Summary
本文详细介绍了荧光融合蛋白在小鼠骨髓树突状细胞和巨噬细胞中的表达。该方法以骨髓祖细胞转导为基础, 采用逆转录病毒构造, 然后在体外分化成巨噬和树突状体细胞。
Abstract
树突状细胞和巨噬细胞是形成防御病原体的第一道防线的关键单元。它们也在启动自适应免疫反应中发挥重要作用。与这些细胞的实验工作是相当困难的。它们在器官和组织中的丰度相对较低。因此, 它们不能被大量隔离。它们也很难与 cDNA 构造转染。在小鼠模型中, 这些问题可以部分克服由骨髓祖细胞存在的细胞或 GM 脑脊液的树突状干细胞的体外分化。这样, 就可以从很少的动物那里获得大量这些细胞。此外, 骨髓祖细胞可以转导与逆转录病毒载体, 在其分化为骨髓衍生树突状干细胞和巨噬细胞之前, 在早期培养阶段进行 cDNA 构造。因此, 逆转录病毒转导后的体外分化可用于表达这些细胞中的各种 cDNA 结构。表达异位蛋白的能力大大扩展了可在这些细胞上进行的实验范围, 包括荧光蛋白的活细胞成像、路特分析的串联纯化、结构-功能分析、利用生物传感器和其他许多功能监测蜂窝细胞的机能。在本文中, 我们描述了一个详细的协议的逆转录病毒转导的小鼠骨髓衍生树突状细胞和巨噬细胞与载体编码的荧光标记蛋白。以两个适配器蛋白、OPAL1 和 PSTPIP2 为例, 说明其在流式细胞仪和显微术中的实际应用。我们还讨论了这种方法的优点和局限性。
Introduction
髓细胞是我们抵御病原体的防御机制不可或缺的一部分。他们能够迅速消除微生物, 以及垂死的细胞。此外, 他们还参与调节组织的发展和修复, 并保持稳态1,2,3。所有髓细胞均与骨髓中的常见髓内祖先分化。它们在许多功能和形态上不同的子集的分化是在很大程度上由细胞因子和它们的各种组合控制4。最深入研究的髓细胞亚群包括中性粒细胞粒细胞、巨细胞和树突状体细胞。任何这些人群中的缺陷会导致潜在的危及生命的后果, 并导致人类和小鼠免疫系统的严重功能失调1,2,3,5,6。
与中性粒细胞粒细胞不同的是, 树突状体细胞和巨噬细胞是组织的驻留单元, 免疫器官的丰度相对较低。因此, 在需要大量这些细胞的实验中, 分离和纯化原代树突状细胞和巨细胞是昂贵的, 而且往往是不可能的。为了解决这一问题, 已经开发出了一种在体外获得大量同质巨噬细胞或树突胞的实验方案。这些方法的基础是在细胞因子存在下的小鼠骨髓细胞分化: 巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF) 用于巨噬细胞和粒细胞-巨噬 Flt3 集落刺激因子 (GM-csf) 或树突状细胞7,8,9,10,11,12。这种方法产生的细胞通常在文献中描述为骨髓衍生巨噬细胞 (BMDMs) 和骨髓衍生树突状细胞 (BMDCs)。它们与原生巨噬细胞或树突状干细胞的共同生理特性高于相应的细胞系。另一个主要优势是获得这些细胞形成转基因小鼠13的可能性。从转基因小鼠中提取的野生型细胞和细胞之间的比较研究对于揭示基因或感兴趣的蛋白质的新功能通常是至关重要的。
在活细胞中蛋白质的亚细胞定位分析需要荧光标签与体内感兴趣的蛋白质的耦合。这通常是通过表达由分析的蛋白质耦合 (通常通过短链接器) 与荧光蛋白 (例如, 绿色荧光蛋白 (GFP))14、15的基因编码的融合结构来实现的。,16. 荧光标记蛋白在树突状细胞或巨噬细胞中的表达具有挑战性。这些细胞通常难以转染的标准转染程序和效率往往是非常低的。此外, 转染是瞬态的, 它产生细胞应力和达到的荧光强度可能不足以显微镜17。为了获得足够的转基因表达水平的这些细胞的合理分数, 骨髓祖细胞与逆转录病毒载体的感染及其随后的分化成 BMDMs 或 BMDCs 已成为一个非常有效的方法。它允许对其原生细胞环境中的髓样蛋白进行分析, 无论是在稳态还是在对免疫反应至关重要的过程中, 如吞噬、免疫突触形成或迁移。在这里, 我们描述一个协议, 允许在小鼠骨髓巨噬细胞和树突状细胞中稳定表达荧光标记蛋白的兴趣。
