Summary
In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.
Abstract
Dendritische Zellen und Makrophagen sind wichtige Zellen, die die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger bilden. Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Initiierung einer adaptiven Immunantwort. Experimenteller Arbeit mit diesen Zellen ist sehr anspruchsvoll. Ihre Fülle in Organen und Geweben ist relativ gering. Infolgedessen können nicht sie in großer Zahl isoliert werden. Sie sind auch schwer zu transfizieren mit cDNA-Konstrukten. Im Mausmodell können diese Probleme teilweise durch in Vitro Differenzierung von Knochenmark Vorläufern im Beisein von M-CSF für Makrophagen oder GM-CSF für dendritische Zellen überwunden werden. Auf diese Weise ist es möglich, große Mengen dieser Zellen von sehr wenigen Tieren zu erhalten. Darüber hinaus können Knochenmark Stammväter mit retroviralen Vektoren tragen cDNA-Konstrukte in frühen Phasen des Anbaus vor deren Differenzierung in Knochenmark abgeleitet dendritische Zellen und Makrophagen ausgestrahlt werden. So kann retrovirale Transduktion gefolgt von in-vitro- Differenzierung verwendet werden, verschiedene cDNA-Konstrukte in diesen Zellen zum Ausdruck bringen. Die Fähigkeit, ektopische Proteine deutlich auszudrücken reicht das Verbreitungsgebiet von Experimenten, die auf diese Zellen, einschließlich live Cell Imaging von fluoreszierenden Proteinen, Tandem Reinigungen für Interaktom Analysen, Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt werden können, Überwachung der Zellfunktionen mit Biosensoren und viele andere. In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für retrovirale Transduktion von murinen Knochenmark abgeleitet dendritischen Zellen und Makrophagen mit Vektoren für Gewebekulturen getaggt Proteine codieren. Am Beispiel von zwei Adapter-Proteine, OPAL1 und PSTPIP2, zeigen wir die praktische Anwendung in Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen dieses Ansatzes.
Introduction
Myeloische Zellen sind einen unverzichtbaren Bestandteil unserer Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Sie sind in der Lage, schnell Mikroben sowie sterbenden Zellen zu beseitigen. Darüber hinaus engagieren sie sich auch bei der Regulierung der Gewebeentwicklung und Reparatur und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase1,2,3. Alle myeloische Zellen unterscheiden sich von gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark. Ihre Differenzierung in vielen funktionell und morphologisch unterschiedlichen Teilmengen ist zu einem großen Teil durch Zytokine und ihre verschiedenen Kombinationen4gesteuert. Die am intensivsten untersuchten myeloische Zelle Teilmengen sind Neutrophile Granulozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen. Mängel in keinem dieser Populationen führen zu potenziell lebensbedrohliche Konsequenzen und Ursache schweren Funktionsstörungen des Immunsystems bei Menschen und Mäusen1,2,3,5, 6.
Im Gegensatz zu Neutrophile Granulozyten dendritische Zellen und Makrophagen resident Gewebezellen und ihre Fülle im Immunsystem Organe ist relativ gering. Infolgedessen ist die Isolierung und Reinigung der primären dendritische Zellen und Makrophagen für Experimente erfordern eine große Anzahl dieser Zellen teuer und oft unmöglich. Um dieses Problem zu lösen, wurden Protokolle entwickelt, um große Mengen von homogenen Makrophagen oder dendritische Zellen in Vitrozu erhalten. Diese Ansätze basieren auf die Differenzierung der murinen Knochenmarkzellen in Anwesenheit von Zytokinen: Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für Makrophagen und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) oder Flt3 Ligand für Dendritische Zellen7,8,9,10,11,12. Zellen, die von dieser Methode generiert werden häufig in der Literatur beschrieben, wie Knochenmark Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark dendritische Zellen (BMDCs abgeleitet). Sie haben mehr physiologische Eigenschaften gemeinsam mit primären Makrophagen oder dendritische Zellen als mit entsprechenden Zell-Linien. Ein weiterer großer Vorteil ist die Möglichkeit, diese Zellen bilden genetisch veränderter Mäuse13. Vergleichende Studien zwischen Wildtyp Zellen und Zellen aus genetisch veränderten Mäusen sind oft entscheidend für die Aufdeckung neuer Funktionen von Genen oder Proteinen von Interesse.
Analyse der subzellulären Lokalisierung der Proteine in lebenden Zellen erfordert die Kopplung eines fluoreszierenden Labels an das Protein des Interesses in Vivo. Dies geschieht am häufigsten durch genetisch codierte Fusion Konstrukt bestehend aus einer analysierten Protein (oft über einen kurzen Linker) gekoppelt an ein fluoreszierendes Protein zum Ausdruck zu bringen (zB., grün fluoreszierenden Proteins (GFP))14,15 , 16. der Ausdruck Eindringmittel tagged Proteine in dendritischen Zellen oder Makrophagen ist anspruchsvoll. Diese Zellen sind in der Regel schwer zu transfizieren standard Transfektion Verfahren und die Wirkungsgrade sind in der Regel sehr gering. Darüber hinaus die Transfektion ist flüchtig, es erzeugt zellulären Stresses und erreichten Intensität der Fluoreszenz ist möglicherweise nicht ausreichend für Mikroskopie17. Erlangung einen angemessenen Bruchteil dieser Zellen mit ein ausreichendes Maß an Transgene Ausdruck, die Infektion des Knochenmarks Vorläuferzellen mit retroviralen ist Vektoren und ihre anschließende Differenzierung in BMDMs oder BMDCs eine sehr effiziente geworden Ansatz. Es darf für die Analyse der Proteine myeloischen Ursprungs in ihrer natürlichen zellulären Umgebung, in einem stabilen Zustand oder bei Prozessen, die für die Immunantwort wie Phagozytose, immunologische Synapse Bildung oder Migration entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, stabile Expression Eindringmittel tagged Proteine des Interesses an murine Knochenmark abgeleitet Makrophagen und dendritischen Zellen ermöglicht.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden durch den Sachverständigenausschuss für die Wohlfahrt der Versuchstiere des Instituts für molekulare Genetik und der Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik zugelassen.
