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방법 논문

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

7.6K 조회수

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DOI:

10.3791/57870

⸱

2018년 9월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

초록

세포종 님 (GBM), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암은 일반적으로 빈약한 예 지와 연결 하 고 지난 10 년간 부족 한 효율적인 치료 제안 되었습니다. 새로운 치료 전략을 디자인 하기 위한 유망한 후보자 중 세포 immunotherapies는 높게 침략 적 제거 하 표적이 되었습니다 및 항 암 치료-radioresistant 종양 세포, 가능성이이 암의 신속 하 고 치명적인 재발 있습니다. 따라서, 종양 주변 인간 Vϒ9Vδ2 T 림프 톨 같은 수용자 GBM 반응 면역 세포 이펙터의 administration(s) 것이 효율적 제공 하는 독특한 기회 나타내고 고도로 집중에 직접 치료제를 뇌 악성 사이트입니다. 여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 intrabrain 종양 침대에서 수용자 인간 림프 톨의 정위 적 주사에 의존 하는 이러한 세포 immunotherapies의 antitumor 효능에 대 한 전 임상 증거의 개념을 제공 합니다.

서론

GBM (누가 학년 4 astrocytoma), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암 이다. 수술과 라디오 화학 요법을 결합 하는 적극적인 치료에도 불구 하 고 GBM는 매우 빈약한 예 지 (14.6 개월 및 2 년 사망률 > 73%의 메디아 생존)1와 관련 남아 있습니다. 이 몇 가지 효율적인 치료 발전2지난 10 년 동안 검증 된 증거. 더 효과적인 치료 전략3,,45의 디자인에 대 한 후보자, 중 immunotherapies6 현재 탐험 추적 하 고 매우 침략과 라디오/항 암 치료-방지 종양 제거 셀, 신속 하 고 치명적인 종양 재발7에 그들의 주요 기여에 대 한 의심. 다양 한 잠재적인 면역 목표 식별 및 제안 immunotherapies, 자연 관련 된 또는 수정 된 αβ 또는 GBM 특정 종양 항 원 등 스트레스 유발 분자8,9

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프로토콜

다음 절차와 관련 된 동물 과목 (계약 #00186.02; 지역 윤리 위원회는 드 라 루아르 [프랑스]의) 기관 지침에 따라 수행 되었다. 인간의 PBMCs 정보 건강 한 기증자 (Etablissement 프랑스어 뒤 상 낭트, 프랑스)에서 수집 된 혈액에서 분리 했다. 모든 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 특정 세포 독성 효과 기 T 세포의 확장

  1. 준비 하 고 35 Gy에서 피더 세포를 비추는. 2 x 105 -4 x 105 effector 세포 자극에 대 한 세 가지, 건강 한 기증자 로부터 10 x 106 PBMCs 및 1 x 106 BLCLs을 준비 합니다.
  2. 피더 세포와 RPMI 10% 열 비활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (100 IU/mL), 고 스 (0.1 µ g/mL) 및 300 IU/mL 재조합 일리노이-2와 보충의 15 mL에 이펙터 셀 resuspend.
  3. 1 µ g/mL의 최종 농도에 PHA-L을 추가 하 고 신중 하 게 혼합, 96-잘 U 바닥 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 150 µ L를 배포.
  4. 37 ° C에서 그리고 5% CO2

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결과

이 연구는 종양 침대 내에서 직접 수행 하는 정위 적 주사에 따라 종양을 들고 쥐의 뇌 내 세포 면역 효과 기 세포의 입양 전송의 전략을 설명 합니다.

큰 사출 량과 관련 된 뇌 손상의 모든 위험을 최소화 하려면 effector 세포 현 탁 액 (20 x 106 셀 PBS의 15-20 µ L에) 집중 될 필요가 있다. 이 셀 농도 단계 효과 기 세포의 생존에 영향을 미칠 수 여부를 확인 하려면이 셀 설명된 프로토콜에 따라 준비 하 고는 microsyringe에 로드 된 했다. 효과 기 세포는 microsyringe에 그들을 로드 후 즉시, 또는 10 분을 수집 했다. 셀은 propidium 요오드 화물 (PI)은 세포를 라이브 permeant cytometry 다른 timepoints (0, 24, 그리고 72 시간)에 의해 분석 된 형광 DN.......

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토론

입양 전송 선정 네이티브 또는 조작된 면역 효과 기 세포 효율적으로 제한 비 변형 세포15에 대 한 reactivities의 infiltrative 뇌 암 같은 종양을 치료 하는 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 16,,1718. 그러나, 중앙 신경 조직, 두뇌를 구성 하는 혈액-뇌 장벽의 존재와 고아 한 림프 배수 시스템19,20의 부족 때문에 특히 특정 면역 상태. 이러한 생리 적 기능 조직 인신 매매에 영향을 하 고 면역 세포의 조직 주사를 손상 수 있습니다. 극복 하기 위해 이러한 hindrances, intraparenchymal 주사 antitumor 셀 배달 되는 대신 로컬로, 약리 화.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 낭 뜨에서 대학 병원 동물 시설 (UTE) 낭트의 축산 관리, 셀룰러 및 tissular 이미징, 낭트 대학 (MicroPICell)의 핵심 시설을 이미징에 대 한 그리고 Cytometry 시설 (Cytocell)의 직원을 감사 합니다. 대 한 그들의 전문 기술 지원. 이 작품은 INSERM, CNRS, 대학교 드 낭트, 인 국가 뒤 암 (잉카 #PLBio2014-155), 국가 리그 죄수 르 암 (AO 국제 2017), 그리고 유럽 컨소시엄 시대 Net Transcan2에 의해 투자 되었다 (Immunoglio). 팀은 Fondation 부 라 검색 Medicale (DEQ20170839118)에 의해 자금이 다. 이 작품은 LabEX IGO의 맥락에서 실현 하 고 IHU Cesti 프로그램에서 지 원하는는 국가 연구 기관 Investissements d'Avenir 통해 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01 ANR-10-IBHU-005, 각각. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로폴와 드 라 루아르 지역에 의해 지원 됩니다. 저자는 원고 수정에 도움을 제공 하는 Chirine Rafia 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3명의 건강한 기증자의PBMC
3명의 다른 기증자의BLCL
Roswell Park Memorial Institute 매체(RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-글루타민Gibco25030-024
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140-122
IL-2Novartisproleukin
PHA-L시그마L4144
입체 프레임Stoelting Co.51600
입체성 프레임용 마우스 어댑테이터   Stoelting Co.51624
마이크로주사기 펌프 인젝터 WPIUMP3-4
NanoFil 주사기WPINF34BV-2
NSG 마우스Charles RiverNSGSSFE07S
KetamineMerialImalgè ne 1000
Xylazine바이엘Rompur 2 %
가위WPI201758
집게WPI501215
OmniDrill 115 / 230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XylocaineAstrazeneca3634461

참고문헌

  1. Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
  2. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of....

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