Summary
이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.
Abstract
수지상 세포와 대 식 세포는 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 형성 하는 중요 한 세포 이다. 그들은 또한 적합 한 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생합니다. 이러한 세포와 실험 작업은 오히려 도전적 이다. 그들의 풍부한 장기와 조직에 상대적으로 낮습니다. 결과적으로, 그들은 큰 숫자에서 고립 될 수 없습니다. 그들은 또한 transfect cDNA 구문으로 어렵다입니다. Murine 모델에서 이러한 문제는 골 수 세포에 대 한 M-CSF 또는 수지상 세포에 대 한 GM-CSF의 창시자에서 생체 외에서 분화에 의해 부분적으로 극복할 수 있습니다. 이 방법에서는, 아주 몇몇 동물에서 이러한 셀의 대용량을 얻을 수입니다. 또한, 골 창시자 retroviral 벡터 들고 이전에 파생 하는 골 수 수지상 세포와 대 식 세포로의 분화 재배의 초기 단계 동안에 cDNA 구문으로 불리고 있습니다. 따라서, 이러한 셀에 다양 한 cDNA 구문 표현 하 retroviral 변환 뒤에 체 외에서 분화를 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 형광 단백질, 탠덤 담긴 위하여 분석, 구조-기능 분석, 대 한의 포함 하 여 이러한 셀에 수행할 수 있는 실험의 범위를 확장 하는 실질적으로 소성 단백질을 표현 하는 능력 모니터링 바이오 센서와 다른 많은 세포질 기능. 이 문서에서는, 우리 붙일 태그가 단백질 코딩 벡터와 retroviral 변환 파생 murine 골 수 수지상 세포와 대 식 세포에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 두 어댑터 단백질, OPAL1 및 PSTPIP2, 예를에 우리 cytometry에 현미경의 실용적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 우리는 또한 장점 및이 방법의 한계를 설명.
Introduction
골수성 세포는 병원 체에 대 한 우리의 방어 메커니즘의 필수적인 부분을 나타냅니다. 그들은 죽어가는 세포 뿐 아니라 미생물, 빠르게 제거 수 있습니다. 또한, 그들은 또한 관련 규제 조직 개발 및 수리 및 항상성1,2,3를 유지. 모든 골수성 세포는 골 수에서 일반적인 골수성 창시자에서 차별화. 많은 기능 및 형태학 상으로 가지 하위 집합으로 그들의 차별화는 cytokines와 그들의 다양 한 조합4제어 대부분입니다. 가장 집중적으로 공부 골수성 세포 하위 집합 neutrophilic granulocytes, 대 식 세포와 수지상 세포를 포함합니다. 이러한 인구 중 결함 잠재적으로 생명을 위협 문제 원인의 인간과 쥐,12,3,5, 의 면역 체계의 심각한 장애를 일으킬 6.
Neutrophilic granulocytes, 달리 수지상 세포와 대 식 세포는 조직 거주 세포 그리고 면역 기관에 그들의 풍부는 상대적으로 낮은. 그 결과, 분리와 기본 수지상 세포와이 세포의 많은 수를 요구 하는 실험에 대 한 세포의 정화 이며 비싼 종종 불가능. 이 문제를 해결 하려면 프로토콜 동종 대 식 세포 나 수지상 세포 생체 외의 다량을 얻기 위해 개발 되었습니다. Cytokines의 존재 murine 골 수 세포의 분화를 기반으로하는 이러한 접근: 대 식 세포 그리고 granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 Flt3 리간드에 대 한 대 식 세포 콜로 니 자극 요소 (M-CSF) 수지상 세포7,8,9,10,,1112. 이 메서드에 의해 생성 된 셀 일반적으로 문학에서 골 수 유래 세포 (BMDMs) 및 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs)으로 설명 합니다. 그들은 주 대 식 세포 또는 해당 셀 라인 보다 수지상 세포와 더 많은 생리 적 속성을 있다. 또 다른 주요 장점은 유전자 이러한 세포 형태를 얻기의 가능성 수정 마우스13입니다. 야생-타입 셀 간의 비교 연구 하 고 유전자 변형된 생쥐에서 파생 된 세포는 유전자의 잠복 소설 기능 또는 관심사의 단백질에 대 한 중요 한.
