Summary
프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.
Abstract
역학의 현재 이해 및 T-세포 시 냅 스 인터페이스의 구조 기능 지원 되는 유리 평면 bilayers 및 생체 외에서의 사용을 통해 주로 결정 되었습니다-파생 된 T-세포 복제 또는1,2 라인 ,,34. 이러한 연구 결과 혈액에서 격리 또는 림프 기본 인간 T 세포에 적용 하는 방법 조직은 모른다, 분석5셀의 충분 한 수를 취득에 상당한 어려움 때문에 부분적으로. 여기 우리가 구축 활성화 및 접착 분자를 포함 하는 평면 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드를 이용 하는 기술 개발을 통해이 해결 합니다. 흐름 슬라이드의 낮은 높이 시 냅 스 인터페이스 형성의 동적과 립 방출의 속도 론을 공부 하 고 연구 함으로써 셀: bilayer 첨부 파일을 동기화 하기 위해 빠른 셀 침전을 촉진 합니다. 우리는 10 몇의 시 냅 스 인터페이스를 분석에이 접근을 적용 105 주 cryopreserved T 세포 림프 노드 (LN) 및 말 초 혈액 (PB)에서 절연 된4 . 결과 공개 소설 평면 지질 bilayer 기술 기본 인간 T 세포에서 혈액과 조직 건강과 질병의 맥락에서 파생 된의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.
Introduction
T 세포의 기능 활동에 그들의 링크와 T 세포 면역 시 냅 스의 구조적 기능의 과학적 지식을 셀 라인의 연구에서 주로 생성 되 고 클론 PB에서 파생. 어느 정도 기본 T 세포에 관련 된 이러한 연구 결과에서 얻은에 혈액 또는 인간 림프 조직 남아 있다 불분명, 림프 및 다른 조직에서 T 세포의 시 냅 스 인터페이스는 지금까지 분석 되지. 중요 한 것은, 새로운 데이터 조직 상주와 림프 기관 파생 된 T 세포의 표현 형 및 PB6,7에 비해 기능 활동에 큰 차이가 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 이 추가 기본 인간 T 세포에서 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 기능을 더 잘 이해할 필요가 고형화 했다.
이 위해 악용 하는 멀티 채널 흐름 슬라이드를 T-셀/bilayer 인터페이스의 이미징 105 주 T 세포와 인간의 PB를 ln. 격리 수행에 내장 된 지질 bilayers 소설 미니 규모 접근 개발 했습니다. 이 새로운 기술은 더 나은 모델 하 고 vivo에서 세포 세포 상호 작용을 이해 하기 위해 기본 인간 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.
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Protocol
헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다.
1. 절연 CD4의 이미지 분석에 대 한+ T 세포
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107 냉동 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 림프 노드 단 세포 (LNMCs) 수집 된 샘플에서 포함 된 1 mL 약 수 동 살 균 후드에서 RPMI 페니실린/스와 글루타민 보충의 9 mL에 해 동된 셀을 추가 합니다.
- Centrifugate에서 4 ° C, 300 x g 에서 10 분 동안 셀 상쾌한, 발음 및 10%를 포함 하는 보충된 RPMI의 5 mL에 셀 resuspend FBS (완전 한 매체). 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어
- 다음 날, 정화 CD4 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬 하 여+ T 세포.
- 갓 순화 CD4 수를 측정 하기 위해+ T 세포, trypan 블루 솔루션의 동등한 볼륨 세포 현 탁 액의 5 µ L를 혼합. 로드 셀 trypan과 hemocytometer 혼합물을 블루와 hemocytometer의 5 섹션 안에 라이브 셀.
- 휴대폰 번호의 평균을가지고 고 원래 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 결정: 셀/1 mL의 수 = 2 × 104x 평균 수. 고립 된 세포의 총 수 너무 작은 경우 셀 계산 하지 않고 그대로 사용 합니다.