(1) Reagenz Vorbereitung
- Bereiten Sie den Puffer Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK). 500 mL DdH2O, fügen Sie 4,145 g NH4Cl und 0,5 g KHCO3 hinzu dann fügen Sie 100 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu) und sterilisieren Sie Filter zu.
- Bereiten Sie Polyethylenimine (PEI) Lösung. 90 mL DdH2O. 0,1 g von PEI hinzufügen Fügen Sie unter Rühren 1 M HCl tropfenweise hinzu, bis der pH-Wert niedriger als 2.0 ist. Für bis zu 3 h rühren Sie PEI aufgelöst wird, und passen Sie dann pH-Wert auf 7,2 mit 1 M NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit DdH2O und sterilisieren Sie Filter zu. 1 – 2 mL Aliquote erstellen und speichern bei-20 ° C.
Hinweis: Nach dem Auftauen PEI kann bis zu 2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden aber sollte nicht wieder eingefroren werden. - Bereiten Sie Zelle Kultur Überstände mit M-CSF oder GM-CSF. Diese Überstände können im Voraus gebucht und bei-80 ° C. Um diese Überstände zu machen, wachsen Sie die Zytokin-produzierenden Zellen (J558 Zellen für GM-CSF 18 ) oder CMG 14-12 für M-CSF 19in einer 10 cm Petrischale in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) zum Zusammenfluss. Übertragen Sie dann alle Zellen auf 200 mL der Medien in T150 Gewebekultur Kolben und Kultur für weitere 4 Tage 5 % CO237 ° C. Sammeln Sie die überstand und Filter über 0,2 µm Sterilisation Filter. Aliquote erstellen und speichern Sie diese bei-80 ° C.
- 100 mL Zellkulturmedium vorbereiten: DMEM mit 10 % ergänzt Erhitzen inaktiviert FBS und Zell-Kultur Überstände aus Zellen absondert, GM-CSF (für BMDC Differenzierung) oder M-CSF (für BMDM Differenzierung).
Hinweis: Die Zytokine in diese Überstände können variieren und die Konzentration arbeiten muss empirisch ermittelt werden. In der Regel wird 2 – 3 % Überstand von Zelllinien Herstellung von GM-CSF (die empfohlene Start Konzentration beträgt 2 %) oder 5 – 10 % Überstand von CMG 14 – 12 Zellen produzieren M-CSF (die empfohlene Start Konzentration beträgt 10 %) verwendet. Alternativ gereinigt kommerziell verfügbaren M-CSF bei 10 ng/mL und GM-CSF bei 20 ng/mL kann mit verwendet werden Ergebnisse praktisch identisch mit Zytokin-haltigen Überstände, dh., ohne Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Differenzierung, Infektion Effizienz und subzelluläre Lokalisation EGFP getaggt Konstrukte. Antibiotika, einschließlich Penicillin G (100 IE/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Gentamicin (40 µg/mL), können für die Zellkultur bei jedem Schritt des Protokolls verwendet werden, sofern nicht anders angegeben.
2. Herstellung von Retrovirus
Vorsicht: Obwohl retrovirale Vektoren relativ sicher im Vergleich zu anderen Arten von viralen Vektoren sind, stellen sie noch ein potenzielles Sicherheitsrisiko. Daher ist es entscheidend, mit größter Sorgfalt und geeigneter Schutzausrüstung arbeiten und Einhaltung aller Sicherheitsvorschriften und gesetzlichen Anforderungen für die Arbeit mit viralen Partikel.
- Eine einzelne Zelle Aussetzung der Platin-Eco (Plat-E) Verpackungszellen in einer 10 cm Petrischale Platte und pflegen in 15 mL DMEM mit 10 % FBS bis 50-60 % Zusammenfluss (24 h). Zellen sollten sollten in einer Monolage wachsen und nicht Klumpen in der Kultur.
- Pipette 20 µg retrovirale Konstrukt (zB., das Konstrukt mit dem Ausdruck des Eindringmittel tagged Proteins des Interesses an der pMSCV-Vektor) und 10 µg pCL-Eco Verpackung Vektor-20 in 1 mL DMEM (ohne Serum und Antibiotika) und vorsichtig mischen.