살아있는 세포에 있는 단백질의 subcellular 지 방화의 분석 vivo에서관심사의 단백질에 형광 라벨의 결합을 필요합니다. 이것은 가장 일반적으로 유전자 인코딩된 퓨전 구문 형광 단백질을 (종종 짧은 링커)을 통해 결합 하는 분석 된 단백질의 구성으로 표현 하 여 달성 (예., 녹색 형광 단백질 (GFP))14,15 , 16. 수지상 세포 나 대 식 세포에 붙일 태그가 단백질의 식을 도전 이다. 이 세포는 일반적으로 표준 transfection 절차에 의해 transfect 어렵다 고 효율성 매우 낮은 경향이. 또한,는 transfection는 일시적, 그것은 세포 스트레스를 생성 하 고 달성된 강도의 형광 현미경 검사 법17에 대 한 충분 한 되지 않을 수도 있습니다. Transgene 식 retroviral 골 조상 세포의 감염의 충분 한 수준으로 이러한 셀의 합리적인 부분을 얻기 위해 벡터와 BMDMs 또는 BMDCs에 그들의 후속 차별화 되고있다 매우 효율적 접근입니다. 그것은 그들의 원래 세포 환경 안정 된 상태에서 또는 먹어서, 면역학 시 냅 스 형성 또는 마이그레이션 같은 면역 반응에 대 한 중요 한 프로세스 동안 골수성 근원의 단백질의 분석에 대 한 허용 했다. 여기, 우리 파생 murine 골 수 세포와 수지상 세포에 붙일 태그가 단백질의 안정적인 식 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 복지의 실험 동물에 분자 유전학 연구소의 전문가 위원회에 의해 및 체코 공화국의 과학 아카데미에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 시 약 준비
- 염화 염화 칼륨 (ACK) 버퍼를 준비 합니다. DdH2O의 500 mL를 NH4Cl의 4.145 g 및 0.5 g KHCO3 를 추가 다음 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ L을 추가 하 고 필터를 소독.
- Polyethylenimine (페이) 솔루션을 준비 합니다. DdH2오의 90 mL에 PEI의 0.1 g을 추가 교 반, 하는 동안 추가 1 M HCl dropwise pH 2.0 보다 낮은 될 때까지. 페이 해산 될 때까지 최대 3 h에 대 한 약동 하 고 1 M NaOH와 7.2에 pH를 조정 합니다. DdH2O 100 mL을 볼륨을 조정 하 고 필터를 소독. 1-2 mL aliquots를 확인 하 고-20 ° c.에 저장
참고: 녹고, 후 페이 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장 될 수 있지만 다시 동결 하지 해야 합니다. - M-CSF 또는 GM-CSF를 포함 하는 셀 문화 supernatants 준비. 이러한 supernatants 사전 고-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 이러한 supernatants 있도록 합류 cytokine 생산 세포 (GM-CSF 18 J558 세포) 또는 M-CSF 19CMG 14-12 셀 10 cm에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 페 트리 접시에 성장. 다음 모든 셀을 5% CO2에 추가 4 일 T150 조직 배양 플라스 크에 문화 미디어의 200 mL을 전송 37 ° c. 0.2 µ m 살 균 필터에 상쾌한 및 필터를 수집 합니다. Aliquots를 확인 하 고 이러한-80 ° c.에 저장
- 세포 배양의 100 mL를 준비: 10% 보충 DMEM 사 FBS 위와 문화 supernatants GM-CSF (BMDC 차별화)에 대 한 또는 (BMDM 차별화)에 대 한 M-CSF를 분 비 하는 세포에서 세포.
참고: 이러한 supernatants에서 cytokines의 양이 다를 수 있습니다 고 작업 농도 경험적으로 확인할 수 있다. 일반적으로 2-3% 상쾌한 GM-CSF (권장된 시작 농도 2%) 또는 5-10% 상쾌한 CMG에서 M-CSF (권장된 시작 농도 10%)을 생산 하는 14-12 셀을 생산 하는 셀 라인에서 사용 됩니다. 또는, 상업적으로 정화 10 ng/mL에서 사용할 수 있는 M-CSF와 GM-CSF 20 ng/mL에서 사용할 수 있습니다 포함 하는 cytokine supernatants, 즉거의 동일한 결과 함께., 차별화, 감염 효율의 속도에 아무런 영향 없이 그리고 EGFP 태그 구문의 subcellular 지 방화입니다. 항생제, 페니실린을 포함 한 G (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 사용할 수 있습니다 세포 배양 프로토콜의 어떤 단계에서 달리 명시 하지 않는 한.
2입니다. 레트로 바이러스의 생산
주의: retroviral 벡터는 바이러스 성 벡터의 다른 유형에 비교 될 때 상대적으로 안전 하 게, 하지만 그들은 여전히 포즈 잠재적인 안전 위험. 따라서, 그것은 최상의 진료와 적절 한 보호 장비, 작동 하 고 모든 안전 규정 및 바이러스 성 입자와 작업에 대 한 법적 요구 사항을 준수 하기 위해 중요 합니다.
- 플레이트 10 cm 배양 접시에에서 백 금-에코 (같은-E) 포장 셀의 단일 세포 현 탁 액 및 10% 포함 된 DMEM의 15 mL에 육성 FBS 합칠 50-60% (24 시간)까지. 세포는 단층에서 성장 해야 하 고 문화에서 덩어리를 형성 한다.
- Retroviral 구문의 피펫은 20 µ g (예., 붙일 태그가 단백질 pMSCV 벡터에 대 한 관심의 표현 구문)과20 (혈 청 없이 항생제) DMEM의 1 mL에 벡터와 부드럽게 믹스는 pCL 에코 포장의 10 µ g.