- 10 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심 및 105에 분석 결과 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm 나2HPO4, 5 m D-포도 당, 5 m KCl, 1 mM MgCl2m m, 2 m m CaCl2및 1% 인간 혈 청 알 부 민)에 그들을 resuspend < /c13 > 셀/50 µ L 이하로 실험에 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 (1-2 h) 세포를 유지 하 고.
- 관련 기관 지침에 따라 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
- 원하는 경우 컨트롤 셀 인구로 서, 탯 줄 혈액 PBMC에서에서 CD8 T 세포 활성화를 준비, 10 µ g/mL 및 1 µ g/mL에서 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체의 혼합물으로 덮여 T25 문화 플라스 크에 완전 한 매체의 5 mL에 107 셀 장소 각각.
- 다음 날, 플라스 크에서 활성화 코드 혈액 세포를 제거 그들을 씻어 1 x 신선한 매체를 완료 하 고 재조합 일리노이-2의 셀 확장 (100 U/mL) 2 주 동안.
- 코드-혈액 CD8 정화+ T 세포의 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬. 셀을 계산 하 고 LN 및 PB CD8 1.3-1.6 단계에 설명 된 대로 분석 결과 버퍼에 미디어를 교환+ T 세포.
2. 평면 지질 Bilayers의 준비에 대 한 구성 요소
- 5설명 되어 있는 대로 리의 3 종류 준비: (a) 0.4 m m DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리, (b) 0.4 m m DOPC 리 33 mol % 개 NTA를 포함 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- 아미노-1-carboxypentyl) iminodiacetic 산) succinyl] (염화 소금)) 지질, 4 mol %Biotinyl-모자-PE를 포함 하는 (c) 0.4 m m DOPC 리 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(모자 biotinyl) (나트륨 소금)).
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앞에서 설명한55% 카 세 인 솔루션을 준비 합니다.
- 초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장
주의: 수산화 나트륨 용액 화학 화상을 일으킬 수 있습니다 하 고 눈과의 접촉에 따라 영구적인 실명을 일으킬 수 있습니다. 이 화학 제품 또는 그것의 솔루션을 다룰 때 고무 장갑, 안전 복과 눈 보호를 사용 합니다.
- 초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장
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앞에서 설명한 방법은8모노-bionylated 항 체 분자를 생산 하기 위해 biotin과 레이블 안티-CD3 항 체.
- 0.1 mg/mL에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 Biotin PEO4 NHS의 솔루션을 준비 합니다. 0.5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 100 mM 탄산수 소 나트륨을 포함 하는 항 체의 1 밀리 그램 Biotin PEO4 NHS 솔루션의 3.7 µ L를 추가 합니다.
- 실 온에서 2 h에 대 한 혼합물을 품 어. 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 DMSO에 10 mg/mL에서의 솔루션을 준비 합니다. 10 어 금 니 과잉에 Biotin PEO4 보 건국에 의해 표시 된 항 체에 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 솔루션을 추가 합니다.
- 정기적으로 자력에 느린 교 반으로 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 언바운드 염료를 구분 합니다.
- 280에서 항 체 용액의 광학 밀도 측정 하 여 항 체 농도 결정 nm (280). 577에서 레이블이 지정 된 항 체의 광학 밀도 측정 nm (577).
- 다음 수식을 사용 하 여 염료를 항 체 비율을 확인 합니다.
참고: 제조업체의 프로토콜에서 추가 세부 정보를 찾을.
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앞에서 설명한3,4,,910 초파리 식 시스템에서 재조합 형 수용 성 ICAM-1 단백질을 표현 한다.
- 복제, cDNA 인코딩으로 초파리 식으로 ICAM-1의 ectodomain pMT/V5-그는 그의 추가 재조합 단백질을 생산 하는 유도할 수 있는 metallothionein 모터와 벡터 C 터미널 끝에6 태그.
- 공동 transfect S2 셀 결과 ICAM-1 포함 플라스 미드와 G418 식 벡터. 안정적인 transfectants 슈나이더의 초파리 미디어 3 주 동안 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 0.5 mg/mL G418의 보충을 사용 하 여 선택 합니다. 혈 청 무료 곤충 매체에 셀을 확장 하 고 0.5 m m CuSO4 3 d와 단백질 발현을 유도.