- Eine zweite Röhre fügen Sie 75 µL PEI in 1 mL DMEM (ohne Serum und Antibiotika hinzu). Brüten Sie 5 min bei Raumtemperatur (RT) und dann mischen Sie den Inhalt beider Röhren zusammen und weitere 10 min bei RT inkubieren
Hinweis: Der Zusatz von pCL-Eco ist optional. Es ist für den Ecotropic virale Rezeptor Kodierung und der Virustiter erhöhen kann. - Ersetzen Sie sorgfältig das Medium auf Plat-E Zellen mit 8 mL frische DMEMsupplemented mit 2 % FBS. Wärmen Sie Mittel-bis 37 ° C vor dem Gebrauch vor. Verwenden Sie Antibiotika nicht während Transfection, da Antibiotika die Transfektion Effizienz verringern können.
- Sorgfältig die Mischung im Schritt 2.3 auf der Plat-E Zellen vorbereitet (in Tropfen) hinzufügen und 4 h bei 37 ° c inkubieren
- Nach der Inkubation, tauschen Sie das Medium auf Plat-E Zellen für 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % FBS, und pflegen die Zellen für 24 h bei 37 ° C. Während diese Inkubation werden Plat-E Zellen Virus in den Medien produzieren.
- Nach 24 h das Medium mit retroviralen Partikeln aus Platin Eco Zellen mit einer 5 mL-Pipette zu sammeln und überträgt es auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen (= "überstand 1" mit Ecotropic retroviralen Partikeln).
- Zur Vermeidung von Kontamination durch Plat-E Zellen in virale Überstände spin die gesammelten Virus bei 1250 × g für 5 min bei 4 ° C. Die besten Ergebnisse zu erzielen sollte das Virus sofort für Infektion verwendet werden.
Hinweis: Aliquote des Virus können auch bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Jedoch wird es in bestimmten Reduktion Transduktion Effizienz führen. Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren/Auftauen des Virus, da es zu einer Verschlechterung der Virus führt. - Fügen Sie 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % FBS zu Plat-E Zellen und pflegen für ein weiteres 24 h bei 37 ° C.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7. und 2.8. "überstand 2" zu erhalten.
(3) murinen Knochenmark Zelle isoliert
- Die Maus mit zervikale Dislokation oder andere anerkannte Methode zu opfern. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol.
- Mit Pinzetten und Scheren der Haut als auch Teil der Muskeln von Hinterbeinen entfernen. Sorgfältig zu verdrängen die Hüftpfanne vom Hüftgelenk ohne den Oberschenkelknochen. Schneiden Sie die Pfote des Sprunggelenks. Sprühen Sie die Knochen (Femur, Tibia verbunden) mit 70 % Ethanol und entfernen Sie den Rest der Muskeln mit einem Papiertuch.
- Legen Sie die Knochen in einer 5 cm Petrischale mit sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS (PBS-FBS). Wenn mehr Knochen vorbereiten, halten die Petrischale auf Eis bis verarbeitet.
- Zur Sicherung Anbau Sterilität, führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Kapuze.
- Trennen Sie den Oberschenkelknochen aus der Tibia ohne die Knochenenden (Biegung im Knie Gelenk- und sorgfältig mit der Schere geschnitten).
- Verarbeiten Sie die Knochen eins nach dem anderen. Ein sehr kleiner Teil der Epiphysen (ca. 1 – 2 mm) halten Sie die Knochen in einer Pinzette mit einer Schere abgeschnitten.
- Verwenden Sie ein 30 G-Nadel und eine 2 oder 5 mL Spritze mit PBS-FBS, die Knochenmarkzellen von beiden Enden des Knochens in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen zu spülen. Bewegen Sie die Nadel im Knocheninneren während des Spülvorgangs um alle Zellen zu entfernen. Wenn die Nadel verstopft, ändern.
Hinweis: Knochen sollte von rot zu weiß während des Spülvorgangs schalten. Dies bedeutet, dass die Mehrheit der Zellen aus dem Knochen entfernt wurden. Verwenden Sie ca. 2 – 3 mL PBS-FBS pro Knochen. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Den Überstand verwerfen und lyse der roten Blutkörperchen durch das Pellet in 2,5 mL ACK Puffer für 2 – 3 min. bei Raumtemperatur resuspending. Während die Lyse filtern Sie die Knochenmarkzellen durch ein Sieb 100 μm Zelle in ein frisches 15 mL Centrifug Rohr. Wiederherstellen Sie die Spannkraft durch das Hinzufügen von 12 mL PBS-FBS.
Hinweis: Überschreiten Sie 5 min der hypotone Lyse mit ACK-Puffer zu Zelltod nicht. - Zentrifugieren Sie sofort bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
(4) Knochenmark Zelldifferenzierung in Knochenmark abgeleitet Makrophagen
- Aufschwemmen der Pellets von Knochenmarkzellen in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika ergänzt (siehe Hinweis nach Schritt 1.4. für antibiotische Konzentration) und die Zellen zu zählen. Differenzierung in BM Makrophagen abgeleitet, Platte 5 – 10 x 106 Knochenmark Zellen in einer 10 cm nicht-Gewebekultur (bakterielle) Petrischale mit 10 mL der vorbereiteten DMEM Medien mit Serum und M-CSF aus Schritt 1.4 behandelt.
