Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.
Abstract
גליובלסטומה (GBM), סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ביותר אגרסיבי אצל מבוגרים, מזוהה בדרך כלל עם פרוגנוזה גרועה, טיפולים יעילים נדיר הוצעו במהלך העשור האחרון. בין המועמדים מבטיחה עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות מקוריות, immunotherapies הסלולר סומנו כמטרות לחסל פולשני ביותר, כימותרפיה-radioresistant תאים סרטניים, סביר מעורב התדרדרות מהירה, חמורה של סרטן זה. לפיכך, administration(s) של effectors תא החיסון GBM-תגובתי allogeneic, כמו לימפוציטים Vϒ9Vδ2 T האנושי, בסביבת הגידול מייצג הזדמנות ייחודית לספק יעיל, המרוכזת סוכני טיפולית ישירות לתוך אתר של גידולים ממאירים במוח. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק של פרה הוכחה הרעיון הכדאיות והן את היעילות antitumor של אלה immunotherapies הסלולר המסתמכים על זריקות סטיאוטטי של לימפוציטים אנושיים allogeneic בתוך intrabrain הגידול מיטות.
Introduction
GBM (מי כיתה אסטרוציטומה הרביעי), הוא סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ואגרסיבי ביותר אצל מבוגרים. למרות טיפולים אגרסיביים המשלבות ניתוח וכימותרפיה -רדיו, GBM נשאר משויך מאוד פרוגנוזה (חציון ההישרדות של 14.6 חודשים ו 2-בן-התמותה > 73%)1. זה עדויות כי יש מעט התקדמות טיפולית יעילה מאומתים מעל העשור האחרון2. בין המועמדים על עיצוב האתר של יעיל יותר אסטרטגיות טיפוליות3,4,5, immunotherapies6 נידונות כעת לאתר ולחסל גידול פולשני ו רדיו/כימותרפיה-עמידים מאוד תאים, חשד על תרומתם מפתח גידול מהיר ולא קטלנית relapse7. אימונולוגי פוטנציאלים שונים היו מזוהה, המוצע עבור immunotherapies, מעורבים טבעי או αβ ששונו או לימפוציטים מסוג T ϒδ כגון GBM ספציפיים גידול אנטיגנים או מולקולות מפגינות8,9, 10. האפשרות לנהל שנבחרו effectors תא החיסון GBM-תגובתי מייצג הזדמנות ייחודית לספק כמויות מוגברות של לימפוציטים ישירות לתוך האתר של ממאירות שיורית. כדי לתמוך באסטרטגיה זו, לאחרונה הראינו כי מודלים בהתבסס על עכברים immunodeficient נושא xenografts orthotopic ראשי GBM האנושי בנאמנות מסכם את הדברים על התפתחות גידולים במוח ב- GBM חולים9,11. יתר על כן, מודלים אלה שימשו כדי להדגים את היעילות antitumor חזקה של לימפוציטים הועבר adoptively Vϒ9Vδ2T allogeneic אנושי.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים ניסיוני קריטי להשגת סטיאוטטי immunotherapies של גידולים במוח, כגון GBM, המבוססת על העברת המאמצת של לימפוציטים מסוג T allogeneic. המאמר מציג: (i) ההגברה של טיפולית allogeneic המערכת החיסונית T לימפוציטים, כמו לימפוציטים אנושיים Vϒ9Vδ2T; (ii) הכנת אלה T לימפוציטים להזרקה; (iii) ההליך עבור ניהול סטיאוטטי בתוך המוח, ליד הגידול. מאמר זה גם מספק תובנה אופן הפעולה של אלה effectors הסלולר לאחר ההזרקה סטיאוטטי.