- 문화 표면에 뜨는 배를 집중 하 고 앞에서 설명한11로 접선 흐름 집중 장치를 통해 PBS에 대 한 dialyze.
- Covalently 고정된 안티-ICAM-1 단일 클론 항 체와 Sepharose를 포함 하는 열을 표면에 뜨는 집중된 문화를 적용 하 고 50mm 글리신 버퍼, pH 3.0으로 바인딩된 ICAM-1을 elute. 즉시 2 M Tris 버퍼, pH 8.0 eluted ICAM-1 단백질을 무력화.
- PBS, pH 8.0에 대하여 eluted 물자 dialyze 고 열 포함 Ni NTA agarose를 dialyzed 자료를 추가 합니다. 녹는 ICAM-1 200 mM 이미, pH 8.0 elute PBS 버퍼, pH 8.0에 eluted 소재 dialyze
- 레이블을 Cy5 NHS 에스테 르 제조 업체의 지시에 따라 정화 ICAM-1.
참고: 최고의 마지막 염료 단백질 비율은 1:1입니다.
- 팹 생산 papain 소화에 의해 안티-CD107a 항 체에서 조각 하 고 팹 정화 이온 교환 크로마토그래피3위에서 설명한 대로 의해 조각. 레이블 제조업체의 지시에 따라 알 렉 사 Fluor 568 NHS 에스테 르는 팹 조각.
3. 지원 되는 유리 평면 지질 Bilayers의 대형
- 집중된 한 황산과 과산화 수소 30%의 60 mL 140 mL를 혼합 하 여 신선한 산 성 피 솔루션을 준비 합니다. 몸을 담글 하 여 그들 30 분 대기에 대 한 산 성 피 솔루션에 유리 coverslip 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게와 흐름 슬라이드 유리 coverslips 세척.
주의: 피 솔루션은 매우 강한 산화 제. 솔루션을 처리 하는 동안 항상 착용 안전 유리 또는 고글 또는 두꺼운 고무 장갑 함께 들고 방패를 기억 하십시오. 증기 두건에서 피 솔루션 에서만 작동 합니다. 폭발 수 있습니다으로 난방, 수송, 또는 언제 든 지 사용 하는 동안 그것을 동요 하는 하지 마십시오. 포함 하는 리드 구멍 유리 병에 고생 폐기물을 수집 합니다. 문의 적절 한 폐기물 활용에 대 한 제도적 인 안전 위원회. -
린스 세척된 coverslips 7 초순 순차적으로 신선한 물을 포함 하는 비 커에 그들을 전송 하 여 x. 설정 옆으로 물이 남아 있도록 젖은 coverslips 롤 건조 유리를 남겨두고 깨끗 한 유리 합니다.
- 또는, 진공 펌프에 연결 된 피 펫 팁을 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips에서 나머지 물방울을 제거.
- 살 균 후드에서 희석 다양 한 지질 bilayers 만들기 위한 liposome 믹스를 생산 하기 위해 수행 합니다. 첫째, DOPC 리의 37 µ L 3 µ L Biotinyl-모자-PE 리의 결합. 둘째, DOPC 리의 14 µ L 고 개-NTA 리의 15 µ L를 혼합. 셋째, 결승전 liposome 혼합물을 조작 하는 두 번째의 29 µ L를 첫 번째 믹스 1 µ L를 추가 합니다.
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살 균 후드 작업 공간 가까이 의해 건조 coverslips로 설정 합니다. 결승전 liposome 혼합물의 aliquot 2 µ L (단계 3.3 참조) 접착 슬라이드 채널의 중심에 정확 하 게. 즉시 고 매우 정확 하 게 정렬 깨끗 하 고 건조 coverslip 슬라이드 및 슬라이드의 끈 적 한 면에 coverslip 부드럽게.