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Protocol
这里描述的所有方法都是由分子遗传学研究所的实验动物福利问题专家委员会和捷克共和国科学院批准的。
1. 试剂制备
- 制备氯化铵-钾 (ACK) 缓冲液。添加 4.145 g 的 NH4Cl 和 0.5 g 的 KHCO3到500毫升的 ddH2O, 然后添加100µL 的 0.5 M 乙酸酸 (EDTA) 和过滤消毒。
- 准备聚乙烯亚胺 (PEI) 解决方案。加入0.1 克 PEI 到90毫升的 ddH2O。搅拌时, 在 pH 值低于2.0 时, 加1米的盐酸滴。搅拌高达3小时, 直到 PEI 溶解, 然后调整 pH 值7.2 与1米氢氧化钠。使用 ddH2O 调节音量至 100 mL, 并进行过滤灭菌。使等份毫升和存储在-20 摄氏度。
注意: 解冻后, PEI 可以储存在4摄氏度长达2周, 但不应重新冻结。 - 准备细胞培养上清液含有脑脊液或 GM 脑脊液。这些上清液可以提前进行, 储存在-80 摄氏度。为了使这些上清液, 在杜尔贝科改良的老鹰培养基 (DMEM) 中, 用10% 胎牛血清 (FBS) 到汇流, 在 10 cm 培养皿中生长细胞因子生成细胞 (J558 18或 CMG 14-12 细胞为 M CSF 19) 的细胞。然后在 T150 组织培养烧瓶和培养中将所有细胞转移至200毫升培养基, 增加4天, 5% CO2/37 摄氏度。收集上清液, 过滤超过0.2 µm 灭菌过滤器。使等份和存储这些在-80 摄氏度。
- 准备100毫升细胞培养培养基: DMEM 补充10% 热灭活的 FBS 和细胞培养上清液从分泌 GM 脑脊液 (BMDC 分化) 或 M 脑脊液 (BMDM 分化) 的细胞。
注意: 这些上清液中的细胞因子数量可能不同, 工作浓度必须经过经验测定。通常, 2–3% 上清从产生 GM 脑脊液的细胞系 (建议的起始浓度为 2%) 或5–10% 从产生 M CSF 的 CMG 14–12细胞 (推荐的起始浓度为 10%) 的上清液。或者, 在 10 ng/毫升的纯化商业可用的 M csf 和 GM 脑脊液在 20 ng/毫升可以使用与细胞因子的结果几乎相同的上清液, i. e., 不影响分化率, 感染效率EGFP 标记构造的亚细胞定位。抗生素, 包括青霉素 G (100 IU/毫升), 链霉素 (100 µg/毫升), 和庆大霉素 (40 µg/毫升), 可用于细胞培养在协议的任何步骤, 除非另有说明。
2. 逆转录病毒的生产
警告: 尽管与其他类型的病毒载体相比, 逆转录病毒载体相对安全, 但它们仍然会带来潜在的安全隐患。因此, 至关重要的是要与最谨慎和适当的保护设备, 并遵守所有的安全法规和法律要求, 与病毒颗粒的工作。
- 在 10 cm 培养皿中, 将铂-Eco (平板 E) 包装细胞的单细胞悬浮液板培养成15毫升的 DMEM, 含有10% 的 FBS, 直到 50-60% 汇合 (24 h)。细胞应在单层中生长, 不应在培养中形成块状。
- 移液器20µg 的反转录病毒构造 (g., 表达荧光标记的蛋白质的 pMSCV 载体的利益) 和10µg 的 pCL-生态包装载体20到1毫升 DMEM (没有血清和抗生素) 和轻轻混合。