הגישה הטיפולית המובאת כאן מבוסס על ההזרקה של 20 x 106 אפקטור תאים לכל מנה עבור העכבר immunodeficient נושאות כל המוח. שלב ההרחבה הראשונית במבחנה נדרש לייצר כמויות גדולות של תאים חיסוניים. לכן, לא ספציפית תא הרחבות מבוצעות באמצעות phytohemagglutinin (PHA-L) וכן מוקרן allogeneic מזין תאים: תאים תאי הדם ההיקפית (PBMCs) מן התורמים בריא ותא טרנספורמציה-אפשטיין בר וירוס EBV B-lymphoblastoid קווים (BLCLs), הנגזר PBMCs על-ידי זיהום במבחנה המכילה EBV בתרבות supernatant משורת תאים מרמוסט B95-8, בנוכחות 1 µg/mL וציקלוספורין-א
תאים חיסוניים אפקטור GBM-תגובתי בהשוואה ונבחר במבחנה מבחני9. תאים אלה אפקטור מופעלים, הוגדל באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, על פי הטבע שלהם (למשל, אדם Vγ9Vδ2 T לימפוציטים9 או וירוס אנטי-הרפס אנושית αβ T לימפוציטים12) עם טוהר המינימלי של > 80%, כמו באופן שגרתי נבדק על ידי ניתוח cytometric. ההליך הרחבה תא שיפורטו להלן חל על קבוצות משנה לימפוציטים אנושיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליך מעורבים בעלי חיים הנושאים הבאים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיים (הסכם #00186.02; ועדת האתיקה האזורי של פיי דה לה לואר [צרפת]). PBMCs האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש הדם שנאספו מתורמים בריאים מושכלת (Etablissement פרנקאיס du שרו נאנט, צרפת). כל הצעדים מבוצעים בתנאים סטריליים.
1. שאינם ספציפיים התרחבות ציטוטוקסיות T לימפוציטים
- להכין, להאיר מזין תאים ב- 35 Gy. על הגירוי של 2 x 105 - 4 x 105 תאים אפקטור, להכין 10 x 106 PBMCs BLCLs6 עונה 1 פרק 10 מתורמים שלושה ייחודי, בריא.
- Resuspend מזין תאים והן תאים אפקטור 15 מ"ל של RPMI בתוספת 10% לא פעיל חום FCS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (100 IU/mL), ואת סטרפטומיצין (0.1 µg/mL), il-2 רקומביננטי 300 IU/mL.
- להוסיף PHA-L-ריכוז הסופי של µg 1/mL, לערבב היטב והפצה µL 150 של התליה תא לכל טוב ב 96-ובכן להטלטל U צלחות.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2 באווירה humidified.
- מדי יום לבדוק את הצלחת עד תא גדול מתגבש בצורת הבארות תרבות (~ יום 7).
- העבר את התאים לתוך בקבוקון תרבות-עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל במדיום תרבות טריים.
- לקבוע את מספר התאים הכולל על ידי ספירת (2 x שבוע) ולתחזק אותם-עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל במדיום תרבות טריים.
הערה: תאים חיסוניים אפקטור אמור להיות מוכן עבור המינהל טיפולית במצב מנוחה (בדרך כלל 3 שבועות לאחר הגירוי הראשוני הגברה). הטוהר, את תגובתיות של תאים אלה אפקטור צריך להיבדק לפני ויוו זריקות (למשל, עם מבחני במבחנה ).
2. שטרם-נותחו אפקטור תאים הכנה
- לאחר בדיקת ספירת אפקטור, לאסוף את התאים אפקטור בשפופרת 50-mL על ידי צנטריפוגה (300 x g למשך 5 דקות).
הערה: כדי לפצות על אובדן, להכין את עודף של תאים (למשל, 50 x 106). - בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend התאים ב-15 מיליליטר וסטרילי PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 גרם כדי לבצע את השטיפה.
- ובזהירות לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע, ואז resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- העבר את התאים resuspended microtube 1.5-mL עבור צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
- ובזהירות לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting לאט.
- Resuspend בגדר תא ב- µL 8 ל- PBS סטרילי לכל העכבר.
הערה: זהו צעד קריטי. - למדוד את עוצמת הקול של התליה תא על-ידי שימוש של micropipette. אם יש צורך, מוסיפים PBS סטרילי (20 x 106 תאים µL 15 ל- PBS למנה) ומערבבים היטב.
- לבדוק, באמצעות micropipette, כי אמצעי האחסון הסופי לכל העכבר הוא בין 15 ל-20 μL (imperatively µL < 20).
- לשמור את התאים על הקרח עד סטיאוטטי הזרקה.
הערה: לא נבדקו יותר מ 3-h timepoints.