- 두 번째 튜브, PEI의 75 µ L (혈 청 없이 항생제) DMEM 1 mL에 추가 합니다. 실 온 (RT)에서 5 분을 품 어 하 고 믹스 두 튜브의 내용을 함께 실시간에 추가 10 분 동안 품 어
참고: pCL 에코의 추가 선택 사항입니다. 그것은 ecotropic 바이러스 성 수용 체에 대 한 코딩 하 고 바이러스 titer를 증가 시킬 수 있습니다. - 신중 하 게 2% 신선한 DMEMsupplemented 8 mL 같은 E 셀에 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. 항생제 transfection 효율을 줄일 수 있기 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.
- 신중 하 게 단계 2.3 같은 E 셀에 준비 하는 혼합물 (정)에 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어
- 부 화 후 10%를 포함 하는 미리 데워 DMEM의 10 ml 같은 E 셀에 매체 교환 FBS, 37 ° c.에 24 h에 대 한 셀을 육성 이 부 화 하는 동안 같은 E 셀 미디어에 바이러스를 생산할 예정 이다.
- 24 시간 후 5 mL 피 펫을 사용 하 여 백 금 에코 셀에서 retroviral 입자를 포함 하는 매체를 수집 하 고 전송 (ecotropic retroviral 입자를 포함 하는 "표면에 뜨는 1" =) 15ml 원심 관 하.
- 같은 E 셀 바이러스 supernatants에 의해 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 5 분 1250 × g에서 수집 된 바이러스 최상의 결과 얻으려면, 바이러스 감염에 대 한 즉시 사용 되어야 한다.
참고: 바이러스의 Aliquots 또한 나중에 사용에 대 한-80 ℃에 저장할 수 있습니다. 그러나, 그것은 변환 효율 특정 감소에 발생 합니다. 반복적인 동결/녹고는 바이러스의 때문에 그것은 바이러스 저하로 연결 하지 마십시오. - 10 %FBS 같은 e 세포 고 37 ° c.에 다른 24 h에 대 한 육성으로 미리 데워 DMEM의 10 mL을 추가
- 2.7 단계를 반복 합니다. 그리고 2.8입니다. "표면에 뜨는 2" 취득을
3. murine 골 수 세포 격리
- 자 궁 경부 전위 또는 다른 승인 된 메서드를 사용 하 여 마우스를 희생. 70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다.
- 핀셋과가 위를 사용 하면, 피부 뿐만 아니라 근육의 부분 뒷 다리에서 제거할. 신중 하 게 대 퇴 골을 깨지 않고는 고관절에서 있습니다를 분리 하십시오. 발목 관절에서 발을 잘라. 70% 에탄올과 뼈 (대 퇴 골 경골에 연결)를 스프레이 종이 타월을 사용 하 여 근육의 나머지 부분을 제거.
- 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 2%를 포함 하는 5 cm 페 트리 접시에는 뼈를 배치 FBS (PBS-FBS). 더 많은 뼈를 준비 하는 경우 처리 될 때까지 얼음에 페 트리 접시를 유지.
- 무 균 재배 확보를 위한 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행 합니다.
- 뼈 끝 (공동과 위로 조심 스럽게 잘라 무릎에 벤드)을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.
- 뼈 하나 하나를 처리 합니다. 가 위 핀셋에 뼈를 잡고 epiphyses (약 1-2 m m)의 매우 작은 부분을 잘라.
- 30g 바늘을 사용 하 여 2 또는 5 mL 주사기 15ml 원심 관으로 뼈의 양쪽 끝에서 골 수 세포를 PBS FBS 가득. 모든 셀을 제거 하기 위하여 홍 조 동안 뼈 안에 바늘을 이동 합니다. 바늘 막힌 되 면, 그것은 변경 합니다.
참고: 뼈 해야 차례 빨강에서 백색 내리는 동안. 이 대부분의 세포는 뼈에서 제거 되었습니다 나타냅니다. 약 2-3 mL PBS FBS의 뼈 당을 사용 합니다. - 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심
- 상쾌한 무시 하 고 실 온에서 2-3 분에 대 한 ACK 버퍼의 2.5 mL에 펠 릿을 resuspending 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. 세포, 동안 신선한 15 mL centrifug 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 골 수 세포를 필터링. 12 mL PBS FBS의 추가 샘을 복원 합니다.
참고: 침투성 세포 세포 죽음을 피하기 위해 ACK 버퍼의 5 분을 초과 하지 마십시오. - 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심
4. 골 수 세포 분화 골으로 파생 된 대 식 세포
- DMEM 10 %FBS 항생제 보충에 골 수 세포의 펠 릿 resuspend (1.4 단계 후 메모를 참조 하십시오. 항생제 농도) 셀을 카운트. BM으로 분화 세포 파생, 대 접시 5-10 x 106 골 셀에 10 cm 비-조직 문화 단계 1.4에서의 혈 청 및 M-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 mL와 함께 (세균성) 페 트리 접시를 취급.