- 第二管, 添加75µL 的 PEI 在1毫升的 DMEM (没有血清和抗生素)。在室温下孵育5分钟, 然后将两根管子的内容混合在一起, 孵育10分钟。
注意: 添加 pCL-Eco 是可选的。它是编码的 ecotropic 病毒受体, 并可能增加病毒滴度。 - 用8毫升新鲜 DMEMsupplemented 2% 牛胎, 小心地将培养基替换在平板 E 细胞上。使用前预热介质至37摄氏度。在转染过程中不要使用抗生素, 因为抗生素可能会降低转染效率。
- 小心地添加 (滴) 在步骤2.3 中制备的在平板 E 细胞的混合物, 并孵育 4 h 在37摄氏度。
- 孵育后, 将培养基在平板 E 细胞上交换10毫升预热 DMEM 含有 10% FBS, 并培养细胞 24 h 在37摄氏度。在这种孵化过程中, 平板细胞会在培养基中产生病毒。
- 24小时后, 使用5毫升移液器从铂 Eco 细胞中提取含有逆转录病毒颗粒的培养基, 并将其转移到15毫升离心管 (= "上清 1", 含有 ecotropic 逆转录病毒颗粒)。
- 为了避免病毒上清液中的平板细胞污染, 在4摄氏度下, 将收集到的病毒在 1250 x g 处旋转5分钟。为获得最佳效果, 应立即使用该病毒进行感染。
注意: 等份的病毒也可以存储在-80 摄氏度, 供以后使用。然而, 它将导致一定程度上降低转导效率。避免重复冻结/解冻病毒, 因为它会导致病毒降解。 - 添加10毫升预热 DMEM 与10% 牛胎细胞和培养24小时37摄氏度。
- 重复步骤2.7。和2.8。获得 "上清 2"。
3. 小鼠骨髓细胞分离
- 用颈椎脱位或其他经批准的方法牺牲鼠标。用70% 乙醇喷洒鼠标。
- 使用镊子和剪刀, 去除皮肤, 以及从后腿的部分肌肉。小心地从髋关节中取出髋臼而不折断股骨。在脚踝关节上割下爪子。使用70% 乙醇将骨骼 (股骨连接到胫骨) 喷洒, 并用纸巾去除其余肌肉。
- 将骨骼放置在 5 cm 培养皿中, 其中含有 2% FBS (pbs) 的无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。 如果准备更多的骨头, 保持培养皿在冰上, 直到处理。
- 为确保培养不孕, 请在组织培养罩中执行以下步骤。
- 将股骨与胫骨分开而不折断骨头末端 (膝盖关节弯曲, 用剪刀小心切割)。
- 一个一个的处理骨头。用剪刀把骨头夹在镊子上, 切掉骨骺的一个很小的部分 (大约是厘米毫米)。
- 使用 30 G 针和2或5毫升注射器填充 PBS-FBS 将骨髓细胞从骨头的两端冲洗成15毫升离心管。在冲洗过程中将针头移入骨骼内, 以移除所有细胞。如果针头堵塞, 改变它。
注: 冲洗时骨骼应从红色变为白色。这表明大部分细胞被从骨头中移除。每骨使用大约一毫升的 PBS-FBS。 - 离心细胞在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。
- 在室温下, 通过在2.5 毫升的 ACK 缓冲液中重悬颗粒, 丢弃上清液并裂解红细胞。在裂解过程中, 通过100微米细胞过滤器将骨髓细胞过滤成新鲜的15毫升中线管。通过添加12毫升 PBS-FBS 还原张力。
注意: 不要超过5分钟的低渗裂解与 ACK 缓冲液, 以避免细胞死亡。 - 在 500 x g 处立即离心5分钟, 4 摄氏度。
4. 骨髓细胞分化为骨髓源性巨噬细胞
- 在 DMEM 中重悬骨髓细胞颗粒, 辅以10% 的 FBS 和抗生素 (参见步骤1.4 后的说明) 并计数细胞。为分化成 BM 衍生巨噬细胞, 板 5–10 x 106的骨髓细胞在10厘米非组织培养处理 (细菌) 培养皿与10毫升预制备 DMEM 培养基与血清和 M 脑脊液从步骤1.4。