3. הזרקת סטיאוטטי
-
הגדרת ציוד
- להרכיב, לכייל מסגרת קטנה סטיאוטטי בעלי חיים על פי הוראות היצרן על מנת להבטיח את הדיוק של זריקות תוך-גולגולתי (למשל, מזרק, לנפח הרצוי בגודל קצב הזרקת).
הערה: קצב איטי אינפוזיה מומלץ (קרי, 2-3 µL/min). - התקן את החומר תחת מיקרוביאלי ביטחון cabinet (MSC) כדי לשמור על העקרות של המכשירים וכדי להגן על העכברים מפני זיהומים.
הערה: במקום "גושי איזותרמי" באמבט מים בטמפרטורה 37 º C מערכת זו מגבילה להיפותרמיה של עכברים במהלך הניתוח. חימום רפידות, אשר נחוצים לטיפול procedural, יש להשתמש במהלך ה-ניטור טמפרטורה רציפה.
- להרכיב, לכייל מסגרת קטנה סטיאוטטי בעלי חיים על פי הוראות היצרן על מנת להבטיח את הדיוק של זריקות תוך-גולגולתי (למשל, מזרק, לנפח הרצוי בגודל קצב הזרקת).
-
הכנת בעלי חיים שטרם-נותחו
- עזים ומתנגד עכבר עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (10 mg/mL), חריגות השירותים הווטרינריים (0.1 מ"ג/מ"ל) ב- µL 10/גרם של משקל הגוף של העכבר.
- לבצע בדיקת קמצוץ הבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה של שיכוך כאבים של החיה.
הערה: כל תנועה היא אינדיקציה עמוק ללא כאבים, ו, במקרה כזה, עוד כמה דקות נדרשים לפני הפעולה. - ברגע העכבר כראוי מרדימים, להשתמש במספריים כדי להסיר את הפרווה באתר כירורגית (בין שתי האוזניים, עד האף).
-
תא שטרם-נותחו הכנה
- בזהירות resuspend התאים עם פיפטה (מספר פעמים) לפני כל זריקה למניעת תא כלשהו הצליעה.
- בזהירות למשוך נפח התאים הדרושים ההשעיה (15-20 µL) microsyringe 22-G כדי למנוע את השאיפה של בועות.
הערה: שלב העמסה תא אל microsyringe זה חשוב לצמצם סטיות מוזרק בכמויות. מחדש תאים עבור כל זריקה בודדים בין הליכים כדי למנוע כל תא clumping וכדי להבטיח מספר זוגי של ניהול תאים אפקטור במדגם. - אז, במקום את המזרק לתוך המשאבה מזרק מותאם.
-
טיפול פרוצדורלי
- לחטא באתר כירורגית עם מטליות ספוג בתמיסה povidone יוד 5% לפחות 3 x.
- הצב משחה אופטלמולוגיות סיכה בעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות יש הקרנית.
- מיקום העכבר anesthetized על המסגרת סטיאוטטי, על בלוק איזותרמי חמים מכוסה בניילון סטרילי כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר במהלך הניתוח ולהגביל את התמותה.
הערה: אף נשרי ושיניים של העכבר כראוי שנמצאת מעל הבר השן, כדי להבטיח זרימת הנשימה נאותה במהלך ההליך. - ברגע כשהעכבר ממוקם מעל הבר השן, להדק את הסורגים באוזן בחוזקה תחת האוזניים של העכבר כדי לשתק את הראש.
הערה: להיות זהירים כדי לא לגרום נזק את עור התוף או לסכן את הנשימה. - עושים חתך בעור הפנים של קו האמצע 1-2 ס מ עם מספריים סטרילי לאורך החלק העליון של הגולגולת של והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה לחשוף את הגולגולת.
- זיהוי הצומת של הווריד, הילתית התפרים (Bregma) כדי לשמש ציוני בלוקאליזציה סטיאוטטי לפני הזריקה (המוצג באיור1).
- מניחים את microsyringe מעל נקודה זו.
- להעביר את microsyringe הימנית 2 מ"מ ו- 0.5 מ מ קדמי של Bregma.