Hinweis: Die Ausbeute an den Knochenmarkzellen beträgt ca. 4 x 107 pro 6 – 8 Wochen-alte C57BL/6J Maus. - Inkubieren Sie die Zellen in Zelle Kultur Inkubator für 3 Tage bei 5 % CO2, 37 ° c
Hinweis: In den ersten 2 Tagen Zellen sehen nicht sehr wichtig, da ist eine große Anzahl von apoptotischen Zellen (Zellen nicht in der Lage, in myeloische Zellen und unheilbar differenzierten Zellen zu unterscheiden). - Nach 3 Tagen die Knochenmark-Zellkultur fängt an lebenswichtigen schauen und Cluster der teilenden Zellen gebildet. Ersten adhärente Zellen können bereits beobachtet werden. An dieser Stelle ergänzen Sie die Zellen mit frischen Zytokin-Medien.
- Fügen Sie 10 mL vorgewärmten DMEM Medien mit Serum und M-CSF (aus Schritt 1.4) in je 10 cm Petrischale und senden Sie es in der Zelle-Kultur-Inkubator. Es gibt keine Notwendigkeit, die alten Medien während dieses Schrittes zu entfernen.
Hinweis: Knochenmark Makrophagen unterscheiden sich vollständig nach 5 – 7 Tage in der Kultur. Die beste Zeit für die Ernte ist am Tag 6 – 8, wo Zellen überwiegend Anhänger und die Petrischale vollständig bedeckt ist. - Am 5. Tag nutzen Sie der Petrischale in die Zelle-Kultur-Haube und neigen Sie das Gericht zu, bis die Medien fast den Rand der Schale erreicht. 15 mL der Medien von der Oberfläche in der Nähe der Kante vorsichtig herausnehmen, und die Zellen sind in der Regel in der Mitte der Schale bleiben. Fügen Sie die gleiche Menge an vorgewärmten Medien mit M-CSF und legen Sie die Schüssel wieder in den Brutkasten.
Hinweis: Wenn Medien langsam und vorsichtig abgesaugt werden, sind fast keine Zellen verloren. Es ist jedoch auch möglich, Zentrifugieren der angesaugten Medien und die Zellen der Kultur, um sicherzustellen, dass keine nicht-Anhänger wieder hinzufügen (IE., unvollständig differenzierte) Zellen sind verloren. - Für Experimente sind nur adhärente Zellen (Makrophagen) verwendet. Um Zellen, an Tag 6 oder 7 zu ernten, entfernen Sie alle Medien und Einzelfeldern. Waschen Sie die Platte einmal mit vorgewärmten PBS ohne Serum.
- Fügen Sie 5 mL 0,02 % EDTA in PBS, und 3 – 5 min bei 37 ° C in Gewebekultur Inkubator inkubieren.
- Mit einer 5 mL-Pipette, entfernen Sie die Zellen aus der Schale durch einen Stream von PBS-EDTA und legen Sie sie in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 25 mL PBS. Bei Bedarf mehr Gerichte bündeln.
- Zentrifugieren Sie sofort bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Aufschwemmen der Makrophagen Pellet in DMEM Medien und die Zellen zu zählen. Der Ausdruck der Makrophagen Oberfläche Differenzierung Marker (CD11b und F4/80) durch Durchflusszytometrie zu überprüfen.
- Für Experimente erfordern die Zellen in Suspension, zB., flow Cytometry Experimente, qPCR oder western-Blot Analyse, die Makrophagen direkt verwenden. Für Experimente mit anhaftenden Makrophagen Platte die Zellen in der Zellkultur-Platte nach der Versuchsanordnung.
- Die Zellen sind bereits vollständig unterschieden. Halten sie in den Medien geeignet für das beabsichtigte Experiment oder in den ursprünglichen Wachstum und Differenzierung Medien mit M-CSF.
Hinweis: Für die Arbeit mit anhaftenden Makrophagen, übertragen Sie sie in eine neue Platte mindestens 6 Stunden vor der Verwendung (im Idealfall über Nacht), um die volle Haftung auf die neue Oberfläche zu ermöglichen. Der Bruchteil der Einzelfelder kann vor dem Experiment entfernt werden.
(5) Knochenmark Zelldifferenzierung in Knochenmark abgeleitet dendritische Zellen
- Befolgen Sie das Protokoll für BMDMs mit spezifischen Anpassungen für BMDCs in Schritten 5.2-5.4 beschrieben.
- Aufschwemmen der erhaltenen Pellet von Knochenmarkzellen in DMEMsupplemented mit 10 % FBS und Antibiotika und zählen der Zellen (durch folgende Schritt 4.1 des Makrophagen-Protokoll). Zur Differenzierung in dendritischen Zellen behandelt Platte 1 – 1,5 x 107 Knochenmarkzellen in einer 10 cm nicht-Gewebekultur (bakterielle) Petrischale in 10 mL der vorbereiteten DMEM Medien mit Serum und GM-CSF (aus Schritt 1.4.).
- Dieselben Schritte Anbau wie BMDM Protokoll (Schritte 4.3-4.5. von Makrophagen-Protokoll). Verwenden Sie DMEM Medien mit Serum und GM-CSF anstelle von M-CSF. Da die Anbau-Zeit für BMDCs länger ist (in der Regel 10 bis 12 Tage), fügen Sie 1 – 2 zusätzliche Fütterungen im Abstand von 3 Tagen (durch Entfernen des Überstands und einem neuen Anbau-Medien hinzufügen, wie in Schritt 4.5 beschrieben.).