참고: 골 수 세포의 수율은 약 4 x 107 / 6-8 주-오래 된 C57BL/6J 마우스. - 셀 셀 문화 인큐베이터에 5% CO2, 37 ° c.에 3 일 동안 품 어
참고: 처음 2 일 동안 셀 매우 중요 한, 보이지 않는 apoptotic 세포의 많은 수는 현재 (세포 골수성 세포와 말기 차별화 된 세포로 분화 수 없습니다). - 3 일 후, 골 수 세포 배양 중요 한 보고를 시작 하 고 셀 분할의 클러스터 형성 된다. 최초의 부착 세포 이미 관찰할 수 있습니다. 이 시점에서, 신선한 cytokine 미디어 셀 보충.
- 각 10 cm 배양 접시에 혈 청 및 M-CSF (단계 1.4)에서 미리 데워 DMEM 미디어의 10 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에 반환. 이 단계 동안 오래 된 미디어를 제거할 필요가 있다.
참고: 골 수 세포는 문화에서 5-7 일 후 완전히 분화 된다. 하루 6-8, 점착 및 페 트리 접시에 있는 세포의 대부분은 완전히 덮여 수확에 대 한 가장 좋은 시기가입니다. - 5 일에 셀 문화 후드로 페 트리 접시를가지고 고 미디어는 거의 접시의 가장자리에 도달 될 때까지 접시를 경사. 신중 하 게, 가장자리 근처 표면에서 미디어의 15 mL를 꺼내와 셀 접시의 한가운데에 체류 하는 경향이. 미리 데워 진된 미디어 M-CSF의 동일한 볼륨을 추가 하 고 다시 인큐베이터에 접시를 놓고.
참고: 미디어는 천천히, 그리고 신중 하 게 발음 하 고, 거의 셀 손실 됩니다. 그러나, 그것은 또한 aspirated 미디어 원심 하 여 다시 없는 비 부착 되도록 문화에 셀을 추가 (즉., 불완전 하 게 분화) 셀 손실 됩니다. - 실험, 부착 셀 (세포)만 사용 된다. 하루 6 또는 7에 셀, 수확, 모든 미디어와 부동 셀을 제거 합니다. 한번 혈 청 하지 않고 미리 데워 공영으로 접시를 씻어.
- PBS에 0.02 %EDTA 5 mL을 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 3-5 분 동안 품 어.
- 5 mL 피 펫을 사용 하 여 요리 하 여 한 스트림을의 PBS-EDTA에서에서 셀을 제거 하 고 PBS의 25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣어. 필요한 경우 더 많은 요리를 함께 풀.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 즉시 원심
- DMEM 미디어에서 대 식 세포 pellet을 resuspend 및 셀. Cytometry 여 대 식 세포 표면 차별화 마커 (CD11b 및 f 4/80)의 식을 확인 합니다.
- 세포에, 예수 필요로 하는 실험에 대 한., cytometry 실험, 정량 또는 서쪽 오 점 분석 흐름, 대 식 세포를 사용 하 여 직접. 부착 세포와 실험, 실험 설정에 따라 조직 문화 접시에 셀 접시.
- 세포는 이미 완전히 분화 된다. 원하는 실험에 적합 한 미디어 또는 M-CSF와 원래 성장과 분화 미디어에서 그들을 유지.
참고: 부착 세포, 작업에 새 전송에 대 한 새로운 표면에 완전 접착 수 있도록 (이상적으로 하룻밤) 사용 하기 전에 적어도 6 h 플레이트. 세포의 작은 분수 실험 하기 전에 제거할 수 있습니다.
5. 골 수 세포 분화 골에 유래 수지상 세포
- 조정 단계 5.2-5.4에에서 아래 설명 된 BMDCs에 대 한 특정 BMDMs에 대 한 프로토콜을 따릅니다.
- 10 %FBS 항생제 DMEMsupplemented에서 골 수 세포의 획득된 펠 릿 resuspend 및 세포 (대 식 세포 프로토콜의 다음 단계 4.1)에 의해. 수지상 세포로 분화, 플레이트 1-1.5 x 107 골 수 세포에 있는 10 cm 비-조직 문화 (단계 1.4.)에서 혈 청 및 GM-CSF 미리 준비 된 DMEM 미디어 10 ml에서 (세균성) 페 트리 접시 처리.
- BMDM 프로토콜에서 동일한 재배 단계 (4.3-4.5 단계. 대 식 세포 프로토콜의). DMEM 미디어를 사용 하 여 혈 청 및 M-CSF 대신 GM-CSF. 때문에 BMDCs에 대 한 재배 시간이 깁니다 (일반적으로 10-12 일), 추가 1-2 추가 수 유 3 일 간격으로 (제거는 상쾌한 고 4.5 단계에에서 설명 된 대로 새로운 재배 미디어 추가.).
- 이 프로토콜의 부분은 거의 같은 대 식 세포 프로토콜의 해당 부분 (4.6-4.12 단계. 대 식 세포 프로토콜의). 실험에 대 한 부착 셀만 사용 합니다. 하루 10-12, 수집, EDTA를 사용 하 여 셀에 계산 하 고 새로운 표면에 접시. 수지상 세포의 표면 차별화 마커의 식 확인 (CD11c +, CD11b + F4/80-) cytometry에 의해.