- 하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다.
참고: 깨고 나는 coverslip 크래킹을 피하기 위해 슬라이드의 채널에 대 한 누르지 마십시오. - 다시 슬라이드를 설정 하 고 어셈블리의 외부 슬라이드에 bilayer 주위 영구 표시와 함께 그리기 4 점으로 coverslip 사이의 채널 슬라이드 드롭 처럼 보이는 형성된 된 bilayer의 위치를 표시 합니다.
- 하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다.
- 채널에는 액체의 첫 번째 주입, 전에 엔트리 포트와 출구 포트 다른 채널의 한 포트를 지정 하 고 실험을 통해이 지정을 유지 합니다.
- 거품 형성을 방지 하려면 채널의 엔트리 포트에 직접 피펫으로 팁의 끝을 삽입 합니다. 천천히 따뜻한의 50 µ L를 채울 슬라이드의 채널 (적어도 룸 온도) 분석 결과 버퍼 (버퍼 구성에 대 한 1.5 단계 참조).
- 0.5 M nickel(II) 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 카 세 인 솔루션의 2 mL 약 수를 녹여 하 고 그것 200 µ M의 최종 농도에 니켈 염화 물 솔루션을 보완.
- 먼저 채널의 엔트리 포트에서 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 즉시 pipetting으로 슬라이드에 출구 포트에서 100 µ L을 제거 하 여 있는 bilayers 워시. 각 채널의 입력 포트에 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드 배양 하 여 동일한 솔루션 bilayers 차단.
- Aliquots Cy5-ICAM-1-그의6 와 streptavidin 단백질의 해빙 각 2 µ g/m l의 최종 농도에 분석 결과 버퍼에 단백질을 결합 한다. 20000 x g 및 모든 집계 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 솔루션 원심
- Pipetting으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 차단 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다. ICAM-1와 streptavidin 엔트리 포트에 포함 된 솔루션의 100 µ L를 주사.
- 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. 씻어 bilayer 2 채널의 입력 포트에 분석 결과 버퍼의 100 µ L를 먼저 주입 하 고 출구 포트에서 100 µ L를 즉시 제거 하 여 x.
- 2 µ g/mL의 최종 농도에 분석 결과 버퍼와 알 렉 사-형 석-488-셔 서 반대로 CD3 항 체 희석. 슬라이드의 엔트리 포트에 항 체 솔루션의 100 µ L를 주사 하 고 실 온에서 45 분 동안 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. Bilayer 2 세척 단계 3.11에서와 같이 분석 결과 버퍼의 100 µ L x.
4. 평면 Bilayer와 T 세포 상호 작용의 이미징
-
무대와 confocal 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 목표 온도 37 ° c.에 equilibrated 때까지 예 열 열띤된 무대에는 bilayer(s)와 함께 슬라이드를 설정 합니다. 잉크 자국에 따라 적절 한 위치에 무대를 이동 하 고 사 셔 서 ICAM-1 분자의 형광을 채용 하는 bilayer에 초점.
- Confocal 현미경에 대 한 61 X 목표 또는 100 X 목표를 사용 하 여 적절 한 필터 설정으로 TIRF 현미경에 대 한.
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과 립에 대 한 이미징 TIRF 현미경 분리, 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a를 추가 엔트리 포트에 세포를 주입 하기 전에 4 µ g/mL의 최종 농도에 세포 현 탁 액에 항 체 Fab 조각.
- 준비 된 CD4 resuspend+ T 세포 선 또는 PB 또는 코드에서 격리 혈액 및 슬라이드 채널을 포함 하는 bilayer의 엔트리 포트에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 주입.
- 주사 후 필드의 원하는 숫자와 30 분 동안 2 분 마다 x 각 필드 1의 이미지를 기록을 선택 합니다.
- 밝은 분야, 반사 빛, 및 형광 채널 (알 렉 사 488와 Cy5)는 이미지 공초점 현미경의 이용. TIRF 모드를 사용 하 여 알 렉 사-형 석-488와 알 렉 사-형 석-568 형광와 Cy5 형광, 뿐만 아니라 밝은 필드 이미징, TIRF 현미경에 widefield.
