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Immunology and Infection

Orthotopic मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी Xenografts के Murine मॉडलों में साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का स्टीरियोटैक्टिक दत्तक अंतरण

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/57870
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2
1INSERM, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, CRCINA, 2Immunotherapy, Graft, Oncology, LabEx IGO, 3Hopital de Nantes, Hotel Dieu
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम orthotopic मानव प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर ले जाने immunodeficient चूहों में तैयारी और allogeneic मानव लिम्फोसाइटों के stereotaxic प्रशासन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. इस अध्ययन व्यवहार्यता और intrabrain की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता-सेलुलर immunotherapies दिया दोनों के लिए एक सबूत की अवधारणा प्रदान करता है ।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (जीबीएम), वयस्कों में सबसे लगातार और आक्रामक प्राथमिक मस्तिष्क कैंसर, आम तौर पर एक गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़ा हुआ है, और दुर्लभ कुशल चिकित्सा पिछले दशक में प्रस्तावित किया गया है । उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों डिजाइनिंग के लिए होनहार उंमीदवारों के अलावा, सेलुलर immunotherapies के लिए अत्यधिक आक्रामक और chemo-radioresistant ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने का लक्ष्य दिया गया है, इस कैंसर के एक तेजी से और घातक पतन में शामिल होने की संभावना । इस प्रकार, प्रशासन (ओं) allogeneic जीबीएम-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा सेल प्रभाव, जैसे मानव vυ9vδ2 टी लिम्फोसाइटों के रूप में, ट्यूमर के आसपास के क्षेत्र में एक अनूठा कुशल और उच्च केंद्रित चिकित्सकीय एजेंटों को सीधे देने का अवसर का प्रतिनिधित्व करता है मस्तिष्क द्रोह की साइट । यहाँ, हम orthotopic मानव प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर ले जाने immunodeficient चूहों में तैयारी और allogeneic मानव लिम्फोसाइटों के stereotaxic प्रशासन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. यह अध्ययन व्यवहार्यता और इन सेलुलर immunotherapies कि लिम्फोसाइटों ट्यूमर बिस्तरों के भीतर allogeneic मानव intrabrain के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन पर निर्भर की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता के लिए एक नैदानिक सबूत-की अवधारणा प्रदान करता है ।

Introduction

जीबीएम (डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV तारिकाकोशिकार्बुद), वयस्कों में सबसे लगातार और आक्रामक प्राथमिक मस्तिष्क कैंसर है । आक्रामक उपचार है कि सर्जरी और रेडियो-कीमोथेरेपी गठबंधन के बावजूद, जीबीएम एक अत्यंत गरीब पूर्वानुमान के साथ जुड़े रहता है (१४.६ महीने के औसत अस्तित्व और एक 2 साल की मृत्यु दर > ७३%)1। यह सबूत है कि कुछ कुशल चिकित्सीय अग्रिम पिछले2दशक से अधिक मांय किया गया है । अधिक प्रभावी चिकित्सकीय रणनीति3,4,5, immunotherapies6 के डिजाइन के लिए उंमीदवारों के अलावा वर्तमान में ट्रैक करने के लिए और अत्यधिक इनवेसिव और रेडियो/chemo प्रतिरोधी ट्यूमर को खत्म करने का पता लगाया है कोशिकाओं, तेजी से और घातक ट्यूमर पतन के लिए उनके महत्वपूर्ण योगदान के लिए संदिग्ध7. विभिन्न संभावित प्रतिरक्षा लक्ष्यों की पहचान की और immunotherapies के लिए प्रस्तावित किया गया था, जिसमें प्राकृतिक या संशोधित αβ या υδ टी लिम्फोसाइटों जैसे जीबीएम-विशिष्ट ट्यूमर एंटीजन या तनाव प्रेरित अणुओं8,9, 10. चयनित जीबीएम-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा सेल प्रभाव प्रबंधन करने के लिए संभावना अवशिष्ट द्रोह की साइट में सीधे प्रभाव लिम्फोसाइटों की ऊंचा राशि देने के लिए एक अनूठा अवसर का प्रतिनिधित्व करता है । इस रणनीति का समर्थन करने के लिए, हम हाल ही में दिखाया गया है कि immunodeficient चूहों पर आधारित मॉडल orthotopic प्राथमिक मानव जीबीएम ले xenografts ईमानदारी दोहराऊंगा रोगियों में ब्रेन ट्यूमर के विकास जीबीएम9,11. इसके अलावा, इन मॉडलों के लिए adoptively हस्तांतरित allogeneic मानव vυ9vδ2t लिम्फोसाइटों की मजबूत अर्बुदरोधी क्षमता का प्रदर्शन किया गया ।