注: 骨髓细胞的产量是大约 4 x 107每6–8周老 C57BL/6J 鼠标。 - 在细胞培养孵化器中孵育细胞3天, 5% CO2, 37 摄氏度。
注意: 在前2天, 细胞看起来并不十分重要, 因为大量的凋亡细胞存在 (细胞无法分化成髓细胞和晚期分化细胞)。 - 3天后, 骨髓细胞培养开始看起来至关重要, 分裂细胞的簇形成。第一个贴壁细胞已经可以观察到了。此时, 用新鲜的细胞因子培养基补充细胞。
- 添加10毫升预热 DMEM 培养基与血清和 M 脑脊液 (从步骤 1.4) 到每10厘米培养皿和返回它在细胞培养孵化器。在此步骤中, 无需删除旧媒体。
注: 骨髓巨噬细胞在培养后的几天内完全分化。收获的最佳时间是在白天 6–8, 其中大部分细胞附着, 培养皿完全覆盖。 - 在5天, 把培养皿放入细胞培养罩中, 倾斜盘子, 直到介质接近盘子的边缘。小心地从边缘附近的表面取出15毫升的培养基, 细胞往往留在盘子中间。用 M CSF 添加相同体积的预热培养基, 然后将盘子放回孵化器。
注意: 如果媒体缓慢而仔细地吸气, 几乎没有细胞丢失。但是, 也可以离心吸气介质并将细胞添加回培养基中, 以确保无附着 (i. e.、不完全分化的) 细胞丢失。 - 对于实验, 只使用贴壁细胞 (巨细胞)。要收割细胞, 请在6或7天删除所有媒体和浮动单元格。使用预热的 PBS, 无需血清, 一次洗盘子。
- 在 PBS 中加入5毫升 0.02% EDTA, 在组织培养培养箱中孵育37摄氏度的 1°c min。
- 使用5毫升移液器, 用 pbs-EDTA 流去除盘子中的细胞, 将它们放在50毫升离心管中, 25 毫升 pbs。如果需要, 请将更多的菜肴汇集在一起。
- 在 500 x g 处立即离心5分钟, 4 摄氏度。
- 在 DMEM 介质中重悬巨噬细胞颗粒并计数细胞。通过流式细胞仪验证巨噬细胞表面分化标志物 (CD11b 和 F4/80) 的表达。
- 对于要求细胞悬浮的实验, 例如, 流式细胞术实验、qPCR 或西方印迹分析, 直接使用巨噬细胞。对于粘附巨噬细胞的实验, 根据实验设置将组织培养板中的细胞板。
- 细胞已经完全分化。将它们保存在适合于预期实验的培养基中, 或在原始生长和分化培养基中使用。
注意: 在使用贴壁巨噬细胞时, 至少在6小时前将它们转移到新的盘子中 (理想情况下过夜), 以允许对新表面进行完全粘合。在实验前, 可以去除漂浮细胞的小部分。
5. 骨髓细胞分化为骨髓衍生树突状细胞
- 遵循 BMDMs 的协议, 在步骤5.2–5.4 中对 BMDCs 进行特定的调整。
- 用10% 个 FBS 和抗生素重悬 DMEMsupplemented 骨髓细胞获得的颗粒, 并计数细胞 (通过执行4.1 巨噬细胞协议)。对于分化成树突状细胞, 板 1–1.5 x 107骨髓细胞在10厘米非组织培养处理 (细菌) 培养皿10毫升预制备 DMEM 培养基与血清和 GM 脑脊液 (从步骤 1.4.)。
- 遵循与 BMDM 协议 (巨噬细胞协议步骤 4.3–4.5) 相同的栽培步骤。使用 DMEM 培养基与血清和 GM 脑脊液而不是 M 脑脊液。由于 BMDCs 的培养时间较长 (通常为10–12天), 在3天的时间间隔内添加额外的喂食 (通过移除上清和添加新的栽培培养基, 如步骤4.5 所述)。
- 协议的这一部分与巨噬细胞协议的相应部分 (巨噬细胞协议的步骤 4.6–4.12) 几乎相同。实验只使用贴壁细胞。在10-12 天, 收集细胞使用 EDTA, 计数, 并在新的表面上板。通过流式细胞仪验证树突状细胞 (CD11c+、CD11b+、F4/80) 表面分化标志物的表达。