6. BMDMs와 관심의 EGFP 태그 단백질을 표현 하는 BMDCs의 생산
- 3.10 단계에서에서 얻은 골 수 세포의 펠 릿 resuspend DMEM에서 10 %FBS 항생제 보충과 셀. 감염에 대 한 사용 2-5 x 106 6 잘 조직 배양의 당 BM 셀의 플레이트 취급.
- 1 ml 당 준비 된 DMEM 미디어의 셀 음, M-CSF BMDMs에 차별화 또는 GM-CSF BMDCs. 차별화에 대 한 보충 판 37 ° c.에 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 4-6 h에 대 한 셀을 유지
- Polybrene (12 µ g/mL, 셀에 추가 후 최종 농도 8 µ g/mL)와 보충 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 1")의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고: 바이러스 포함 된 상쾌한의 얼어붙은 약 수 사용할 수 있습니다 또한, 하지만 효능은 낮은 것 이다. - 90 분 (느린 가속도와 감속) 30 ° C에서 1250 x g에서 격판덮개 원심 그런 다음, 5% CO2 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어
- 옵션: 대체 문화 미디어의 2 mL 신선한 매체 포함 각각 cytokine (M-CSF 또는 GM-CSF)와 37 ° c.에 5% CO2 와 문화 두 번째 날, 문화 미디어의 2 개 mL를 제거 하 고 갓 수집 된 바이러스 ("표면에 뜨는 2")의 2 개 mL로 전체 감염 절차 (6.3-6.4 단계)를 반복 합니다.
참고:이 단계는 감염 효능을 증가할 수 있습니다. 개선 후 두 번째 감염 세포 유형 및 대상 단백질에 및 우리의 경험에 따라 변화할 수 있다 30% 증가에서 효율에서 개선 전혀. - 수집 비 부착 한 세포 15ml 원심 관에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 500 x g에서 회전. 폐기는 상쾌한.
- M-CSF 또는 GM-CSF 문화 미디어 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend, 셀 10cm 조직 문화 치료 페 트리 접시에 놓고 37 ℃, 5% CO2에서 문화. 10 cm의 요리에 대 한 셀의 최적 수는 5-10 x 106 BM 파생 된 세포 및 10-15 x 106 BM 파생 수지상 세포.
참고: 작은 접시 또는 접시 사용할 수 있습니다, 하지만 셀 번호를 적절 하 게 조정 해야 합니다. - 따라는 대 식 세포와 수지상 세포 및 분화 프로토콜 4 및 5 단계에서 설명한.
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Representative Results
신호 어댑터 단백질은 어떤 효소 활동 없이 일반적으로 작은 단백질. 그들은 다양 한 상호 도메인을 소유 또는21tyrosine kinases, 가수분해, 유비퀴틴 ligases 등 신호 변환에 관련 된 주제, 다른 단백질 바인딩 중재. 이 프로토콜의 기능의 데모에 대 한 PSTPIP2 및 OPAL1 골수성 세포 어댑터 선정 됐다. PSTPIP2 잘 특징이 단백질 염증 반응을22의 규칙에 관련 된 이다. 그것은 또한 F 바 도메인을 통해 세포 막 채용 될 수 있는 세포질 단백질입니다. 두 번째 단백질은 막 횡단 어댑터 OPAL1, 세포 멤브레인과 연결 될 것으로 예상 된다. 그것의 생리 기능은 아직 알려져 있지 않습니다. 그러나, 급성 림프 구성 백혈병에서 OPAL1 표현의 더 나은 예 지23와 연결 됩니다.
cDNA를 PSTPIP2 또는 OPAL1 짧은 링커를 통해 융합에 대 한 코딩 구성 (GSGGGS 또는 Myc-태그, 각각) C-말단에 EGFP를 복제 된 cDNA 클로닝의 표준 방법을 사용 하 여 pMSCV retroviral 벡터에. 이 구문은 다음 포장 벡터 pCL-에코와 같은 E 셀으로 페 했다. 결과 supernatants 레트로 바이러스를 포함 하는 골 수 세포, BMDMs 및 BMDCs로 분화 하 여 다음의 변환에 대 한 사용 되었다. 같은 E transfection의 효능은 cytometry 두 번째 포함 하는 바이러스 상쾌한 컬렉션 후에 평가 됩니다. 평균 transfection 효율 OPAL1 및 결과 했다 매우 재현 (그림 1A, B) 62% PSTPIP2 EGFP 및 53% 이었다. OPAL1 구문 같은 E 세포는 (문화에서 부동/죽어가는 세포의 모양에 의해 평가), transfected 세포의 비율에 있는 감소의 결과로 더 독성 것 같았다.