इस प्रोटोकॉल allogeneic टी लिम्फोसाइटों के दत्तक हस्तांतरण के आधार पर जीबीएम के रूप में मस्तिष्क ट्यूमर, के स्टीरियोटैक्टिक immunotherapies को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम का वर्णन । लेख से पता चलता है: (i) चिकित्सीय allogeneic प्रतिरक्षा प्रभावक T लिम्फोसाइटों, जैसे मानव vυ9vδ2t लिम्फोसाइटों के प्रवर्धन; (ii) इंजेक्शन के लिए इन effects T लिम्फोसाइटों की तैयारी; (iii) मस्तिष्क के भीतर स्टीरियोटैक्टिक प्रशासन के लिए प्रक्रिया, ट्यूमर के पास. यह लेख भी स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के बाद इन सेलुलर प्रभाव के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

चिकित्सीय दृष्टिकोण यहां प्रस्तुत 20 x 10 प्रत्येक ब्रेन ट्यूमर असर immunodeficient माउस के लिए खुराक प्रति 6 प्रभाव कोशिकाओं के इंजेक्शन पर आधारित है । इन विट्रो विस्तार चरण में एक प्रारंभिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, गैर-विशिष्ट सेल विस्तार phytohemagglutinin (के ्ह्-L) और विकिरणित allogeneic फीडर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है: परिधीय-रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) स्वस्थ दाताओं और Epstein बर्र वायरस (EBV) से-तब्दील बी-lymphoblastoid सेल लाइनों (BLCLs), द्वारा PBMCs इन विट्रो में EBV से युक्त संस्कृति supernatant के साथ संक्रमण Marmoset B95-8 सेल लाइन से, 1 µ जी की उपस्थिति में/एमएल cyclosporin-ए ।

जीबीएम-प्रतिक्रियाशील प्रभाव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तुलना में और इन विट्रो परख9में से चुना जाता है । इन प्रभाव कोशिकाओं को सक्रिय और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिवर्धित कर रहे हैं, उनके स्वभाव के अनुसार (जैसे, मानव Vγ9Vδ2 टी लिम्फोसाइटों9 या मानव विरोधी दाद वायरस αβ टी लिम्फोसाइटों12) की एक ंयूनतम शुद्धता के साथ > ८०%, के रूप में नियमित रूप से cytometric विश्लेषण द्वारा जांच की । सेल विस्तार नीचे विस्तृत प्रक्रिया विभिंन मानव लिम्फोसाइट सबसेट के लिए लागू होता है ।

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Protocol

निंनलिखित प्रक्रिया पशु विषयों को शामिल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था (समझौते #00186 .02; भुगतान करता है de la लॉयर की क्षेत्रीय नैतिकता समिति [फ्रांस]) । मानव PBMCs सूचित स्वस्थ दाताओं से एकत्र रक्त से अलग किया गया (Etablissement Français du गाया नांत, फ्रांस) । सभी कदम बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं ।

1. साइटोटोक्सिक effecter T लिम्फोसाइटों का गैर-विशिष्ट विस्तार

  1. तैयार करें और ३५ Gy पर फीडर सेल विकीर्ण । 2 x 105 -4 x 105 प्रभाव कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए, तैयार 10 x 106 PBMCs और 1 x 106 BLCLs अलग से तीन, स्वस्थ दाताओं ।
  2. 10% गर्मी-निष्क्रिय FCS, 2 मिमी एल-glutamine, पेनिसिलिन (१०० IU/एमएल), और streptomycin (०.१ µ g/एमएल) और ३०० IU/एमएल रिकॉमबिनेंट आईएल-2 के साथ पूरक RPMI के 15 मिलीलीटर में दोनों फीडर कोशिकाओं और प्रभाव कोशिकाओं resuspend ।
  3. 1 µ जी/एमएल, ध्यान से मिश्रण के एक अंतिम एकाग्रता में के ्ह्-L जोड़ें, और वितरित १५० µ एल सेल निलंबन के प्रति अच्छी तरह से U-तली हुई प्लेटों में ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% एक humidified वातावरण में सह2 के साथ मशीन ।
  5. दैनिक संस्कृति वेल्स (~ 7 दिन) में बड़े सेल के झुरमुट के रूप में जब तक प्लेट की जांच करें ।
  6. एक संस्कृति कुप्पी में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल में ताजा संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं स्थानांतरण ।
  7. कुल सेल संख्या का निर्धारण (2x एक सप्ताह) की गिनती और उंहें 1 x 106 कोशिकाओं में बनाए रखने/
    नोट: प्रभाव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक आराम राज्य में चिकित्सीय प्रशासन के लिए तैयार होना चाहिए (आमतौर पर 3 सप्ताह के प्रारंभिक प्रवर्धन उत्तेजना के बाद) । शुद्धता और इन प्रभावक कोशिकाओं के जेट vivo इंजेक्शन में करने से पहले की जाँच की जानी चाहिए (जैसे, के साथ इन विट्रो परख).