- Dieser Teil des Protokolls ist praktisch identisch mit den entsprechenden Teil des Protokolls Makrophagen (Schritte 4,6 – 4.12. von Makrophagen-Protokoll). Verwenden Sie für Experimente nur adhärente Zellen. Am Tag 10-12, sammeln Sie die Zellen mit EDTA, zählen und Platte sie auf eine neue Oberfläche. Überprüfen Sie die Expression von Markern Oberfläche Differenzierung von dendritischen Zellen (CD11c +, CD11b + F4/80-) durch Durchflusszytometrie.
6. Herstellung von BMDMs und BMDCs mit dem Ausdruck EGFP-tagged Proteins des Interesses
- Aufzuwirbeln Sie das Pellet Knochenmarkzellen erwarb Schritt 3.10. in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika ergänzt und die Zellen zu zählen. Verwenden Sie für die Infektion, 2 – 5 x 106 BM Zellen pro Bohrloch einer Gewebekultur 6-Well Platte behandelt.
- Platte, die die Zellen in 1 mL der vorbereiteten DMEM Medien pro gut, ergänzt mit M-CSF für Differenzierung in BMDMs oder GM-CSF zur Differenzierung in BMDCs. halten die Zellen für 4 – 6 h in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C.
- Fügen Sie 2 mL frisch gesammelten Virus ("überstand 1") mit Polybrene (12 µg/mL, Endkonzentration 8 µg/mL nach Zugabe der Zellen) ergänzt.
Hinweis: Eingefrorenen aliquoten den Virus enthaltende überstand kann auch verwendet werden, aber Wirksamkeit niedriger sein. - Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.250 x g für 90 min. bei 30 ° C (mit langsamen Beschleunigung und Verzögerung). Dann 4 h mit 5 % CO2 bei 37 ° c inkubieren
- Optional: Ersetzen Sie 2 mL der Kultur Medien mit frischen Medium mit jeweiligen Zytokin (M-CSF oder GM-CSF) und Kultur mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Am zweiten Tag entfernen Sie 2 mL Nährmedien zu und wiederholen Sie das ganze Infektion (Schritt 6.3 – 6,4) mit 2 mL frisch gesammelten Virus ("überstand 2").
Hinweis: Dieser Schritt kann Infektion Wirksamkeit erhöhen. Verbesserung nach die zweiten Infektion der Zelle Art und Ziel-Protein und unserer Erfahrung abhängt kann von 30 %ige Erhöhung der Effizienz zu keiner Verbesserung überhaupt variieren. - Sammelt die nicht-anhaftende Zellen übertragen auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und drehen mit 500 X g für 5 min (4 ° C). Verwerfen Sie den überstand.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Nährmedien mit M-CSF oder GM-CSF, legen Sie die Zellen in einer Petrischale 10 cm Gewebe-Kultur behandelte und Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2. Optimale Anzahl von Zellen für eine 10 cm Teller ist 5 – 10 x 106 für BM-abgeleiteten Makrophagen und 10-15 x 106 für BM-abgeleitete dendritische Zelle.
Hinweis: Kleinere Gerichte oder Platten verwendet werden, aber Zellzahlen müssen entsprechend angepasst werden. - Folgen Sie der Makrophagen und dendritischen Zellen Kultivierung und Differenzierung Protokoll beschrieben in Schritt 4 und 5.
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Representative Results
Signalproteine Adapter sind in der Regel kleine Proteine ohne enzymatische Aktivität. Sie besitzen verschiedene Interaktion Domänen oder Motive, die Bindung an andere Proteine vermitteln beteiligt Signaltransduktion, einschließlich Tyrosin-Kinasen und Phosphatasen, Ubiquitin Ligases21. Für die Demonstration der Funktionalität dieses Protokolls wurden myeloid Zellen-Adapter PSTPIP2 und OPAL1 ausgewählt. PSTPIP2 ist ein gut charakterisierten Protein an der Regulation der Entzündungsreaktion22beteiligt. Es ist eine cytoplasmatische Protein, das auch in Zellmembranen über seine F-Bar-Bereich eingestellt werden kann. Zweite Protein ist einen transmembranen Adapter OPAL1, voraussichtlich Zellmembranen zugeordnet werden. Seine physiologische Funktion ist noch unbekannt. Ausdruck der OPAL1 ist jedoch in akute lymphoblastische Leukämie, bessere Prognose23zugeordnet.
cDNA baut Codierung für PSTPIP2 oder OPAL1 über einen kurzen Linker verschmolzen (GSGGGS oder Myc-Tag, beziehungsweise), EGFP am C-Terminus in den pMSCV retroviral Vektor mit Standardmethoden der cDNA Klonen geklont wurden. Diese Konstruktion wurde dann in Plat-E Zellen zusammen mit der Verpackung Vektor pCL-Eco transfiziert. Die daraus resultierende Überstände mit Retroviren wurden für die Transduktion von Knochenmarkzellen, gefolgt von der Differenzierung in BMDMs und BMDCs verwendet. Die Wirksamkeit von Plat-E Transfektion wurde nach der Sammlung von der zweiten Virus enthaltende Überstand von Durchflusszytometrie bewertet. Mittlere Transfektion Effizienz war 62 % für PSTPIP2-EGFP und 53 % für OPAL1 und die Ergebnisse sehr reproduzierbar (Abb. 1A, B waren). OPAL1 Konstrukt schien mehr für Plat-E Zellen (bewertet durch das Auftreten von schwimmenden/sterben Zellen in der Kultur), was zu einer Verringerung der Prozentsätze von transfizierten Zellen giftig sein.