5. 이미지 분석
- 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 분석. 전송 된 가벼운 이미지와 제외 클러스터와 눈에 띄게 손상 또는 apoptotic 세포 분석에서 셀 형태를 관찰 합니다. 생산적 bilayer 표면 (즉, 인터페이스에 알 렉 사-형 석-488 형광 (안티-CD3 항 체)를 축적 하는 세포)와 상호 작용 하는 셀에만 분석에 포함 됩니다.
- 셀 bilayer 상호 작용의 개시 후 20 분에 셀 접착 영역의 크기를 결정 합니다.
참고: 접착 지역 방해 반사 현미경 (IRM) 이미지에 셀 bilayer 인터페이스에서 개발 된 어두운 영역이입니다. - 셀 bilayer 인터페이스에서 차별 Cy-ICAM-1 분자 Cy5-ICAM-1 형광의 어떤 축적과 링 접합의 형성을 관찰 합니다. 누적된 ICAM-1 분자 두 개 이상의 연속 이미지에 접착 링 접합 형성, 세포는 주변 supramolecular 활성화 클러스터 (pSMAC)12개발로 같은 셀을 지정 합니다.
- 셀에 가까운 근접에서 연락처 영역 밖에 배경 형광에 T 세포 bilayer 인터페이스에 알 렉 사-형 석-568 형광 강도 측정 하 여과 립 자료를 평가 합니다. Degranulating 셀 셀 배경의 알 렉 사-형 석-568 신호-를-적어도 1.3의 비율을 지정 합니다.
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Representative Results
첫째, 우리는 활성화 코드 혈액 파생 CD8에 의해 형성 된 시 냅 스 인터페이스의 구조를 비교+ T 세포 지질 bilayers에 노출 내장 중에서 전통적인 대규모 흐름 전지 시스템 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조)1 ,2,,34 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드. bilayers 포함 된 형광 표시 된 안티-CD3 ICAM-1 50 분자 / µ m2 와 300 분자 / µ m2, 각각. CD8+ T 세포 인간 코드 혈액에서 파생 된 플레이트-바인딩 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체13,14와 자극에 의해 활성화 되었다. CD8 사이 차이가 없었다+ T 세포는 형성된 클래식 면역학 시 냅 스 흐름 셀 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드 (그림 1)에 내장 된 지질 bilayers에. 다른 모든 실험 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드에서 수행 했다.
다음, 우리는 인간의 CD4 PB와 LN 파생의 능력 검사 평면 지질 bilayers에 있는 시 냅 스 인터페이스 및과 립 출시+ T 세포. 우리는 TIRF 현미경 셀 degranulating 시각을 립 방출의 속도 론 평가 T 세포 bilayer 인터페이스에 수직 해상도 최대화 하기 위해 악용. 우리 모두는 LN PBMC 파생 CD4 세포의 4 그룹 관찰+ T 세포: 몇몇 T 세포 성숙 면역 시 냅 스를 설립 했지만 하나 또는 알갱이 발표 하지 않았다, 다른 T 세포 성숙 시 냅 스의 형성 없이 립 출시 여전히 다른 T 세포 시 냅 스 형성도 립 (그림 2)7을 발표 했다. LN와 PBMC 파생 CD4의 차이+ T 세포과 립 방출의 속도 론 평가 되었다 때 분명해. PBMC 파생 CD4+ T 세포과 립 LN 파생 CD4 거의 두 배나 빨리 공개를 시작 수 있었다+ 세포 (그림 3)7. 전반적으로, 데이터 LN PBMC 파생 CD4의이 질에도 불구 하 고 그를 보여주는+ T 세포, 후자 포함 된 T의 일부 세포 degranulation 급속 한 수.