- משתמש של microdrill, לעשות חור קטן בתוך הגולגולת עם מקדחה סטרילי בנקודות הציון קבועה מראש. יש להיזהר נותרו שטחי על מנת למנוע כל פגיעה של המוח.
הערה: ב פרוטוקול זה, תאים חיסוניים הוזרקו בתוך גידול הוקמה (שבוע לאחר הזרקת תאי הגידול). העור צריך להיות נפתח מחדש (צלקת) ההזרקה מתבצעת באותן קואורדינטות משמש את ההשתלה תא הגידול (החור הוא בדרך כלל עדיין נוכחים עד כדי 2 שבועות לאחר ההזרקה). קואורדינטות נבחרו עבור הזרקת תאי הגידול ו אפקטור ב המוח parenchyma13,14.
-
הזרקה של תאי מערכת החיסון אפקטור
- הכנס את microsyringe לתוך החור קדח ובזהירות, שזזות באיטיות, קדימה מחט 3 מ מ למטה בתוך השכבה הקשה של המוח, ואחר לאחור 0.5 מ מ לעומק הסופי של 2.5 מ מ לפני הזרקת תאי אפקטור.
- הפעלת את הזריקה תא אפקטור ב- 2-3 µL/דקה ונטר העכברים לאורך זמן ההזרקה.
- לאחר הזריקה תושלם, לשלוף את המחט עבור רק 1 מ מ ולשמור את microsyringe במקום במשך דקה נוספת לפני לאט פורש לחלוטין את microsyringe, כדי למנוע כל זליגות אתר העירוי.
הערה: בעקבות ההסרה של החיה מהמכשיר סטיאוטטי נקו מיד ציוד הזרקה ניסויים עתידיים.
-
הטיפול לאחר הניתוח ומעקב של העכבר
- להסיר את החיה מן המסגרת סטיאוטטי מיד להחיל povidone יוד 5% פתרון באזור הניתוח, לסגור את העור עם תפירה המתאים.
- החל לידוקאין 2% ג'ל ישירות על הפצע, לנהל 0.15 µg/g של הבופרנורפין על-ידי זריקה תת עורית עבור procedural שיכוך כאבים.
- המקום בחזרה העכבר anesthetized לכלוב שלו מעל כרית החימום מוגדר 37 ° C כדי לשמור על טמפרטורת גוף של העכבר המתאים וכדי למנוע היפותרמיה בכל.
הערה: דיור נפרדת אין צורך. - לפקח על העכבר עד זה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה, להעביר אותו חדר דיור.
הערה: נכון להיום, פרוטוקול זה ישנה תמיכה כמו כמה סיבוכים בלתי צפויות התרחשו (< 5% של עכברים מוזרק). - מדי יום לפקח על העכברים, להרדימם כאשר סימנים בריאות הפוחתת מובחנות (למשל, תנוחת שפופות, ניידות, השתטחות או ירידה במשקל הגוף משמעותית [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה מתאר את האסטרטגיה של העברות המאמצת של תאים אפקטור מערכת החיסון התאית בתוך המוח של עכברים נושא הגידול, בהתבסס על זריקות סטיאוטטי שבוצעו ישירות בתוך המיטה הגידול.
כדי למזער כל סיכון של פגיעה מוחית המשויך אמצעי הזרקה גדולים, התליה תא אפקטור צריך להיות מרוכז (20 x 106 תאים ב- 15-20 µL ל- PBS). כדי לבדוק אם שלב זה ריכוז תא עשוי להשפיע על הכדאיות של התאים אפקטור, תאים אלה היו מוכנים לפי הפרוטוקול המתואר, לטעון את microsyringe. התאים אפקטור נאספו באופן מיידי, או 10 דקות לאחר לטעון אותם לתוך microsyringe. התאים היו מוכתמים propidium יודיד (PI), פלורסנט DNA intercalating סוכן שאינו permeant לחיות תאים ו שנותחה על ידי cytometry זרימה-שונה timepoints (0, 24 ו- 72 שעות). התוצאות מציגות כי ההכנה וטעינה לתוך microsyringe לא להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות של תאים אפקטור לפחות 24 שעות (איור 2A ו- 2B). ב- 72 שעות, נצפתה עלייה קלה, אבל לא משמעותי, של תאיםחיוביים PI (14% לעומת 11% עבור תאים לפרוק). באופן דומה, ניתחנו את תגובתיות antitumor של תאים אפקטור היו מוכנים, נשמר בקירור למשך 3 שעות. אפקטור התאים היו cocultured עם תאים סרטניים במוח למשך 4 שעות בנוכחות של mAb אנטי-CD107a. קולטנים upregulation של דה מרקר הפעלה CD107a, דומה לערך מתקבל בתנאי בקרה, מציין כי תגובתיות של תאים אפקטור אינה מושפעת על-ידי הכנת ההעמסה לתוך microsyringe (איור 2C).