2. पूर्व ऑपरेटिव प्रभाव कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रभाव सेल गिनती की जांच करने के बाद, एक ५०-एमएल ट्यूब में (5 मिनट के लिए ३०० x g ) द्वारा प्रभावक कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    नोट: किसी भी हानि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, कोशिकाओं की एक अतिरिक्त तैयार (उदा, ५० x 106).
  2. ध्यान से supernatant हटाने और बाँझ पंजाब के 15 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और ३०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक को धोने प्रदर्शन करते हैं ।
  3. ध्यान से और पूरी तरह से supernatant हटाने और फिर बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  4. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक के लिए एक १.५ मिलीलीटर microtube में resuspend कोशिकाओं स्थानांतरण ।
  5. ध्यान से और supernatant को धीरे से pipetting करके पूरी तरह हटा दें ।
  6. माउस प्रति बाँझ पंजाबियों के 8 µ एल में सेल गोली resuspend ।
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है ।
  7. एक micropipette का उपयोग करके सेल निलंबन की मात्रा को मापने । यदि आवश्यक हो, तो बाँझ पंजाबियों (20 x 106 कोशिकाओं में 15 µ एल पंजाब की खुराक प्रति) और मिश्रण ध्यान से जोड़ें ।
  8. जाँच करें, एक micropipette का उपयोग करके, कि अंतिम वॉल्यूम प्रति माउस 15 और 20 μL के बीच है (अनिवार्य रूप से < 20 µ l).
  9. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
    नोट: 3-h से अधिक timepoints परीक्षण नहीं किए गए थे ।

3. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन

  1. उपकरण सेट-अप
    1. इकट्ठा और intracranial इंजेक्शन की सटीकता (जैसे, सिरिंज आकार, वांछित मात्रा, और इंजेक्शन की दर) सुनिश्चित करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक छोटे से जानवर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम जांचना ।
      नोट: एक धीमी सुई की दर की सिफारिश की है (यानी, 2-3 µ l/
    2. उपकरणों की बाँझ बनाए रखने के लिए और चूहों को संक्रमण से बचाने के लिए एक माइक्रोबियल सुरक्षा मंत्रिमंडल (एमएससी) के तहत सामग्री स्थापित करें ।
      नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में प्लेस "इज़ोटेर्माल ब्लॉक" । यह सिस्टम सर्जरी के दौरान चूहों की हाइपोथर्मिया को सीमित करता है । हीटिंग पैड, जो बाद के लिए आवश्यक है प्रक्रियात्मक देखभाल, सतत तापमान की निगरानी के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. पूर्व को-ऑपरेटिव पशु तैयार
    1. Anesthetize माउस के शरीर के वजन के 10 µ एल/जी पर ketamine (10 मिलीग्राम/एमएल) और xylazine (०.१ मिलीग्राम/एमएल) के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ एक चूहा ।
    2. पूरा संज्ञाहरण और पशु की analgesia सुनिश्चित करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण प्रदर्शन.
      नोट: कोई भी आंदोलन गैर-गहरी analgesia का एक संकेत है और यदि ऐसा होता है तो कार्रवाई दोहराने से पहले कुछ और मिनटों की आवश्यकता होती है ।
    3. एक बार जब माउस ठीक से anesthetized है, तो सर्जिकल साइट (दोनों कानों के बीच, नाक तक) से फर को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें.
  3. पूर्व को-ऑपरेटिव सेल की तैयारी
    1. किसी भी कोशिका के झुरमुट को रोकने के लिए प्रत्येक इंजेक्शन से पहले पिपेट (कई बार) के साथ कोशिकाओं को ध्यानपूर्वक पुनर्स्थगित करें ।
    2. ध्यान से बुलबुले की आकांक्षा से बचने के लिए आवश्यक कोशिका निलंबन की मात्रा (15-20 µ एल) 22-जी microsyringe में ड्रा ।
      नोट: यह कक्ष-लोड हो रहा है चरण microsyringe में इंजेक्टेड वॉल्यूम में प्रसरण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । किसी भी कोशिका के झुरमुट को रोकने के लिए प्रक्रियाओं के बीच प्रत्येक व्यक्ति इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को पुनः लोड और पलटन में प्रभाव कोशिकाओं प्रशासन की एक भी संख्या सुनिश्चित करने के लिए ।
    3. फिर, अनुकूलित सिरिंज पंप में सिरिंज प्लेस ।
  4. प्रक्रियागत देखभाल
    1. povidone में लथपथ झाड़ू के साथ शल्य साइट को संक्रमित-आयोडीन 5% समाधान कम से कम 3x ।
    2. कॉर्निया के किसी भी सुखाने को रोकने के लिए माउस की आंखों में एक चिकनाई नेत्र मरहम लगाएं ।
    3. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर anesthetized माउस की स्थिति, एक गर्म इज़ोटेर्माल एक बाँझ प्लास्टिक लपेटो के साथ कवर के लिए सर्जरी के दौरान माउस के तापमान को बनाए रखने और मृत्यु दर सीमा पर ।
      नोट: इस प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त श्वसन प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए माउस की नाक और दांतों को दांत बार के ऊपर उचित रूप से तैनात करना चाहिए ।
    4. एक बार माउस दांत पट्टी के ऊपर तैनात है, सिर स्थिर करने के लिए माउस के कानों के नीचे मजबूती से कान सलाखों कस ।
      नोट: eardrums को नुकसान न पहुंचाने या संवेदनाएं समझौता करने के लिए सावधान रहें ।
    5. पूर्वकाल से cranium के ऊपरी भाग के साथ बाँझ कैंची के साथ एक 1-2 सेमी midline sagittal त्वचा चीरा बनाने के लिए पीछे खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए ।
    6. इंजेक्शन से पहले ( चित्रा 1में दिखाया गया है) स्टीरियोटैक्टिक स्थानीयकरण के लिए स्थलों के रूप में सेवा करने के लिए sagittal और राज्याभिषेक टांके (Bregma) के प्रतिच्छेदन की पहचान करें ।
    7. इस बिंदु के ऊपर microsyringe रखें ।
    8. microsyringe 2 mm दायां पार्श्व और ०.५ mm पूर्वकाल Bregma की चाल ।
    9. एक microdrill का प्रयोग, पूर्व निर्धारित निर्देशांक पर एक बाँझ ड्रिल बिट के साथ खोपड़ी में एक छोटा सा छेद कर. मस्तिष्क के किसी भी दर्दनाक चोट से बचने के क्रम में सतही रहने के लिए सावधान रहें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक स्थापित ट्यूमर के भीतर इंजेक्शन (एक सप्ताह के ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद) थे । त्वचा (निशान) फिर से खोला जाना चाहिए और इंजेक्शन एक ही ट्यूमर कोशिका आरोपण के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक पर किया जाता है (छेद आम तौर पर अभी भी इंजेक्शन के बाद 2 सप्ताह तक मौजूद है). निर्देशांक मस्तिष्क पैरेन्काइमा13,14में ट्यूमर और प्रभाव कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए चयन किया गया.
  5. प्रतिरक्षा प्रभाव कोशिकाओं के इंजेक्शन
    1. ध्यान से ड्रिल्ड छेद में microsyringe डालने और, धीरे चल रहा है, आगे सुई 3 मिमी में नीचे और फिर पिछड़े ०.५ मिमी २.५ मिमी के एक अंतिम गहराई करने के लिए पहले प्रभाव कोशिकाओं इंजेक्शन करने के लिए ।
    2. 2-3 µ l/मिनट पर प्रभाव सेल इंजेक्शन चलाएँ और इंजेक्शन समय के साथ सभी चूहों की निगरानी.
    3. एक बार इंजेक्शन पूरा हो गया है, केवल 1 मिमी के लिए सुई को वापस लेने और एक अतिरिक्त मिनट के लिए जगह में microsyringe रखने से पहले धीरे से पूरी तरह से microsyringe वापस लेने, अर्क साइट से किसी भी रिसाव को रोकने के लिए.
      नोट: स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस से पशु को हटाने के बाद, तुरंत आगामी प्रयोगों के लिए इंजेक्शन उपकरण साफ.
  6. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल और माउस के अनुवर्ती
    1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से पशु निकालें और तुरंत चीरा साइट पर povidone आयोडीन 5% समाधान लागू करते हैं और एक उचित शल्य चिकित्सा टांका के साथ त्वचा को बंद करें ।
    2. घाव पर सीधे 2% lidocaine जेल लागू करें और analgesia के बाद प्रक्रिया के लिए एक उपचर्म इंजेक्शन द्वारा buprenorphine के ०.१५ µ g/
    3. एक हीटिंग पैड के ऊपर अपने पिंजरे को वापस anesthetized माउस प्लेस ३७ ° c के लिए एक उपयुक्त माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने और किसी भी हाइपोथर्मिया से बचने के लिए सेट ।
      नोट: पृथक आवास आवश्यक नहीं है ।
    4. माउस की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है और यह एक आवास कमरे में स्थानांतरण ।
      नोट: तिथि करने के लिए, इस प्रोटोकॉल अच्छी तरह से कुछ अप्रत्याशित जटिलताओं के रूप में समर्थित है (इंजेक्शन चूहों का < 5%) ।
    5. दैनिक चूहों की निगरानी और उंहें euthanize जब किसी भी गिरावट स्वास्थ्य लक्षण मनाया जाता है (जैसे, कूबड़ आसन, कम गतिशीलता, रुक्न, या महत्वपूर्ण शरीर के वजन में कमी [≥ 15%]) ।

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Representative Results

इस अध्ययन ट्यूमर ले जाने वाले चूहों के मस्तिष्क के भीतर सेलुलर प्रतिरक्षा प्रभाव कोशिकाओं के दत्तक स्थानांतरण की रणनीति का वर्णन, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के आधार पर ट्यूमर बिस्तर के भीतर सीधे प्रदर्शन किया.