6. BMDMs 和 BMDCs 表达感兴趣的 EGFP 标记蛋白的生产
- 重悬在步骤3.10 中获得的骨髓细胞的颗粒。在 DMEM 补充 10% FBS 和抗生素和计数细胞。对于感染, 使用 2–5 x 106的 BM 细胞每井6孔组织培养处理板。
- 将1毫升制备的 DMEM 培养基中的细胞板, 辅以 M CSF 分化成 BMDMs 或与 GM 脑脊液进行分化, BMDCs. 在 5% CO2在37摄氏度的组织培养孵化器中保持细胞 4–6 h。
- 添加2毫升新鲜收集的病毒 ("上清 1") 补充与凝聚胺 (12 µg/毫升, 最终浓度8µg/毫升除了细胞)。
注: 还可以使用含有病毒的上清液的冷冻等分, 但功效会降低。 - 在30摄氏度 (缓慢加速和减速) 下, 将板在 1250 x g 处离心90分钟。然后, 孵育4小时, 5% CO2在37摄氏度。
- 可选: 用含有相应细胞因子 (M CSF 或 GM 脑脊液) 和培养的新鲜培养基取代2毫升培养基, 5% CO2在37摄氏度。在第二天, 删除2毫升培养基和重复整个感染程序 (步骤 6.3–6.4) 与2毫升新鲜收集的病毒 ("上清 2")。
注意: 此步骤可能会增加感染效果。第二次感染后的改善取决于细胞类型和靶蛋白, 在我们的经验可以从30% 提高效率, 根本没有改善。 - 收集非贴壁细胞, 转移到15毫升离心管, 并在 500 x g 旋转5分钟 (4 摄氏度)。丢弃上清液。
- 在10毫升的培养基中用 M CSF 或 GM 脑脊液重悬细胞颗粒, 将细胞放入 10 cm 非组织培养皿中, 培养37摄氏度, 5% CO2。10 cm 皿的最佳细胞数是 5–10 x 106用于 bm 衍生巨噬细胞和 10–15 x 106用于 bm 衍生的树突状单元。
注意: 可以使用较小的盘子或盘子, 但必须相应调整细胞数。 - 遵循步骤4和5中描述的巨噬细胞和树突状体细胞培养和分化协议。
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Representative Results
信号适配器蛋白通常是小蛋白质, 没有任何酶活性。它们具有各种相互作用的领域或图案, 它调解与信号传导相关的其他蛋白质的结合, 包括酪氨酸激酶、磷酸酶、泛素连接酶等21。为演示此协议的功能骨髓细胞适配器 PSTPIP2 和 OPAL1 被选择。PSTPIP2 是一个很好的特征蛋白参与炎症反应的调节22。它是一种细胞质蛋白, 也可以通过其 F bar 域被招募到蜂窝细胞膜。第二种蛋白质是跨膜适配器 OPAL1, 预计与蜂窝细胞膜相关。其生理功能尚不清楚。然而, 在急性淋巴细胞白血病, OPAL1 的表达与更好的预后23。
cdna 构造编码的 PSTPIP2 或 OPAL1 融合通过一个短链接器 (GSGGGS 或基因标记, 分别) 到 EGFP 在 C 末端被克隆到 pMSCV 逆转录病毒载体使用的标准方法 cDNA 克隆。然后将此结构转染到平板细胞和包装载体 pCL-Eco。结果上清液包含逆转录病毒用于骨髓细胞转导, 其次是分化为 BMDMs 和 BMDCs。通过流式细胞术在第二个含病毒的上清液的采集后, 评价了平板转染的效果。平均转染效率为 PSTPIP2-EGFP 的 62%, 53% 用于 OPAL1, 结果高度可重现性 (图 1A, B)。OPAL1 结构对平板细胞的毒性似乎更重 (通过培养中漂浮/垂死细胞的外观进行评估), 从而降低了转染细胞的百分比。