Differenzierung-Status der Knochenmark abgeleitet Makrophagen und dendritischen Zellen (mit PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP retroviralen Konstrukten ausgestrahlt) wurde von Durchflusszytometrie bewertet. Reifen Makrophagen Bevölkerung wird durch CD11b und F4/80 Ausdruck definiert, während dendritische Zellen den CD11c Linie Marker ausdrücken. Mehr als 90 % der Zellen in beiden Arten von Kultur waren positiv für ihre jeweiligen Marker (Abb. 2A, B). Zu guter Letzt haben wir festgestellt, dass die Expression des PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP in BMDMs und BMDCs durch eine einfache Flow Cytometry Messung EGFP Fluoreszenz konstruiert. Der durchschnittliche Anteil der EGFP-Positive Makrophagen war 71 % für PSTPIP2-EGFP und 62 % für OPAL1-EGFP (Abb. 3A). Im Falle von dendritischen Zellen, der Wirkungsgrad war niedriger, 32 % für PSTPIP2 und 9 % für OPAL1 (Abb. 3 b). Die Ergebnisse mehrerer Experimente zeigen die Reproduzierbarkeit dieser Methode (Abbildung 3).
Wir bestimmen in der Regel nicht der Viruskonzentration in der Überstände, die wir in Infektionen verwenden. Wir bevorzugen das Virus Überstände frische, sofort nach der Entnahme, während die Virus-Titer-Bestimmung drei zusätzliche Tage erfordert. Infolgedessen, die Informationen über Virustiter ist nur auf ärztliche ex-Post. Allerdings kann es immer noch nützlich sein, wenn es um technische Fragen und Probleme. Zur Bewertung der Viruskonzentration in Überstände von Plat E transfizierten Zellen mit PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP konstruiert, wir mit seriell verdünnten Virus-haltigen Überstände gesammelt aus diesen transfizierten Zellen Plat-E NIH-3 t 3 Zellen inkubiert und genau wie beschrieben von Zjablovskaja Et al. in zuvor veröffentlichten JoVE Artikel24Virustiter bestimmt. In drei unabhängigen Experimenten, reichte der Virustiter von 1,1 x 106 bis 4,4 x 106 TU/mL. Wir waren nicht darauf bedacht, wesentlichen Unterschiede zwischen PSTPIP1-EGFP und OPAL1-EGFP Konstrukte und Überstände von Tag 1 und Tag 2. Wenn diese Überstände für Knochenmark-Zelle-Infektionen nach dem Protokoll verwendet wurden, die wir in diesem Artikel, die Multiplizität der Infektion (MOI) reichte von 1.1 bis 4.4 beschrieben sind. Innerhalb dieses Bereiches wir interessanterweise nicht keinen Zusammenhang zwischen Effizienz MOI und Infektion beobachten.
In Abbildung 4wurden PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP in BMDMs und BMDCs ausgedrückt durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Ausdifferenzierten Makrophagen und dendritischen Zellen haben eine charakteristische Form. Die Änderung der Morphologie aus kleinen abgerundeten Vorläuferzellen zu den großen Zellen des unregelmäßigen Formen bestätigt erfolgreiche Differenzierung. In Makrophagen war PSTPIP2 zytoplasmatischen mit teilweiser Lokalisierung an der Plasmamembran. OPAL1 schien auch teilweise auf die Plasmamembran ausgerichtet werden. Der Rest war wahrscheinlich von intrazellulären Membranen, wie das endoplasmatische Retikulum und Golgi-Komplex zugeordnet. Um diese Lokalisierung zu bestätigen, hätte bestimmten Organell Marker allerdings verwendet werden. In dendritischen Zellen zeigte sich die Membran Lokalisation weniger.