एक बड़े इंजेक्शन की मात्रा के साथ जुड़े मस्तिष्क चोट के किसी भी जोखिम को कम करने के लिए, प्रभाव सेल निलंबन की जरूरत है (20 x 106 पंजाब के 15-20 µ एल में कोशिकाओं) केंद्रित हो । यह जांचने के लिए कि क्या यह कक्ष एकाग्रता चरण प्रभाव वाले कक्षों की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है, इन कक्षों को वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया और microsyringe में लोड किया गया । microsyringe में लोड करने के बाद, तुरंत या 10 मिनट के लिए प्रभावी कक्ष संग्रहीत किए गए थे । कोशिकाओं propidium आयोडाइड (PI), एक फ्लोरोसेंट डीएनए intercalating एजेंट है कि कोशिकाओं को जीवित permeant नहीं है और अलग cytometry (0, 24, और ७२ घंटे) में प्रवाह timepoints द्वारा विश्लेषण के साथ दाग थे । परिणामों से पता चलता है कि तैयारी और microsyringe में लोड हो रहा है नहीं काफी कम 24 घंटे के लिए प्रभाव कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित (चित्रा 2a और बी b) । ७२ घंटे में, एक मामूली है, लेकिन गैर महत्वपूर्ण, PIसकारात्मक कोशिकाओं की वृद्धि (14% अनलोड कोशिकाओं के लिए 11% की तुलना में) मनाया गया था । इसी तरह, अर्बुदरोधी प्रभाव कोशिकाओं है कि तैयार किया गया था और 3 घंटे के लिए बर्फ पर बनाए रखा की जेट विश्लेषण किया गया था । प्रभाव कोशिकाओं एक विरोधी CD107a मॉब की उपस्थिति में 4 घंटे के लिए मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के साथ cocultured थे. सक्रियण मार्कर CD107a के ऊपर, नियंत्रण की स्थिति में प्राप्त मूल्य के समान, यह इंगित करता है कि प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं की प्रतिक्रियाशीलता तैयारी और लोडिंग microsyringe (चित्र 2c) में प्रभावित नहीं होती है.

का मूल्यांकन करने के लिए कि क्या प्रभाव कोशिकाओं जीवित है और उनके अंतर ट्यूमर आरोपण के बाद मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर ले जाने के लिए, 20 x 106 प्रभाव कोशिकाओं एक ब्रेन ट्यूमर (जीबीएम-111) ले जाने चूहों के ट्यूमर साइट में इंजेक्शन थे. एक सप्ताह बाद, दिमाग एकत्र किया गया, फिक्स्ड, खोदी, और hematoxylin के लिए दाग, eosin, और safran रंगाई (वह) और विरोधी मानव CD3 मॉब (आइएचसी). वह रंगाई मस्तिष्क ट्यूमर (चित्रा 3, बाएँ पैनल) की संरचना की पहचान की. CD3 दाग की पहचान की और स्थानीय प्रभाव प्रतिरक्षा टी लिम्फोसाइटों (यहां, मानव vυ9vδ2 टी कोशिकाओं) (चित्रा 3, सही पैनल) स्थानीयकृत । दिलचस्प है, प्रभाव टी लिम्फोसाइटों ट्यूमर के आसपास का पता लगाया गया (चित्रा 3, ऊपरी दाएँ पैनल), ट्यूमर कोर में (चित्रा 3, मध्य सही पैनल), लेकिन यह भी contralateral गोलार्द्ध में (चित्रा 3, नीचे दाएं पैनल) । इसके अलावा, मानव टी लिम्फोसाइटों के समारोह उनके इंजेक्शन (4x106 αβ टी कोशिकाओं) है, जो मस्तिष्क की कोशिकाओं का 2% का प्रतिनिधित्व करने के बाद माउस मस्तिष्क ४८ घंटे से अलग, विश्लेषण किया गया था । परिणाम संकेत मिलता है कि मस्तिष्क इंजेक्शन प्रभाव allogeneic αβ टी कोशिकाओं का विस्तार और एक गैर विशिष्ट ्ह्-फीडर कोशिकाओं सक्रियण IL-2 (चित्रा 4) की उपस्थिति में प्रदर्शन पर पैदा करना ।