采用流式细胞仪对骨髓衍生巨噬细胞和树突状干细胞 (转导与 PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 逆转录病毒结构) 的分化状况进行了评价。成熟巨噬细胞种群由 CD11b 和 F4/80 表达, 而树突状细胞表达 CD11c 谱系标记。在这两种类型的培养中, 超过90% 的细胞对各自的标记都是阳性的 (图 2A, B)。最后, 通过对 EGFP 荧光的简单流式细胞仪测量, 确定了 BMDMs 和 BMDCs 中 PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 构造的表达水平。EGFP 阳性巨噬细胞的平均百分率为 PSTPIP2-EGFP 的 71%, OPAL1-EGFP 为 62% (图 3A)。在树突状细胞的情况下, 效率较低, 32% 为 PSTPIP2 和 9% OPAL1 (图 3B)。多次实验结果证明了该方法的重现性 (图 3C)。
我们通常不确定我们在感染中使用的上清液中的病毒浓度。我们更喜欢使用病毒上清液新鲜, 立即收集后, 而病毒的滴定度测定需要三天额外。因此, 病毒滴度的信息只能通过post 获得.但是, 在解决技术问题和问题时, 它仍然是有用的。为了评估用 PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 结构转染的平板 E 细胞上清液中的病毒浓度, 我们用序列稀释的含有病毒的上清液从这些转染的平台 e 细胞中孵育 NIH-3T3 细胞, 并确定的病毒滴度完全按照 Zjablovskaja et al在以前发表的朱庇特文章24所述。在三个独立实验中, 病毒的效价范围从 1.1 x 106到 4.4 x 106 TU/毫升不等。我们没有观察到 PSTPIP1-EGFP 和 OPAL1-EGFP 构造之间以及上清液从1天到2天之间的任何实质性差异。当这些上清液用于骨髓细胞感染根据我们在本文中描述的协议, 感染的多样性 (MOI) 从1.1 到4.4 不等。有趣的是, 在这个范围内, 我们没有观察到 MOI 和感染效率之间的任何相关性。
在图 4中, 在 BMDMs 和 BMDCs 中表达的 PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 通过共聚焦显微镜进行可视化。完全分化的巨噬细胞和树突状体细胞具有特征形状。从小的圆形祖细胞到不规则形状的大细胞的形态学变化证实了成功的分化。在巨噬细胞中, PSTPIP2 是细胞质, 在等离子膜上局部定位。OPAL1 似乎也部分靶向等离子膜。其余的可能与细胞内膜, 如中质网和高尔基体复合物。但是, 要确认此本地化, 必须使用特定的细胞器标记。在树突状细胞中, 膜定位不明显。
图 1: E 细胞转染的效率.对于平板 E 细胞的转染, 将编码适配器蛋白 PSTPIP2 和 OPAL1 与 EGFP (PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP) 融合的两种结构克隆到 pMSCV 向量中。进行了标准的 PEI 转染。在第二个病毒上清液采集后, 利用平板细胞流式细胞仪对转染效果进行评价。(A) 代表流式细胞仪图解。(B) 图显示四个独立实验的结果。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 评估 BMDMs (A) 和 BMDCs (B) 的分化状况.采用流式细胞术在8天的培养中测定特定巨噬细胞和树突状细胞谱系标记的表面表达。根据 Hoechst 33258 的侧向散射特性和染色, 将死细胞封闭。结果至少代表了3个独立实验。