파생 된 골 수 세포와 수지상 세포 (PSTPIP2-EGFP 및 OPAL1 EGFP retroviral 구문으로 불리고)의 분화 상태 cytometry에 의해 평가 되었다. 성숙한 macrophage 인구 수지상 세포 표현 CD11c 혈통 마커 CD11b F4/80 식에 의해 정의 됩니다. 두 가지 유형의 문화에 있는 세포의 90% 이상 그들의 각각 마커 (그림 2A, B)에 대 한 긍정적인 했다. 마지막으로, 우리는 PSTPIP2 EGFP 식 수준 OPAL1 EGFP EGFP 형광의 간단한 흐름 cytometry 측정 하 여 BMDMs 및 BMDCs 구성 결정. EGFP 양성 세포의 평균 비율이 이었다 PSTPIP2 EGFP 71%, 62 %OPAL1-EGFP (그림 3A). 수지상 세포의 경우 효율은 낮은, OPAL1에 대 한 9%와 32 %PSTPIP2 (그림 3B). 여러 실험 결과이 방법 (그림 3C)의 재현성을 보여줍니다.
우리는 일반적으로 supernatants 우리가 감염에 사용 하는 바이러스 농도 결정 하지 않습니다. 우리는 바이러스 titer 결정 3 추가 일을 요구 하면서 컬렉션, 후 즉시 바이러스 supernatants 신선한을 사용 하 여 선호 합니다. 그 결과, 바이러스 titer에 정보만 가져올 수 있습니다 게시물 ex. 그러나, 그것은 유용할 수 있습니다 아직도 기술 문제 및 문제를 해결 하는 경우. 같은 E에서 supernatants의 바이러스 농도 평가 하기 위해 셀 PSTPIP2 EGFP와 페 및 OPAL1 EGFP 구성, 순차적으로 희석된 바이러스 포함 supernatants 이러한 transfected 같은 E 셀에서 수집 된 NIH-3T3 세포를 incubated 우리와 Zjablovskaja 외 이전 게시 정돈 기사24에 의해 묘사 된 대로 정확 하 게 바이러스 titer를 확인 했습니다. 3 개의 독립적인 실험에서 바이러스 titer 1.1 x 10에서 배열 했다 4.4 x 106 6 화/mL. 우리는 PSTPIP1 EGFP 사이의 OPAL1 EGFP 구문 및 supernatants 1 일에서 2 일 사이 상당한 차이 관찰 하지 않았다. 때 이러한 supernatants 우리가이 기사, 감염 (MOI) 4.4 1.1에서 배열 했다의 다양성에서에서 설명 하는 프로토콜에 따라 골 수 세포 감염을 위해 사용 되었다. 흥미롭게도,이 범위 내에서 우리 하지 방어 및 감염 효율성 사이 어떤 상관 관계가 관찰 않았다.
그림 4, PSTPIP2-EGFP 및 OPAL1-EGFP BMDMs와 BMDCs에 표현 confocal 현미경 검사 법에 의해 시각화 했다. 완벽 하 게 차별화 된 대 식 세포와 수지상 세포 특성 모양이 있다. 불규칙 한 모양의 큰 셀에 작은 둥근된 뿌리 세포에서 형태학에 있는 변화는 성공적인 차별화를 확인합니다. 대 식 세포, PSTPIP2 세포질 원형질 막에 부분 지역화와 함께 했다. OPAL1은 원형질 막에 또한 부분적으로 타겟이 될 것으로 보인다. 나머지는 바인딩과 그물 등 골 복잡 한 세포내 막와 아마 연관 되었다. 그러나이 지역화를 확인 하려면 특정 세포 기관이 마커 해야 사용할 수 합니다. 수지상 세포 막 지역화 덜 분명 했다.