כדי להעריך אם תאים אפקטור לשרוד ולנוע parenchyma המוח בעקבות שלהם אינטרה-tumoral-השרשה, 20 x 106 אפקטור הוזרקו תאים לתוך האתר הגידול של עכברים נושא גידול במוח (GBM-111). שבוע לאחר מכן, המוח נאספו, קבוע, המחולקת למקטעים, ויטראז'ים הגיוון hematoxylin אאוזין, ספרן (לערוך) ואת האדם אנטי CD3 mAb (IHC). הגיוון הוא לזהות את המבנה של הגידולים במוח (איור 3, פאנל שמאלי). ההכתמה CD3 מזוהה, לשפות אחרות של מערכת החיסון T לימפוציטים (כאן, תאי Vϒ9Vδ2 T אדם) (איור 3, לוח נכון). מעניין, לימפוציטים T התגלו סביב הגידול (איור 3, לוח נכון העליון), ליבת הגידול (איור 3, לוח נכון אמצעית), אלא גם בחצי הכדור contralateral (איור 3, פאנל התחתונה נכון). יתר על כן, הפונקציה של לימפוציטים מסוג T אנושיים מבודד מן המוח העכבר 48 שעות לאחר ההזרקה שלהם (4 x 106 αβ T תאים), אשר מייצגים 2% של תאי המוח, נותחו. התוצאות עולה כי אפקטור המוזרק המוח שנאספו allogeneic αβ T תאים להרחיב להתרבות על הפעלה תאים פא-מזין של שאינם ספציפיים שבוצעה בנוכחות il-2 (איור 4).
יחד, תוצאות אלו מראות כי תאי אפקטור T מוכן לנהל תחת נהלים אלה לשרוד במשך שעות במוח, יכולים לסייר בתוך הגידול ורקמות המוח בריא. הליכים אלה שימשו להערכת יעילות טיפולית סטיאוטטי כמקובל allogeneic תאי Vϒ9Vδ2 T אדם מנוחתו antitumor כדי לשלוט על התפתחות האדם GBM המוח גידולים9,11. מחקרים אלה ראיות כי זריקות של allogeneic האנושי T לימפוציטים במיטה הגידול באופן משמעותי לשפר את ההישרדות של עכברים נושאת גידולים במוח. מעניין, ששרדו עכברים לא נשאו תאים סרטניים לזיהוי, שמעיד דחייה מלאה הגידול.