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 表达式的评估.EGFP 荧光在 BMDMs (A) 和 BMDCs (B) retrovirally 转导与 PSTPIP2-EGFP 和 OPAL1-EGFP 构造是通过流式细胞术在8天的栽培测量。(C). 图显示了多个独立实验的结果。BMDMs 和 BMDCs 被门控如图 2所示。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 表达 PSTPIP2 或 OPAL1 的巨噬细胞和树突状体细胞的代表性图像.BMDMs (A) 和 BMDCs (B) 表达 PSTPIP2 和 OPAL1 通过实时成像共聚焦显微镜可视化。EGFP 荧光绿色显示在每个面板的左侧, 右侧明亮的字段图像。缩放栏 = 10 µm。结果至少代表了三个独立实验。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
目标细胞中蛋白质的表达是许多生物研究的关键步骤。通过标准转染和逆转录病毒转导技术很难转染分化的巨噬细胞和树突状单元。绕过这些分化细胞的转染骨髓祖的逆转录病毒转导, 其次是分化时, 他们已经携带所需的结构, 是一个关键步骤, 允许在这些 cDNAs 的表达单元格类型。成功使用此方法的一个例子可以在我们最近的出版物25中找到。在这里, 我们提供了一个经济高效的协议, 以实现在骨髓衍生树突状细胞和巨噬细胞的选择结构的稳定表达使用这种方法。我们提出的程序相对便宜, 简单, 但提供了很好的结果。即使在相对限制性的预算下, 本协议中使用的试剂也允许其例行使用。用于转染的协议使用 PEI 作为转染试剂。与其他化学转染剂相比, PEI 的成本非常低, 而其效率与大多数其他广泛使用的化合物相似。然而, PEI 可以替换与许多不同的商业可用转染试剂在这一步, 没有任何效率的损失。作为指导原则, 已知与常用 HEK293 细胞一起工作的转染协议通常也能很好地与平板 E 细胞一起使用。另一种经济有效的措施是利用含有细胞因子的上清液代替纯化的重组细胞因子。使用这些上清液需要进行一些优化。然而, 当建立并遵循标准协议时, 这些上清液的单个批次之间的变异性变得非常低, 通常不需要改变个体批次之间的工作浓度。与这些上清液的 BMDM 和 BMDC 分化的效率, 在我们的经验, 与纯化的细胞因子相同。
除逆转录病毒转导外, 还存在其他成熟的哺乳动物细胞转染方法, 包括化学转染 (通常使用阳离子脂或阳离子聚合物形成与 DNA 配合物)、电穿孔和使用其他类型的病毒载体, 主要是腺病毒和慢病毒系统26,27,28,29,30。虽然以腺病毒为基础的基因传递可以达到很高的滴度和效率, 但是制备相应的质粒和病毒颗粒比在逆转录病毒系统29的情况下更加困难和耗时。另外, 腺病毒引起的树突状细胞和巨噬细胞29、31、32的炎症反应, 并为小鼠造血细胞携带转基因鼠的最佳性能腺病毒受体需要33。另一方面, 携带感兴趣基因的慢病毒粒子的生成是一个相对简单的过程, 几乎与用于逆转录病毒的一种方法完全相同。与本协议中使用的 ecotropic 逆转录病毒载体相反, 慢病毒能够感染多种物种的非增殖细胞, 包括人类34。这可能是在特定实验条件下的一个重要优势。但是, 此功能也极大地损害了这些矢量的安全性。我们认为, BMDMs 和 BMDCs 的基因传递, 逆转录病毒提供效率、安全性和易用性的最佳平衡。使用简单的标准分子克隆技术可以很容易地制备逆转录病毒 DNA 结构。病毒是通过将细胞系直接包装到培养上清液而产生的, 而且通常不需要进一步的病毒纯化。