Abbildung 1: Effizienz der Plat-E Zelle Transfektion. Für die Transfektion von Zellen Plat-E wurden zwei Konstrukte, die Codierung Adapter-Proteine, PSTPIP2 und OPAL1 mit EGFP (PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP) verschmolzen in den Vektor pMSCV geklont. Standard-PEI-Transfektion erfolgte. Die Wirksamkeit der Transfektion wurde von Durchflusszytometrie der Plat-E Zellen nach der Erhebung des zweiten viralen Überstands bewertet. (A). repräsentative Flow Cytometry Plot. (B). Graph mit Ergebnissen von vier unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beurteilung der Differenzierung Status des BMDMs (A) und BMDCs (B). Oberflächenexpression von spezifischen Makrophagen und dendritischen Zellen Linie Marker wurde am 8. Tag des Anbaus durch Durchflusszytometrie gemessen. Abgestorbenen Zellen waren, gated, basierend auf ihrer Seite und forward Scatter Eigenschaften und Färbung mit Hoechst 33258. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bewertung des Ausdrucks der PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP. EGFP Fluoreszenz in BMDMs (A) und BMDCs (B) retrovirally mit PSTPIP2-EGFP und OPAL1-EGFP-Konstrukten ausgestrahlt wurde am 8. Tag des Anbaus durch Durchflusszytometrie gemessen. (C) . Diagramm zeigt die Ergebnisse von mehreren unabhängigen Experimenten. BMDMs und BMDCs wurden wie in Abbildung 2bewachte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Bilder von Makrophagen und dendritischen Zellen, die mit dem Ausdruck PSTPIP2 oder OPAL1. BMDMs (A) und BMDCs (B) mit dem Ausdruck PSTPIP2 und OPAL1 wurden durch live imaging konfokalen Mikroskopie visualisiert. EGFP Fluoreszenz in grün ist auf der linken Seite jeder Platte, Hellfeld Bild auf der rechten Seite angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der Ausdruck des Proteins des Interesses an Zielzellen ist ein wichtiger Schritt in vielen Arten von biologischen Studien. Differenzierte Makrophagen und dendritischen Zellen sind schwer zu transfizieren standard Transfektion und retrovirale Transduktion Techniken. Unter Umgehung der Transfektion von diesen differenzierten Zellen mit retrovirale Transduktion von Knochenmark Vorläufern, gefolgt von Differenzierung, wenn sie bereits das gewünschte Konstrukt tragen ist ein entscheidender Schritt, so dass des Ausdrucks der ektopische cDNAs in diesen Zelltypen. Ein Beispiel für erfolgreichen Einsatz dieser Methode finden Sie in unserer jüngsten Veröffentlichung25. Hier bieten wir eine kostengünstige Protokoll für stabile Expression des Konstrukts der Wahl im Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen, die mit diesem Ansatz zu erreichen. Das Verfahren, die, das wir präsentieren, ist relativ billig und einfach, aber sehr gute Ergebnisse liefern. In diesem Protokoll verwendete Reagenzien erlauben für den routinemäßigen Einsatz eine relativ restriktive Kostenrahmen. Das Protokoll zur Plat-E Transfektion beschäftigt PEI als Transfection Reagens. Im Vergleich zu anderen chemischen Transfektion Agenten, PEI ist von einem sehr niedrigen Preis, während seine Effizienz ist ähnlich wie die Mehrheit der anderen verbreitete Verbindungen. PEI kann jedoch mit vielen verschiedenen im Handel erhältlichen Transfektion Reagenzien in diesem Schritt ohne Verlust der Effizienz ersetzt werden. Als Leitprinzip führen Transfektion Protokolle bekannt, arbeiten mit gängigen HEK293 Zellen in der Regel auch gut mit Plat-E Zellen. Eine weitere kostengünstige Maßnahme ist die Nutzung von Zytokin-haltigen Überstände anstelle von gereinigten rekombinanten Zytokine. Die Verwendung von diese Überstände erfordert einige Optimierungen. Wenn das standard-Protokoll für ihre Vorbereitung und gefolgt ist, wird die Variabilität zwischen einzelnen Chargen von diese Überstände jedoch sehr gering, in der Regel erfordern keine Änderungen in Konzentrationen zwischen Einzellosen arbeiten. Die Wirkungsgrade von BMDM und BMDC Differenzierung mit diese Überstände sind nach unserer Erfahrung identisch mit gereinigtem Zytokine.
Neben retrovirale Transduktion existieren andere etablierte Methoden der Säugetier-Zelle Transfektion einschließlich chemische Transfektion (in der Regel mit kationischen Lipide oder kationische Polymere bilden komplexe mit DNA), Elektroporation und die Verwendung von andere Arten von viralen Vektoren, vor allem adenoviralen und Lentivirale Systeme26,27,28,29,30. Obwohl sehr hohe Titer und Effizienz mit Adenovirus-basierte gen Lieferung erreicht werden können, die Vorbereitung der entsprechenden Plasmiden und Viruspartikel sind schwieriger und zeitaufwendiger als bei Retroviren Systeme29. Darüber hinaus löst Adenovirus Entzündungsreaktion in dendritischen Zellen und Makrophagen29,31,32 und für eine optimale Leistung bei murine hämatopoetische Zellen Maus Belastung transgener Adenovirus-Rezeptor ist erforderlich-33. Auf der anderen Seite ist die Generation der Lentivirale Partikel tragen das gen des Interesses ein relativ einfacher Prozess, praktisch identisch mit dem für Retroviren genutzt. Im Gegensatz zu den Ecotropic retroviralen Vektoren in diesem Protokoll verwendeten können Lentiviren nicht wuchernden Zellen mehrere Arten, einschließlich Menschen34zu infizieren. Dies ist möglicherweise ein wichtiger Vorteil unter speziellen experimentellen Bedingungen. Diese Funktion beeinträchtigt jedoch auch erheblich die Sicherheit dieser Vektoren. Unserer Meinung nach für die gen-Lieferung an BMDMs und BMDCs bieten Retroviren die beste Balance von Effizienz, Sicherheit und Benutzerfreundlichkeit. Retroviral DNA-Konstrukte können leicht mit einfachen standard molekularen Klonen Techniken hergestellt werden. Virus entsteht durch die Verpackung die Zell-Linien direkt an die Kultur überstand und weitere Virus-Reinigung ist in der Regel nicht notwendig. Ecotropic Retroviren auch nicht leicht menschliche Zellen infizieren, wodurch ihre Verwendung relativ sicher. Jedoch es gibt auch einige allgemeine Nachteile, verbunden mit dem Einsatz von retroviralen Vektoren. Der wichtigste begrenzende Faktor ist, dass diese Viren infizieren nur proliferierenden35 Zellen. Diese Funktion wirkt sich nicht deutlich aus dem hier beschriebenen Protokoll, aber es schränkt das Anwendungsspektrum wo retrovirale Vektoren verwendet werden kann. Die Größe des Gens von Interesse, die in diese Vektoren geklont werden kann ist auch begrenzt und die Viruspartikel Titer sinkt mit steigender Plattengröße. Mit pMSCV Vektoren sehen, beginnen wir in der Regel Auswirkungen der Plattengröße bei rund 3 Kbp. Mit einem weiteren Anstieg der Plattengröße lehnt die Infektion Effizienz allmählich.
