है, जिससे, बड़े सीरिंज और सरगर्म सलाखों के उपयोग को सीमित. इसके अलावा, हम भी अधिक सामांयतः Teflon लेपित टयूबिंग के साथ इस्तेमाल किया ट्यूबिंग सेल लगाव को रोकने के लिए, लेकिन इस विधि के परिणाम में सुधार नहीं किया और अगर टयूबिंग बहुत लंबा है, सेल लगाव की समस्या बढ़ (डेटा नहीं दिखाया) । वैकल्पिक रूप से, हम एक ऊर्ध्वाधर ट्यूब लोड हो रहा दृष्टिकोण है जहां कोशिकाओं टयूबिंग में लोड नहीं किया गया और सिरिंज में बड़े सिरिंज की मात्रा में कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के थे । इस तकनीक का प्रयोग, छोटे नमूना मात्रा के साथ कोशिकाओं को लोड किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पीडीसी जो दुर्लभ और सीमित हैं. इसके अलावा, टयूबिंग से नमूना सेल अवसादन को रोकने के लिए खड़ी डिवाइस के लिए भरी हुई है । सेल बोने के लिए इस्तेमाल किया टयूबिंग छोटे आयामों है और microchannels की तुलना में किया जा सकता है । टयूबिंग में प्रवाह संचालित दबाव है और एक परवलयिक वेग प्रोफ़ाइल26इस प्रकार है । इसका मतलब यह है कि अधिकतम प्रवाह वेग टयूबिंग के केंद्र में है और न्यूनतम वेग टयूबिंग27के किनारों पर है । जब टयूबिंग के माध्यम से कोशिकाओं की आबादी निस्तब्धता, वेग ढाल कोशिकाओं को किनारों की ओर धकेल दिया है जहां वे नीचे बसा क्योंकि सीमा पर वेग शूंय के करीब है कारण बनता है । अवसादन या टयूबिंग में कोशिकाओं के निपटान, जिससे, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है जहां प्रयोगात्मक डेटा भविष्यवाणी मॉडल के साथ मेल नहीं खाता encapsulation दक्षता कम कर देता है ।

एक और आमतौर पर अनुकूलित वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल समाधान, छोटी बूंद microfluidics के साथ काम कर रहे, इस तरह के Iodinaxol के रूप में घनत्व मिलान reagent के अलावा सेल संस्कृति मीडिया के घनत्व में वृद्धि करने के लिए19सीरिंज में सेल अवसादन को रोकने के लिए है । हालांकि, घनत्व मिलान एजेंट सेलुलर व्यवहार को प्रभावित और प्रतिकूल कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव को प्रभावित कर सकते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)28.

हालांकि पारंपरिक सेल लोडिंग तकनीकों में कई छोटे और बड़े संशोधनों encapsulation क्षमता में मामूली सुधार दिखाया, प्राप्त प्रयोगात्मक परिणाम अभी भी सैद्धांतिक गणना मैच नहीं था । हालांकि, टिप लोड हो रहा है दृष्टिकोण के साथ हम पिछले तरीकों और encapsulation Poisson सांख्यिकी द्वारा नियंत्रित दक्षता की सीमाओं को दूर कर सकता है । यह तकनीक केवल निलंबन कोशिकाओं लदान के लिए लाभप्रद नहीं है, लेकिन यह भी प्राथमिक keratinocytes और microfluidic चिप्स के लिए A549 के रूप में अनुयाई कोशिकाओं, लदान के लिए लागू किया जा सकता है । जब प्रचुर मात्रा में सेल लाइनों का उपयोग कर, उदाहरण के लिए A549, K562, आदि, बड़ा नमूना मात्रा इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, नमूने की मात्रा पर निर्भर करता है, अलग आकार पिपेट-युक्तियां भी इस्तेमाल किया जा सकता है और इस सरल तकनीक दोनों एकल सेल encapsulation और कई सेल encapsulation के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