Ecotropic 逆转录病毒也不容易感染人类细胞, 这使得他们的使用相对安全。然而, 也有一些与使用逆转录病毒载体相关的一般缺点。主要的限制因素是这些病毒只感染增殖细胞35。此功能不会显著影响此处描述的协议, 但它限制了可以使用逆转录病毒载体的应用范围。可以克隆到这些载体的兴趣基因的大小也有限, 并且随着刀片尺寸的增加, 病毒颗粒滴度降低。使用 pMSCV 向量, 我们通常开始看到插入大小的影响在大约 3 kbp。随着刀片尺寸的进一步增加, 感染效率逐渐下降。
化学转染和电穿孔比任何基于病毒的程序26、27、28、30更易于使用、安全且耗时更短。然而, 在 BMDMs 和 BMDCs, 他们可以刺激对外国核酸31的反应, 它们产生更多的细胞压力。此外, 一些化学转染试剂增加细胞自动荧光, 可能干扰流式细胞术或显微分析。由于表达的瞬态性, 它们只能用于成熟的分化 BMDMs 或 BMDCs。相比之下, 用逆转录病毒载体引入的序列被永久地集成到目标细胞的基因组中, 并允许稳定持久的表达式与微分协议34的时间尺度兼容,35. 然而, 此功能也增加了插入诱变的风险。由于矢量积分的相对随机性, 其对大细胞种群的影响是有限的。但是, 它们可能在单个单元格的级别可见。当从反转录病毒载体表达的结构影响树突状细胞或巨细胞分化时, 可能会出现其他问题, 从而导致无法从受感染的祖先产生分化的 BMDMs 或 BMDCs。在某种程度上, 这可能是通过调整感染条件来实现低表达水平 (例如, 通过降低病毒滴度) 或通过使用诱导表达系统来克服的。使用 EGFP 融合到感兴趣的蛋白质或作为一个记者也允许排序的细胞与表达水平对应的实验目标和限制。最后, 我们还应该提到所有转染/转导程序共有的问题。这些主要包括过度表达的文物, 如蛋白质错误折叠, mislocalization 和毒性36。蛋白质毒性可能是 OPAL1 相对难表达的原因。它的例子清楚地表明, 表达的蛋白质的性质可以大大影响这种方法的有效性。然而, 尽管如此, 我们能够获得足够数量的 OPAL1-EGFP 表达细胞进行显微分析与这种方法, 证明它的用处, 即使在处理困难的目标。此外, 如果特定应用需要, 可以通过流化排序来增加转导细胞的百分比。通过使用各种方法或现成的试剂盒增加病毒颗粒浓度, 也可以部分克服低感染效率。在我们手中, 在 100 kDa 的分子量切断的离心过滤器上的病毒上清液的超滤已经证明可以在效率和所需的努力之间实现最佳平衡。
骨髓源性巨噬细胞和树突状干细胞是吞噬细胞免疫学中广泛使用的工具。它们比可用的细胞系更具有生理上的相关性。它们的生成数量相对较高, 同时也缺乏细胞系的遗传异质性和不稳定性特征。另一个好处是, 它们可以由转基因小鼠产生, 研究基因修饰对相对丰富和均匀细胞种群的影响。这在生物化学研究中特别有用, 在那里通常需要相当大数量的细胞。利用 cDNA 构造传感器这些细胞的能力, 为基于这些细胞遗传缺陷的重组或互补以及结构-功能分析的研究开辟了更多的可能性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了捷克科学基金会 (GACR 项目编号 16-07425S) 的支持, 由查尔斯大学赠款机构 (GAUK) (项目编号 923116) 和捷克科学院分子遗传学研究所的机构资助。共和国 (RVO 68378050)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
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