איור 1 : תמונה של מוקדי אנטומי על הגולגולת העכבר. זה כולל הסאגיטלי (הקו האדום), התפרים הפרונטליים (קו כחול), הצטלבות שלהם (Bregma) משמש כדי להציב את האתר של הזרקת. סרגל קנה מידה מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הישרדות והפעלה של מוכן לימפוציטים T. אפקטור תאים (נח, תאים אנושיים Vϒ9Vδ2 T היקפיים) היו מוגבר, שהוכנו על-פי ההליך המתואר. צביעת של לימפוציטים עם propidium יודיד (PI), ה-DNA intercalating מתחם פלורסנט שאינו permeant לחיות תאים, והפעלה פונקציונלי בוצעו. (א) לוח זה מראה מגרש נציג של קדימה (FSC-H) לעומת צד (האס-H) פיזור gating של לימפוציטים (עזב החלונית). ההיסטוגרמה מציגה ההכתמה PI של שליטה מגודרת לימפוציטים (לוח נכון). אחוז לימפוציטיםחיובי PI מסומן. (B) לוח זה מראה את אחוז לימפוציטים מת (PIחיובי) שנאספו באופן מיידי (קו כחול בהיר) או לאחר 10 דקות (קו כחול כהה), microsyringe, נמדד ב timepoints המצוין. כפקד, שימשו תאים מוכן לפרוק (גריי קו). (n = 3; מתכוון ± SD; ns = לא משמעותי.) CD107a (ג) גיוס משטח נמדדה על ידי cytometry זרימה גם Vδ2חיובי בקרה בתאים (מוכנים) או מוכן לימפוציטים המתוחזקים על קרח (מוכן + 3 h) בעקבות של coculture עם היעד תאים סרטניים אנושיים במוח העיקרי. אחוז לימפוציטים מסומן כל רביע cytometric. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי, לוקליזציה של T לימפוציטים בתוך המוח של עכברים נושאות. שבוע אחרי גליובלסטומה המוח גידול השרשה, תאים חיסוניים אפקטור (נח, תאים אנושיים Vϒ9Vδ2 T היקפיים) היו מוזרק לתוך מוחותיהם של עכברים. שבוע לאחר הטיפול immunotherapeutic, המוח היו נאספים, קבוע, למחלקה. חלקים במוח היו בצבע לניתוח אימונוהיסטוכימיה (hematoxylin אאוזין, הגיוון ספרן [הס]) (פאנל שמאלי) או מוכתם האדם אנטי CD3 נוגדנים (לוח נכון). התוצאות המוצגות הן נציג של 3 ניסויים עצמאית. סרגל קנה מידה מסומן.
איור 4 : הפעלה של T לימפוציטים שנאסף המוח של עכברים התייחס. מנוחתו לימפוציטים T אנושיים (כאן, 4 x 106 האנושי αβ T לימפוציטים) היו מוזרק לתוך מוחותיהם של NSG עכברים. לאחר 48 שעות, המוח היו נאספים, חלופה מועדפת. אחוז לימפוציטים T הסתננות המוח האנושי נמדדה על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדן נגד CD3 (פאנל התחתונה). התאים שנאספו היו נזרע (10 תאים טוב) ב 96-ובכן להטלטל U צלחות מגורה (PHA-מזין תאים ו il-2) 20 ימים (16 הכפלת מחזורים). הערה, ביום 10, 13.3 x 106 של לימפוציטים מסוג T אנושיים התקבלו (לוח נכון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העברה המאמצת של נבחרת מקורית או תאים מהונדסים אפקטור המערכת החיסונית מייצג גישה מבטיחה לטפל ביעילות גידולים, כגון סרטן המוח infiltrative, מטפלת הגבלת reactivities נגד תאים שאינם טרנספורמציה15, 16,17,18. עם זאת, מערכת העצבים המרכזית, המהווה את המוח, יש מצב המערכת החיסונית מסוים, ובמיוחד בשל קיום מחסום הדם - מוח ואת חוסר ניקוז לימפטי קלאסית מערכת19,20. תכונות פיזיולוגיות אלה משפיעים על רקמות סחר, שיכול לסכן זריקות מערכתית של תאים חיסוניים. כדי להתגבר על מכשולים אלה, זריקות intraparenchymal נחקרו על עיקרון זה antitumor תאים מועברים באופן מקומי אלא, צמוד לאתר את הגידול, באשר microspheres המכילים תרכובות תרופתי21, 22. מצד אחד, דילול מוגבלת של לימפוציטים בתוך איבר המין עשוי לשפר את יעילות antitumor שלהם, אבל זה יכול גם להגביר מכנית או גידול הסתגלות השפעות מזיקות, כגון דחיסה tissular, אשר מתפתחת לאורך המוח הגידול. זה מרמז כי הליך זה דורש כרכים קטנים של זריקות immunotherapeutic. בנושא זה אפילו יותר קריטי במודלים ניסיוני של בעלי חיים במוח אשר גידולים לא יכולים להיות בניתוח טוחנות. מאמר זה מתאר גישה טיפולית ההכנה ואספקה המקומי של המוח גידול ספציפי הסלולר effectors, המבוסס על injection(s) סטיאוטטי של לימפוציטים מסוג T אנושיים allogeneic.