एक साथ, इन परिणामों को दिखाने के लिए कि प्रभाव टी कोशिकाओं को तैयार है और इन प्रक्रियाओं के तहत administrated मस्तिष्क में घंटे के लिए जीवित है और ट्यूमर और स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर गश्त कर सकते हैं । इन प्रक्रियाओं को मानव जीबीएम मस्तिष्क ट्यूमर9,11के विकास को नियंत्रित करने के लिए allogeneic मानव आराम vυ9vδ2 टी कोशिकाओं के चिकित्सीय स्टीरियोटैक्टिक प्रशासनों की अर्बुदरोधी दक्षता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन अध्ययनों से सबूत है कि इंजेक्शन allogeneic मानव प्रभाव टी लिम्फोसाइटों के ट्यूमर बिस्तर में काफी मस्तिष्क ट्यूमर ले जाने चूहों के अस्तित्व में सुधार. मजे की बात है, जीवित चूहों पता लगाने वाला ट्यूमर कोशिकाओं को ले नहीं किया था, इस प्रकार एक पूर्ण ट्यूमर अस्वीकृति का संकेत.

Figure 1
चित्रा 1 : माउस खोपड़ी पर मुख्य संरचनात्मक स्थलों की तस्वीर । इस sagittal (लाल रेखा) और कोरोनर (नीली रेखा) टांके और उनके चौराहे (Bregma) इंजेक्शन की साइट ओरिएंट करने के लिए इस्तेमाल शामिल हैं । स्केल बार संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : अस्तित्व और तैयार प्रभाव टी लिम्फोसाइटों के सक्रियकरण । प्रभाव कोशिकाओं (यहां, आराम मानव परिधीय vυ9vδ2 टी कोशिकाओं) प्रवर्धित और वर्णित प्रक्रिया के अनुसार तैयार थे । propidium आयोडाइड (PI), एक डीएनए intercalating फ्लोरोसेंट यौगिक है कि कोशिकाओं को जीने के लिए permeant नहीं है के साथ लिम्फोसाइटों के धुंधला, और कार्यात्मक सक्रियण प्रदर्शन किया गया । (a) यह पैनल फॉरवर्ड (FSC-एच) बनाम साइड (SSC-h) कैटरिंग गेटिंग ऑफ इफेक्टर लिम्फोसाइटों (बांए पैनल) का एक प्रतिनिधि भूखंड दिखाता है. हिस्टोग्राम gated नियंत्रण लिम्फोसाइटों (सही पैनल) के PI धुंधला दिखाता है । PIधनात्मक लिम्फोसाइटों का प्रतिशत दर्शाया गया है । (ख) इस पैनल से पता चलता है मृत लिम्फोसाइटों (PIसकारात्मक) के प्रतिशत तुरंत (लाइट ब्लू लाइन) एकत्र या microsyringe में 10 मिनट (डार्क ब्लू लाइन) के बाद, संकेत timepoints पर मापा । नियंत्रण के रूप में, अनलोड तैयार कोशिकाओं (ग्रे लाइन) का इस्तेमाल किया गया । (n = 3; मतलब ± एसडी; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है.) (ग) CD107a सतह जुड़ाव या तो Vδ2सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं पर प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया (अप्रस्तुत) या तैयार लिम्फोसाइटों बर्फ पर बनाए रखा (तैयार + 3 एच) लक्ष्य मानव प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक coculture के बाद । लिम्फोसाइटों का प्रतिशत प्रत्येक cytometric चक्र में संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : डिटेक्शन और ट्यूमर असर चूहों के मस्तिष्क के भीतर प्रभाव टी लिम्फोसाइटों के स्थानीयकरण. एक सप्ताह के बाद ग्लियोब्लास्टोमा मस्तिष्क ट्यूमर आरोपण, प्रभाव प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यहाँ, आराम मानव परिधीय vυ9vδ2 टी कोशिकाओं) चूहों के दिमाग में इंजेक्ट किया गया. एक सप्ताह immunotherapeutic उपचार के बाद, दिमाग, एकत्र, फिक्स्ड और खोदी गई । मस्तिष्क वर्गों immunohistochemistry विश्लेषण के लिए रंगीन थे (hematoxylin, eosin, और safran [वह] रंगाई) (बाएँ पैनल) या विरोधी के साथ दाग-मानव CD3 एंटीबॉडी (सही पैनल). दिखाए गए परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. स्केल बार संकेत दिया जाता है ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रभावक टी के सक्रियकरण इलाज चूहों के मस्तिष्क से एकत्र लिम्फोसाइटों. रेस्टिंग ह्यूमन टी लिम्फोसाइटों (यहां, 4 एक्स 106 ह्यूमन αβ टी लिम्फोसाइटों) को एनएसजी चूहों के दिमाग में इंजेक्ट किया गया । ४८ घंटे के बाद दिमाग एकत्र हो गया और असंबद्ध । मानव मस्तिष्क का प्रतिशत-घुसपैठ टी लिम्फोसाइटों एक विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी (नीचे पैनल) का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया था । एकत्र कोशिकाओं को वरीयता दी गई (10 कोशिकाओं/९६ में अच्छी तरह से U-तली हुई प्लेट और उत्तेजित (के ्ह्-फीडर सेल और आईएल-2) 20 दिनों के लिए (16 दोहरीकरण चक्र) । नोट, दिवस पर 10, १३.३ x 10 मानव टी लिम्फोसाइटों के6 (सही पैनल) प्राप्त किया गया ।