जबकि कम कोशिका एकाग्रता बूंदों में एकल कोशिकाओं के encapsulation सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, उच्च कोशिकाओं सांद्रता सेल बाँधना से संबंधित अध्ययन के लिए प्रत्येक छोटी बूंद में encapsulated कोशिकाओं की औसत संख्या में वृद्धि करने के लिए वांछित हैं. वहां कई एकल सेल तरीकों कि पहले microfluidic चिप्स या microfabricated nanowells29,30,31पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं जोड़ी करने के लिए वर्णित किया गया है । छोटी बूंद microfluidics में, Poisson आँकड़े तय करता है कि दो अलग सेल प्रकार के लिए 1:1 सेल बाँधना इष्टतम सेल सांद्रता पर प्राप्त किया जा सकता है । Poisson पूर्वानुमान के आधार पर, वहां भी एक संभावना है कि बूंदों अंय संयोजनों हो सकता है । जबकि 1:1 सेल बाँधना एक सेल स्तर पर सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए वांछनीय हो सकता है और बढ़ सेलुलर समझ में परिणाम, कई सेल बाँधना भी प्रमुख लाभ है. यह अंय प्रकार के कक्ष पर एक कक्ष प्रकार के एकाधिक कक्षों के प्रभाव को समझने की अनुमति देता है । विभिंन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच क्रॉस बात कई संक्रमण और रोगजनकों के खिलाफ एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पंन करने में मदद और भी हमारे प्रतिरक्षा प्रणाली३२को मजबूती कहते हैं । जैसे, सेलुलर संचार अलग संदर्भों में उच्च परिशुद्धता के साथ पूछताछ की जा सकती है, जैसे , 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, आदि। कैसे एकल या कोशिकाओं के जोड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरण नियंत्रण पर वृद्धि समझ उपज । यह विशेष रूप से उदाहरण के लिए प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं या साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं की क्षमता को प्रश्नपत्र उनके संबंधित लक्ष्य कोशिकाओं को मारने के लिए अध्ययन दिलचस्प है ।

के रूप में चर्चा की, बूंदों में कोशिकाओं के एकाधिक encapsulation के लिए, उच्च कोशिका सांद्रता वांछित हैं । हालांकि, जब सेल encapsulation के लिए एक प्रवेश से कोशिकाओं लोड हो रहा है, सेल नमूना के उच्च सांद्रता प्रवेश पर कुल करने के लिए कोशिकाओं पैदा कर सकता है । यह कम encapsulation दर और सैद्धांतिक मूल्यों से अधिक विचलन में परिणाम है । इस समस्या से बचने के लिए, कोशिकाओं को दो अलग से भी की जाने वाली सुविधा से लोड किया जा सकता है । सैद्धांतिक रूप से, यह कई सेल encapsulation जहां कोशिकाओं के एक्स संख्या पर एक औसत वारंट है की भी उच्च स्तर को प्राप्त करने के साथ अंय microfluidic उपकरणों को विकसित करने के लिए संभव होगा । इस अध्ययन में हम Jurkat टी कोशिकाओं के encapsulation दक्षता की जांच की जब दोनों एक प्रवेश से भरी हुई है और दो ही कुल एकाग्रता का उपयोग कर देता है और इसी तरह encapsulation दक्षता प्राप्त की । इस संशोधन के शोधकर्ताओं चिप पर अलग सेल प्रकार जोड़ी के लिए अनुमति देता है ।

हालांकि इस विधि कोशिकाओं के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना microfluidic उपकरणों के लिए कोशिकाओं को लोड करने में एड्स, वहां कुछ सावधानियों कि जरूरत को ध्यान में रखा जा रहे हैं । जब खनिज तेल के साथ सीरिंज भरने और पिपेट सुझावों में सेल नमूना aspirating, हवाई बुलबुले के शामिल होने से बचना चाहिए और पूरी प्रणाली हवा से मुक्त किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान में रखना जरूरी है कि खनिज तेल के नमूने के साथ मिश्रण नहीं होना चाहिए । पिपेट टिप्स, नमूनों से युक्त, microfluidic डिवाइस की सुविधा में दृढ़ता से डाला जाना चाहिए, अत्यंत एहतियात के साथ, रिसाव को रोकने और हवाई बुलबुले के आगे शामिल करने के लिए. संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, टिप-लोड हो रहा है एक सीधा, अभी तक, मजबूत तकनीक है कि सेल encapsulation के माध्यम से सेलुलर व्यवहार के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए एक लागत प्रभावी तरीके से कोशिकाओं के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना की अनुमति देता है । जब प्रवेश पर इष्टतम नमूना सांद्रता के साथ प्रयोग किया जाता है, पिपेट के साथ कोशिकाओं लदान के इस दृष्टिकोण-युक्तियां बहुत लचीला है और विभिंन प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विशेष रूप से दुर्लभ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए, उच्च encapsulation दक्षता प्राप्त करने के लिए, करीब अनुमानित मॉडल ।

Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उदार समर्थन के लिए प्रौद्योगिकी के आइंटहॉवन विश्वविद्यालय धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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इंजीनियरिंग अंक १४४ बूंदें Microfluidics टिप लोड हो रहा है Poisson वितरण सेल encapsulation सेल बाँधना सेलुलर बातचीत
एक पिपेट-टिप आधारित Microfluidic प्लेटफार्मों छोटी बूंद के लिए कोशिकाओं को बोने के लिए विधि
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Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

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