그림 1: 같은 E 세포 transfection 효율. 같은 E 세포의 transfection에 대 한 두 구문 인코딩 접합 기 단백질 PSTPIP2 및 OPAL1 (PSTPIP2-EGFP 및 OPAL1 EGFP) EGFP 융합 했다 pMSCV 벡터에 복제 됩니다. 표준 페이 transfection 수행 되었다. Transfection의 효능은 cytometry 같은 E 셀의 두 번째 바이러스 상쾌한 컬렉션 후에 평가 됩니다. (A). 대표적인 교류 cytometry 플롯. (B). 4 개의 독립적인 실험의 결과 보여주는 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: BMDMs (A)와 BMDCs (B)의 분화 상태의 평가. 특정 대 식 세포와 수지상 세포 계보 마커의 표면 식 재배의 8 날에 cytometry에 의해 측정 되었다. 그들의 측면과 앞으로 분산형 속성에 따라 및 Hoechst 33258로 염색 죽은 세포 밖으로 문이 되었다. 결과 적어도 3 독립적인 실험의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: PSTPIP2 EGFP 및 OPAL1 EGFP 식의 평가. EGFP 형광 BMDMs (A)와 (B) BMDCs retrovirally PSTPIP2-EGFP 및 OPAL1 EGFP 구문으로 불리고는 cytometry 재배의 8 날에 측정 됩니다. (C) . 여러 개의 독립적인 실험의 결과 보여주는 그래프. BMDMs와 BMDCs는 그림2 문이 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대 식 세포와 수지상 세포를 표현 하는 PSTPIP2 또는 OPAL1의 대표 이미지. BMDMs (A) 및 BMDCs (B) PSTPIP2와 OPAL1 라이브 이미징 confocal 현미경 검사 법에 의해 구상 했다. EGFP 형광 녹색에 각 패널의 오른쪽에 밝은 필드 이미지의 왼쪽에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 결과 적어도 3 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대상 셀에 관심사의 단백질의 표정은 다양 한 생물 학적 연구에에서 중요 한 단계. 차별화 된 대 식 세포와 수지상 세포는 표준 transfection retroviral 변환 기법에 의해 transfect 어렵다. 이러한 소성 cDNAs의 식을 수 있도록 중요 한 단계는 골 수 창시자, 그들은 이미 원하는 구문을 수행할 때 차별화 뒤 retroviral 변환으로 이러한 차별화 된 세포의 transfection를 무시 셀 유형입니다. 이 방법의 성공적인 사용의 예는 우리의 최근 게시25에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적인 표현의 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포는이 접근을 사용 하 여 선택의 구조를 달성 하기 위한 비용 효율적인 프로토콜을 제공 합니다. 우리가 제시 하는 절차는 상대적으로 저렴 하 고 간단 하 고, 아직 매우 좋은 결과 제공. 시 약이이 프로토콜에 사용 되는 상대적으로 제한적인 예산 에서도 일상적인 사용에 대 한 수 있습니다. 같은 E transfection에 대 한 프로토콜 transfection 시 약으로 페이 사용합니다. 다른 화학 transfection 에이전트에 비해 페이 매우 저렴 한 비용의 그것의 효율성은 비슷한 대부분의 다른 널리 이용 되는 화합물. 그러나, 페이 효율성의 손실 없이이 단계에서 많은 다른 상용 transfection 시 약으로 대체할 수 있습니다. 지도 원칙으로 서 일반적으로 일반적으로 사용 되는 HEK293 세포와 함께 작동 하도록 알려진 transfection 프로토콜 수행 잘 같은 E 셀, 너무 합니다. 다른 비용 효율적인 측정 순화 된 재조합 cytokines 대신 포함 하는 cytokine supernatants의 활용 이다. 이러한 supernatants의 사용 일부 최적화를 요구 한다. 그러나, 그들의 준비에 대 한 표준 프로토콜 설립 뒤 때 이러한 supernatants의 개별 배치 사이 가변성 매우 낮은 경우, 일반적으로 개별 많은 사이 농도에 변화가 요구 된다. 이러한 supernatants와 BMDM 및 BMDC 분화의 효율성, 우리의 경험, 동일 순화 cytokines에에서 있습니다.
Retroviral 변환 뿐만 아니라, 존재 하는 포유류 세포 transfection의 다른 잘 설립 방법, 화학 transfection (양이온 지질 이나 dna 복합물을 형성 하는 양이온 폴리머를 사용 하 여 일반적으로), electroporation의 사용 등 바이러스 성 벡터, 주로 adenoviral lentiviral 시스템26,,2728,29,30의 다른 종류. 아 데 노비 루스 기반 유전자 배달 매우 높은 titers 및 효율성 달성 될 수 있다, 하지만 더 어렵고 보다 retroviral 시스템29의 경우 해당 플라스 미드와 바이러스 성 입자의 준비가 이다. 또한, 아 데 노 바이러스 수지상 세포와 대 식 세포29,,3132 및 최적의 성능 murine 조 혈 모 세포 마우스 스트레인 들고 유전자 변형에 대 한 염증 반응 elicits 아 데 노비 루스 수용 체 필요한33입니다. 다른 한편으로, 관심사의 유전자를 운반 lentiviral 입자의 생성은 비교적 간단한 과정, 레트로 바이러스에 대 한 활용을 거의 동일. 이 프로토콜에 사용 되는 ecotropic retroviral 벡터, 달리 lentiviruses 인간34를 포함 하 여 여러 종의 비 증식 세포를 감염 할 수 있다. 이 특정 한 실험 조건에서 중요 한 이점이 있을 수 있습니다. 그러나,이 기능에는 크게이 벡터의 안전 타협. BMDMs 및 BMDCs, 유전자 배달에 대 한 우리의 의견에 레트로 바이러스 효율성, 안전 및 사용의 용이성의 최적 균형을 제공합니다. Retroviral DNA 구조는 간단한 표준 분자 복제 기술을 사용 하 여 쉽게 준비 수 있습니다. 바이러스 표면에 뜨는 문화에 직접 셀 라인 포장에 의해 생산 되 고 더 바이러스 정화는 일반적으로 필요 하지 않습니다. Ecotropic 레트로 바이러스 또한 할 하지 쉽게 감염, 인간 세포는 상대적으로 안전 하 게 그들의 사용. 그러나, 또한 있다 retroviral 벡터의 사용과 관련 된 몇 가지 일반적인 단점이. 주요 제한 요인은 이러한 바이러스 감염만35세포 확산 이다. 이 기능은 크게 영향을 주지 않습니다 여기에 설명 된 프로토콜만 그것은 retroviral 벡터를 사용할 수 있는 응용 프로그램의 범위를 제한 합니다. 이 벡터에 복제 될 수 있는 관심사의 유전자의 크기 제한도 되며 바이러스 성 입자 titer 삽입 크기 증가 함께 감소. PMSCV 벡터와 우리는 일반적으로 약 3 kbp에서 삽입 크기의 효과 보고 시작 합니다. 삽입 크기에 더 증가, 감염 효율 점차적으로 저하 됩니다.