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Discussion

चयनित देशी या इंजीनियर प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं का एक दत्तक हस्तांतरण के लिए कुशलता से घुसपैठ मस्तिष्क कैंसर जैसे ट्यूमर का इलाज करने के लिए एक होनहार दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, गैर-रूपांतरित कोशिकाओं15के खिलाफ पुनर्क्रियाएं सीमित का ख्याल रखते हुए, 16,17,18. हालांकि, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र है, जो मस्तिष्क शामिल है, विशेष रूप से रक्त मस्तिष्क बाधा के अस्तित्व और एक शास्त्रीय लसीका जल निकासी प्रणाली19,20की कमी के कारण एक विशिष्ट प्रतिरक्षा स्थिति है । इन शारीरिक सुविधाओं ऊतक के अवैध व्यापार को प्रभावित और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रणालीगत इंजेक्शन समझौता हो सकता है । इन बाधाओं को दूर करने के लिए, intraparenchymal इंजेक्शन सिद्धांत है कि अर्बुदरोधी कोशिकाओं बल्कि स्थानीय रूप से दिया जाता है पर पता लगाया गया है, ट्यूमर साइट को बारीकी से, के रूप में microspheres कि औषधीय यौगिकों21 होते हैं, 22. एक तरफ, अंग के भीतर लिम्फोसाइटों के सीमित कमजोर पड़ने उनके अर्बुदरोधी दक्षता में सुधार हो सकता है, लेकिन यह भी tissular संपीड़न के रूप में बचके यांत्रिक या ट्यूमर अनुकूलन प्रभाव, बढ़ाना कर सकते हैं, जो मस्तिष्क के साथ विकसित कर रहा है ट्यूमर विकास । इसका मतलब यह है कि इस प्रक्रिया immunotherapeutic इंजेक्शन की छोटी मात्रा की आवश्यकता है । यह मुद्दा पशु प्रयोगात्मक मॉडलों में और भी अधिक महत्वपूर्ण है जिसमें ब्रेन ट्यूमर शल्य चिकित्सा उत्पाद नहीं किया जा सकता है । यह आलेख तैयारी के लिए एक चिकित्सीय दृष्टिकोण का वर्णन करता है और ब्रेन ट्यूमर-विशिष्ट सेलुलर प्रभाव के स्थानीय वितरण, allogeneic मानव टी लिम्फोसाइटों के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन (एस) पर आधारित है ।

यह अध्ययन तैयार करने और मानव immunodeficient जीबीएम ले जाने वाले xenografts एनएसजी चूहों में allogeneic ह्यूमन vυ9vδ2 टी लिम्फोसाइटों की stereotaxic डिलिवरी से पता चलता है. इस प्रोटोकॉल के पहले चरण स्वस्थ दाताओं के PBMCs से allogeneic टी लिम्फोसाइटों बढ़ाना के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन है, एक मानक गैर विशिष्ट के ्ह्-भक्षण-IL2 उत्तेजना है कि शुद्ध प्रभाव टी लिम्फोसाइटों की बड़ी मात्रा में पैदा करता है, की अनुमति का उपयोग उनका चिकित्सीय उपयोग२३,२४. इस लेख के दूसरे चरण stereotaxic प्रशासन के दिन पर आराम टी लिम्फोसाइट निलंबन की तैयारी पर केंद्रित है । एक विशेष ध्यान इस महत्वपूर्ण कदम है कि एक उच्च सेलुलर घनत्व है कि व्यवहार्यता और चयनित प्रभाव टी लिम्फोसाइटों के समारोह को प्रभावित नहीं करना चाहिए पर रखा गया था । अंत में, vivo प्रयोगों में के बारे में, ट्यूमर कोर के भीतर प्रभाव टी लिम्फोसाइटों और उनके इंजेक्शन की तैयारी उनके प्रसार के साथ जुड़ा हुआ है, न केवल ट्यूमर के भीतर बल्कि आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों में, पर प्रकाश डाला उनके विशेष रूप से गश्त करने के लिए और आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता । महत्वपूर्ण बात, इन तैयारी और इंजेक्शन तरीकों इन टी लिम्फोसाइटों की क्षमता को बनाए रखने के मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं की एक विशिष्ट मांयता पर मस्तिष्क के भीतर सक्रिय हो । कुल मिलाकर, इन सम्मोहक विशेषताओं टी लिम्फोसाइटों की क्षमता विशेष रूप से और कुशलता से लक्ष्य को सुनिश्चित करने और गहरी घुसपैठ मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म जो25जीबीएम की एक बानगी हैं. ध्यान दें की, एक विशेष देखभाल इंजेक्शन और microsyringe को हटाने के लिए किसी भी मस्तिष्क घाव या प्रभाव सेल लीक को कम करने के दौरान लिया जाना है ।