Die chemische Transfektion und Elektroporation sind einfacher zu bedienen, sicherer und weniger zeitaufwändig als eines Virus-basierte Verfahren26,27,28,30. Jedoch in BMDMs und BMDCs, sie können Antworten auf ausländische Nukleinsäuren31 stimulieren und sie erzeugen mehr zellulären Stresses. Darüber hinaus einige chemische Transfektion Reagenzien erhöhen Zelle Auto-Fluoreszenz die Durchflusszytometrie beeinträchtigen könnten oder Mikroskopie analysiert. Aufgrund der Vergänglichkeit des Ausdrucks können sie nur mit Reifen differenzierte BMDMs oder BMDCs verwendet werden. Im Gegensatz dazu die Sequenzen mit retroviralen Vektoren eingeführt sind dauerhaft in das Genom der Zielzellen integriert und ermöglichen eine stabile langlebige Expression kompatibel mit der Zeitskala der Differenzierung Protokolle34, 35. jedoch dieses Feature auch erhöht das Risiko von insertional Mutagenese. Aufgrund der relativ zufällig die Vektor-Integration sind seine Auswirkungen auf die große Populationen von Zellen beschränkt. Allerdings können sie auf der Ebene einzelner Zellen sichtbar. Zusätzliche Probleme können entstehen, wenn ein Konstrukt von retroviral Vektor Affekte dendritischen Zellen oder Makrophagen Differenzierung, wodurch Fehler generieren ausgedrückt BMDMs oder BMDCs von infizierten Stammväter unterschieden. Zu einem gewissen Grad, kann dies durch eine Anpassung der Infektionsbedingungen, geringe Expression zu erreichen überwunden werden (zB., durch die Reduzierung der Virustiter) oder durch den Einsatz eines induzierbaren Expressionssystems. Die Verwendung von EGFP verschmolzen mit dem Protein des Interesses oder als Reporter auch erlaubt für die Sortierung der Zellen mit Ausdruck entsprechend Experiment Ziele und Grenzen. Schließlich sollten wir auch Probleme gemeinsam für alle Transfektion/Transduktion Verfahren erwähnen. Dazu gehören vor allem Überexpression Artefakte, wie z. B. Protein misfolding, Mislocalization und Toxizität36. Protein-Toxizität könnte der Grund sein, warum OPAL1 relativ schwierig war, zum Ausdruck bringen. Sein Beispiel zeigt deutlich, dass die Natur des exprimierten Proteins die Wirksamkeit dieser Methode wesentlich beeinflussen kann. Allerdings waren wir trotzdem in der Lage, ausreichende Mengen an OPAL1-EGFP Zellen für die Mikroskopie-Analyse mit dieser Methode zum Ausdruck zu bringen, seine Nützlichkeit zu demonstrieren, auch im Umgang mit schwierigen Ziele zu erhalten. Darüber hinaus wäre es möglich, die Prozentsätze der Zellen ausgestrahlt durch FACS sortieren, ggf. von einer bestimmten Anwendung erhöhen. Die niedrige Infektion Effizienz kann auch teilweise durch zunehmende Konzentration der Viruspartikel mit verschiedenen Methoden oder Ready-to-Use-Kits überwunden werden. In unseren Händen hat Ultrafiltration von der viralen Überstand auf zentrifugale Filter mit einem Molekulargewicht von 100 kDa abgeschnitten nachweislich die beste Balance zwischen Effizienz und Aufwand.
Knochenmark abgeleitet Makrophagen und dendritische Zellen sind weit verbreitete Werkzeuge in Phagozyten Immunologie. Sie sind mehr physiologisch relevanten als Zelllinien zur Verfügung. Sie können in relativ hohen Stückzahlen erzeugt werden und zur gleichen Zeit, fehlt das genetische Heterogenität und Instabilität Merkmal der Zell-Linien. Ein weiterer Vorteil ist, dass sie aus genetisch veränderten Mäusen Studie zu den Auswirkungen der Gentechnik auf einer relativ reichlich vorhanden und homogene Zellpopulation erzeugt werden können. Dies ist besonders nützlich in biochemische Untersuchungen, wo relativ große Mengen an Zellen in der Regel erforderlich sind. Die Fähigkeit, diese Zellen mit cDNA-Konstrukten transduzieren eröffnet zusätzliche Möglichkeiten der Forschung anhand der Rekonstitution oder Ergänzung von genetischen Defekten in diesen Zellen und Struktur-Funktions-Analyse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von tschechischen Science Foundation (GACR) (Projekt Nr. 16-07425S), von Charles University Grant Agency (GAUK) (Projekt-Nr. 923116) und durch die institutionelle Förderung vom Institut für molekulare Genetik, Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik unterstützt. Republik (RVO 68378050).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
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