화학 transfection 그리고 electroporation 사용 하기 쉽게, 안전 하 고 바이러스 기반 절차26,,2728,30보다 덜 소모 있습니다. 그러나, BMDMs 및 BMDCs, 그들은 외국 핵 산31 에 대 한 응답을 자극 수 있습니다 하 고 그들은 더 많은 세포 스트레스를 생성 키를 누릅니다. 또한, 일부 화학 transfection 시 약 셀 자동-형광 cytometry 방해할 수 증가 또는 현미경 분석. 표현의 과도 특성상 그들만 성숙 차별화 된 BMDMs 또는 BMDCs와 함께 사용할 수 있습니다. 도입 retroviral 벡터 시퀀스 영구적으로 대상 세포의 게놈으로 통합 하 고 분화 프로토콜34, 의 시간 규모와 호환 안정 오랫동안 식 허용 하는 반면, 그러나 35.,이 기능은 또한 insertional mutagenesis의 위험을 증가 시킵니다. 벡터 통합의 상대적으로 임의의 특성으로 인해 세포의 큰 인구에 미치는 영향 제한 됩니다. 그러나, 그들은 볼 수 있습니다 개별 셀의 수준에서. Retroviral 벡터에 영향을 미치는 수지상 세포 나 대 식 세포 감 별 법, 생성 하는 실패 결과로에서 표현 하는 구문 감염된 창시자에서 BMDMs 또는 BMDCs을 분화 하는 경우 추가 문제가 발생할 수 있습니다. 어느 정도까지,이 낮은 식 수준을 달성 하기 위해 감염 상태를 조정 하 여 극복할 수 있습니다 (예., 바이러스 titer 감소 시켜) 또는 유도할 수 있는 식 시스템에 사용. 또한 관심의 또는 기자로 서 단백질을 융합 EGFP 사용 식 수준의 실험 목표와 제한에 해당 셀의 정렬에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 또한 모든 transfection/변환 절차에 공통 문제를 언급 한다. 이들은 주로 overexpression 유물, misfolding, mislocalization 및 독성36단백질 등을 포함 합니다. 단백질 독성 OPAL1 상대적으로 어려운 표현 하는 이유 왜 일 수 있었다. 그 예는 명확 하 게 표현한 단백질의 특성이이 방법의 효과 영향을 크게 수 있습니다 보여 줍니다. 그러나, 그럼에도 불구 하 고, 우리는 OPAL1-EGFP 현미경 분석에 대 한 셀을 표현 하는이 방법으로, 어려운 목표를 다룰 때에 그것의 유용성을 보여주는의 충분 한 수량을 얻을 수 있었다. 또한, FACS 정렬 특정 응용 프로그램에 필요한 경우에 의해 불리고 셀의 비율을 높일 수 것입니다. 낮은 감염 효율 증가 하는 다양 한 방법이 나 준비-사용 키트를 사용 하 여 바이러스 성 입자 농도 의해 부분적으로 극복할 수 있다 또한. 우리의 손에서 바이러스 상쾌한 잘라 100 kDa의 분자량과 원심 필터에의 한 효율성과 필요한 노력 간의 최상의 균형을 제공 하기 위해 입증 되었습니다.
골 수 유래 세포 그리고 수지상 세포는 이것 면역학에 널리 사용 되는 도구. 그들은 사용 가능한 셀 라인 보다 더 순수 관련입니다. 그들은 상대적으로 높은 번호에서 생성 될 수 있다 하 고, 동시에 세포의 유전이 성분 및 불안정 특성 부족. 또 다른 장점은 그들은 상대적으로 풍부 하 고 동종 세포 인구에서 유전자 조작의 효과 연구를 유전자 변형된 쥐에서 생성 될 수 있습니다. 이 상대적으로 많은 양의 세포는 일반적으로 필요한 생화학 연구에 특히 유용 합니다. CDNA 구문으로 이러한 셀 transduce 수 재구성 또는 이러한 세포와 구조-기능 분석에서 유전 결함의 보완성에 따라 연구의 추가 가능성을 엽니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품으로 체코 과학 재단 (GACR) (프로젝트 번호 16-07425S)에 의해 찰스 대학 부여 기관 (GAUK) (프로젝트 번호 923116) 및 기관 자금에서 연구소의 분자 유전학, 체코의 과학 아카데미에 의해 지원 되었다 공화국 (RVO 68378050)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
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