अंत में, इस लेख allogeneic मानव विरोधी के बड़ी मात्रा में पहुंचाने के लिए एक कुशल प्रक्रिया का वर्णन ट्यूमर लिम्फोसाइटों, मानव vυ9vδ2t लिम्फोसाइटों आराम के रूप में, मस्तिष्क ट्यूमर के आसपास के भीतर । महत्वपूर्ण बात, इस चिकित्सीय प्रक्रिया प्रतिकूल प्रभाव के साथ या तो हस्तांतरित टी लिम्फोसाइटों पर नहीं है (जैसे, व्यवहार्यता, जेट) या मस्तिष्क के ऊतकों पर । प्राथमिक मानव जीबीएम के murine orthotopic मॉडलों के आधार पर हाल के अध्ययनों से यह दर्शाया गया है कि vυ9vδ2t लिम्फोसाइटों कुशलता से जीबीएम कोशिकाओं को लक्षित करता है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं का गहरा मस्तिष्क में घुसपैठ कर लिया है पैरेन्काइमा9,11। इन तत्वों उपंयास adopter टी लिम्फोसाइटों हस्तांतरण प्रक्रियाओं है कि चूहों में पहले उदाहरण में लागू किया जा सकता है orthotopic ब्रेन ट्यूमर ले जाने के विकास के लिए अवसर खुला है और, तो, जीबीएम रोगियों में नैदानिक अध्ययन में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने पशुपालन और देखभाल के लिए नांत के विश्वविद्यालय अस्पताल पशु सुविधा (ूते) के कर्मचारियों, इमेजिंग के लिए नांत विश्वविद्यालय (MicroPICell) की सेलुलर और tissular इमेजिंग कोर सुविधा, और Cytometry सुविधा (Cytocell) नांत से धन्यवाद उनके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए. यह काम INSERM, CNRS, विश्विद्यालय डी नांत, institute नेशनल ड्यूल कैंसर (इंका # PLBio2014-155), Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer (ओ. सी. २०१७), और यूरोपियन कंसोर्टियम एरा-नेट Transcan2 (Immunoglio) द्वारा वित्त पोषित किया गया. टीम के शौकीनों ने पैसा ला सभ्य मेडिकल (DEQ20170839118) डाल दिया है । यह काम LabEX इगो और इहु-Cesti कार्यक्रमों के संदर्भ में महसूस किया गया, जो क्रमशः राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी Investissements d'Avenir द्वारा समर्थित कार्यक्रमों ANR-11-LABX-0016-01 और ANR-10-IBHU-005 के माध्यम से है । इहु-Cesti परियोजना भी नांत Metropole द्वारा समर्थित है और डी ला लॉयर क्षेत्र देता है । लेखक पांडुलिपि को सही करने में मदद प्रदान करने के लिए Chirine रफिया धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBMCs from 3 different healthy donors
BLCLs from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) Gibco 31870-025
FCS Dutscher S1810-500
L-glutamine Gibco 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
IL-2 Novartis proleukin
PHA-L Sigma L4144
Stereotaxic frame Stoelting Co. 51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame   Stoelting Co. 51624
microsyringe pump injector  WPI UMP3-4
NanoFil Syringe WPI NF34BV-2
NSG mice Charles River NSGSSFE07S
Ketamine Merial Imalgène 1000
Xylazine Bayer Rompur 2%
Scissors WPI 201758
Forceps WPI 501215
OmniDrill 115/230V WPI 503598
Vicryl 4-0 Ethicon VCP397H
Xylocaine Astrazeneca 3634461

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References

  1. Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
  2. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
  3. Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
  4. Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
  5. Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
  6. Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
  7. Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
  8. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  9. Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
  10. Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
  11. Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
  12. Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
  13. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
  14. Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
  15. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  16. Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
  17. Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
  18. Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
  19. Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
  20. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  21. Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
  22. Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
  23. Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
  24. Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).

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इम्यूनोलॉजी तथा संक्रमण अंक १३९ कर्क ग्लियोब्लास्टोमा immunotherapy दत्तक हस्तान्तरण stereotaxy लिम्फोसाइटों
Orthotopic मानव ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी Xenografts के Murine मॉडलों में साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का स्टीरियोटैक्टिक दत्तक अंतरण
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Jarry, U., Joalland, N., Chauvin, C., Clemenceau, B., Pecqueur, C., Scotet, E. Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts. J. Vis. Exp. (139), e57870, doi:10.3791/57870 (2018).

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