그림 1: 비교 흐름 슬라이드 시스템 및 기존의 흐름 챔버의. 멀티 채널 흐름 슬라이드 6 유리 지원 평면 지질 bilayers의 조립 허용 (A)이이 패널 표시 합니다. 각 bilayer 배달 및 출구 포트에 연결 되어 있습니다. 1 x 10 보다 작은5 셀 분석에 대 한 충분 한 있습니다. (B)이이 패널 1 유리 지원 평면 지질 bilayer의 조립 수 있도록 기존의 흐름 챔버 시스템을 보여 줍니다. 2 x 106 세포는 분석 필요 합니다. 다른 패널 표시 (C 및 D) 대표 TIRF 현미경 및 (E 와 F) 간섭 반사 현미경으로 confocal (IRM) 이미지에 의해 개발 된 인터페이스의 코드 혈액 파생 CD8 T 세포 활성화. 세포는 기존에 지질 bilayer ICAM-1 (300 분자/μ m2) 및 안티-CD3 항 체 (50 분자/μ m2) 인수 (C , E) 흐름 슬라이드 또는 (D 와 F)에 노출 됐다 비슷한 조건에서 흐름 시스템입니다. TIRF 현미경 검사 법 그리고 confocal irm 이미지는 각각 100 X 및 60 배율 목표 X를 사용 하 여 촬영. 성숙한 형태는 bilayers에 synapses T 세포의 비율 중 흐름 슬라이드에 내장 또는 기존의 흐름 챔버는 매우 유사 하지만 실험 75%에서 90% 사이 변화 한다. 모든 이미지, Cy 5 개 ICAM-1 분자 파란색; 표시 됩니다. 알 렉 사 Fluor-488-표시 된 안티-CD3 항 체; 녹색으로 표시 됩니다. 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a 항 체 CD107a에 바인딩된 빨간색; 표시 됩니다. 녹청;에 IRM 이미지 표시 됩니다. 그리고 스케일 바는 10 µ m 길이에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: T 세포-bilayer 인터페이스의 구조와 degranulation 림프절 및 주변 장치의 패턴 혈액 단 CD4+ T 세포. LNMC 또는 PBMC 파생 된 셀 정렬 했다 CD4 별도의+ T 세포 50 안티-CD3 항 체의 분자 / µ m2 및 ICAM-1 단백질의 300 분자 / µ m2 bilayers에 노출 됐다. 전지와 bilayers 간의 인터페이스는 TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데. 눈금 막대는 5 µ m. (A) T 세포-bilayer 인터페이스의 이러한 대표 이미지 T 세포-bilayer 인터페이스와 degranulation 패턴의 구조를 보여 줍니다. (B) 이러한 다이어그램 표시 LNMC PBMC 파생 CD4 표현+ T 세포 시 냅 스 인터페이스의 다른 구조와과 립 방출의 패턴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: T 세포-bilayer 인터페이스의 구조와 림프절 및 주변 degranulation의 활동의 동적 변화 혈액 단 CD4+ T 셀. (A)이이 패널 출시 알갱이의 모양과 T 세포-bilayer 인터페이스의 쇼 시간에 따라 변경 됩니다. 스케일 바는 5 µ m. (B)이이 패널 표시 LN 파생 CD4 하 여과 립 출시의 활동의 정량+ T 세포 (폐쇄 원형) 및 PBMC 파생 CD4+ T 세포 (오픈 원). 각 개별 원은 개별 셀에 의해 감지과 립 방출의 초연의 시간을 나타냅니다. 중간값과 IQR (interquartile 범위) 모든 분산형 플롯에 대 한 표시 됩니다. 맨-휘트니 테스트 T 셀의 지정 된 그룹 간의 차이점을 비교를 수행 했다. P < 0.05, * * P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 소설 기법 기존의 흐름 셀5 평면 bilayers 구축 하는 데 필요한 유사한 시 약을 활용 하 고 수행 기본 인간 T 세포-bilayer 인터페이스3,4의 이미징에 성공적으로 적용 될 수 있습니다. ,15. 기술은 형광 분자 사용법에 있는 뜻깊은 감소를 제공 하며 10-20는 흐름 셀 시스템5, 혈액 및 다른 조직에서 기본 인간 T 세포를 분석 하는 기회를 만들기에 비해 적은 T 세포 배.