מחקר זה מראה ההכנה והעברת stereotaxic לימפוציטים מסוג Vϒ9Vδ2 T האנושי allogeneic בעכברים NSG immunodeficient נושא xenografts GBM אנושי. השלב הראשון של פרוטוקול זה מתאר הליך פשוט הגברה allogeneic לימפוציטים מסוג T מ PBMCs של תורמים בריא, שימוש של תקן ספציפי פא-מזיני-IL2 גירוי מייצרת כמויות גדולות של טהור T לימפוציטים, המאפשר שלהם23,ניצול לתפיסות שתוארו24. השלב השני של מאמר זה מתמקד הכנת נח לימפוציטים-T המתלים ביום של המינהל stereotaxic. דגש מיוחד הושם על שלב חשוב זה, הדורש צפיפות הסלולר גבוהה זה לא תשפיע על הכדאיות והפונקציה של הנבחרת אפקטור T לימפוציטים. לבסוף, בנוגע ויוו ניסויים, הכנת T לימפוציטים, הזרקת שלהם בתוך תוכו הגידול מזוהה עם ההפצה שלהם, לא רק בתוך הגידול אלא גם ברקמות שמסביב המוח, הדגשת שלהם היכולת מסוים לפטרל כדי לעקוב אחר תאים סרטניים פולשני. חשוב, שיטות הכנה, הזרקת אלה שומרים על היכולת של לימפוציטים T אלה להיות מופעל בתוך המוח על זיהוי ספציפי של תאים סרטניים במוח. בסך הכל אלה מאפיינים משכנעים להבטיח את יכולתם של לימפוציטים מסוג T כדי במיוחד למטרה ויעילה לחסל תאים סרטניים במוח עמוק infiltrative אשר הם סימני ההיכר של GBM25. ראוי לציין, טיפול מיוחד צריכה להילקח במהלך ההזרקה, הסרת microsyringe כדי למזער את כל הנגע המוח או תא אפקטור דליפות.
לסיכום, מאמר זה מתאר הליך יעיל להעברת כמויות גדולות של לימפוציטים allogeneic אנטי הגידול אנושי, כגון נח לימפוציטים Vϒ9Vδ2T האנושי, בתוך בקרבת גידולים במוח. חשוב לציין, הליך לתפיסות שתוארו לא מלווה עם תופעות לוואי לימפוציטים T שהועברו (למשל, הכדאיות, תגובתיות) או על רקמות המוח. מחקרים שנעשו לאחרונה, מבוסס על מודלים orthotopic מאתר של ראשי GBM אנושי, הראו כי Vϒ9Vδ2T לימפוציטים היעד ביעילות תאים GBM, כולל תאים סרטניים, אשר חדרו עמוק במוח parenchyma9,11. רכיבים אלה לפתוח הזדמנויות לפיתוח של הרומן המאמצת T לימפוציטים נהלי ההעברה. זה יכול להיות מיושם בהמופע הראשון בעכברים נושאת גידולים במוח orthotopic ואז, במחקרים קליניים בחולי GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה הצוות של בית החולים האוניברסיטאי בעלי חיים המתקן (UTE) של נאנט על גידול בעלי חיים, טיפול הסלולר, tissular הדמיה מתקן הליבה של אוניברסיטת ננט (MicroPICell) עבור הדמיה, המתקן Cytometry (Cytocell) של נאנט לסיוע טכני מומחה שלהם. עבודה זו מומן על ידי INSERM CNRS, אוניברסיטת דה נאנט, Institut du הארצי לסרטן (האינקה #PLBio2014-155), le חדר מרווח וחדיש ליגה הלאומית לסרטן (AO InterRegional 2017), האיחוד האירופי עידן-Net Transcan2 (Immunoglio). הצוות ממומן על ידי Fondation pour la Medicale רשרש (DEQ20170839118). עבודה זו מומש בהקשר של LabEX IGO, התוכניות IHU-צ'סטי, נתמך על ידי Investissements סוכנות המחקר הלאומי d'Avenir באמצעות התוכניות ANR-11-LABX-0016-01 ו- ANR-10-IBHU-005, בהתאמה. הפרויקט IHU-צ'סטי נתמך גם על ידי נאנט Metropole ובאזור פיי דה לה לואר. המחברים מודים Chirine Rafia על מתן עזרה בתיקון כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