이 연구에 사용 된 삽입 된 셀의 수를 사용 하 여 이미지 이미징 60 X 목표 필드 당 약 50 셀 수 있었습니다. 더 큰 농도 결과 셀 집계, 분석에 적합 하는 셀의 수를 감소. 우리 더 10-50 x, 삽입 된 셀의 수를 줄일 수 있지만 휴대폰 번호에의 한 셀이, 이미징 분야의 수 및 실험 설계를 따라 다릅니다. 일부 조사는 이전 bilayers 분석16셀의 유사한 수를 요구 하는 유리 바닥 오픈 챔버를 내장을 사용 했다. 그러나, 설명, 채널 높이 0.1-0.4 m m의 닫힌된 시스템 동기화 셀 첨부 파일 및 액체 증발의 위험 없이 T 세포 응답의 분석을 빠른 셀 침전 수 있습니다. 스티커 슬라이드 시스템 추가 채널 당 최대 3 개의 bilayers의 대형을 허용합니다. 따라서, 동일한 셀 샘플 물질로의 다른 성분과 독특한 bilayers에 셀 행동의 분석, 접착, 및 costimulatory 분자 사용 될 수 있습니다.
스티커 슬라이드와 성공적인 bilayer 형성에 대 한 coverslips의 조립 하는 동안 몇 가지 예방 조치를 취해야 한다. 특히,는 coverslips는 완전히 건조, 유리 표면 세척 절차 bilayer 동안 누설에 발생할 수는 작은 양의 액체에 왼쪽으로. 중요 한 것은, (3.4.1 단계에서와 같이) 누설을 피하기 위해 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게의 외부 반지와 접촉의 가장자리에 연결 된 coverslip도 필수적 이다. 그것은 또한 모든 채널의 엔트리 포트에 버블링 하지 않도록 하는 것이 중요입니다. 어떤 거품 채널 입력, 그들은 거의 제거 하 고 채널에서 bilayer를 망칠 수 없습니다. 마찬가지로, 그것은 어떤 빠른 pipetting, 때문에 액체의 난 류 수 있습니다 채널에 거품을 소개 하 고는 bilayer를 손상 하지 않도록 하는 것이 중요.
Cytolytic 알갱이의 릴리스는 T 세포 bilayer 인터페이스에서 CD107a의 외관에 의해 감지 됩니다. 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a 항 체의 fab 지구는 bilayers에 로드 하기 전에 CD8 T 세포에 추가 됩니다. TIRF 현미경 이용 지역 약 100를 밝히는 사라져 웨이브는 영상의 수직 해상도 증가 시킬 수 있도록 사라져 볼륨으로 정의 된 볼륨에서 bilayer 위의 nm. 37 ° C에서 사라져 볼륨 내에서 매우 빠르게 확산, 항 체 Fab 분류 감지 형광 신호를 생성 하지 않습니다. CD107a 막 단백질은 T에 나타납니다 용균성 분자와 세포 막에 포함 된 특수 리소좀의 막 융합 중 셀 문의 고유 위치에 표면. 팹 받을 당시에 CD107s 단백질에 바인딩됩니다. CD107a 단백질에 부착 된 형광 표시 Fab(s) TIRF 현미경 검사 법, T 세포 degranulation의 지표에 의해 밝은 형광 탐지를 생성 하는 움직이지 클러스터 형성.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작업을 지원 했다 마이클 R. Betts에 R01AI118694 NIH 교부 금에 의해 하위 수상 566950 유리 Sykulev 포함. 우리는 Sidney Kimmel 암 센터 Bioimaging 공유 리소스 그들의 탁월한 지원 위한 감사합니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
Casein | Sigma | C5890 | |
Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
DMSO | Sigma | D2650-5 | |
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
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