Summary
نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لكفاءة صنع إنسان-وهيتيروجرافتس بين البطيخ والقرع زجاجة، بالإضافة إلى أساليب أخذ عينات الأنسجة وتوليد البيانات، وتحليل البيانات، لتحقيق ميكرورناس الباردة المراعية.
Abstract
ميكرورناس (ميرناس) الذاتية الصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 20-24 nt، المعروف أن تلعب أدواراً هامة في تنمية النباتات والتكيف. وهناك تراكم أدلة تبين أن تتغير تعابير معينة ميرناس عند التطعيم، ممارسات زراعية التي يستعملها المزارعون عادة إلى تحسين المحاصيل التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه. زجاجة قرع المحصول أصلاً قادرة على مواجهة مناخ مقارنة بكثير من الأخرى والقرعيات الرئيسية، بما في ذلك البطيخ، وجعلها واحدة من أصول الأكثر استخداماً لهذا الأخير. النهوض بالتكنولوجيات التسلسل الفائق مؤخرا أتاح فرصاً كبيرة للتحقيق في ميرناس المراعية للبرد ومساهماتها في مزايا هيتيروجرافت؛ ومع ذلك، إجراءات تجريبية كافية شرطا مسبقاً لهذا الغرض. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لكفاءة توليد هومو-وهيتيروجرافتس بين البطيخ الباردة عرضه وزجاجة قرع البرد، بالإضافة إلى أساليب أخذ عينات الأنسجة وتوليد البيانات، وتحليل البيانات. الأساليب المقدمة مفيدة أيضا لأنظمة أخرى تطعيم النبات، باستجواب ميرنا الأنظمة تحت الضغوط البيئية المختلفة، مثل الحرارة والجفاف والملوحة.
Introduction
تطعيم طالما استخدمت كأسلوب زراعية لتحسين إنتاج المحاصيل والتسامح لتؤكد الحيوية وغير الحيوية1،،من23. في أنظمة هيتيروجرافتينج، أصول النخبة يمكن تعزيز امتصاص المياه والمواد الغذائية من النباتات وتعزيز المقاومة للعوامل الممرضة في التربة والحد من الآثار السلبية لسمية المعادن4،5، مما قد يضفي الطعوم معزز قوة النمو وزيادة تحمل الإجهاد البيئي. في كثير من الحالات، يمكن أيضا أن تؤثر هيتيروجرافتينج صفات الفاكهة في النباتات البستانية، مما يؤدي إلى نكهة الفاكهة المحسنة، وزيادة المحتوى من المركبات ذات الصلة بالصحة6،7. فقد وجد أن نقل المسافات الطويلة فيتوهورمونيس والكشف، الببتيدات والبروتينات بين أصول وسليل إليه أساسية لتحوير في النمو والتنمية إعادة برمجة سليل النباتات8،9 ،10. التطعيم قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات يشير إلى مسافات بعيدة والنقل فيما يتعلق بالتكيف البيئي11. تجارب التطعيم قوية خاصة للكشف عن الجزيئات المنقولة في تلقي الأنسجة أو ساب الأوعية الدموية، وتنشيط أو قمع الأهداف الجزيئية بسبب إشارة الإرسال12لا لبس فيها.
ترميز عدم الكشف، فئة كبيرة من الجيش الملكي النيبالي أن تمارس وظائفها التنظيمية الهامة في الخلايا، وأفيد أن تلعب دوراً في تسهيل تكيف النبات للإجهاد اللاأحيائية13. ميرناس الذاتية الصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 20-24 nt. الدراسات كشفت عن الدور التنظيمي ميرناس في مختلف جوانب أنشطة المصنع، مثل إطلاق النار على النمو، والوحشي جذر تشكيل14،،من1516، امتصاص المغذيات، والايض كبريتات والتوازن17، والردود على الحيوية وغير الحيوية التأكيد على18. في الآونة الأخيرة، تتعلق بالتعبير عن ميرناس وجيناتها الهدف الملح التسامح الإجهاد في شتلات خيار هيتيروجرافتيد19. في ترقيع إينتيرفاريتي من العنب، وجد أن تعتمد على النمط الوراثي20ردود التعبير ميرنا لإجهاد الجفاف.
التطور السريع، وانخفاض تكلفة تكنولوجيا التسلسل الفائق وفرت فرصة كبيرة لدراسة الأنظمة ميرنا في النباتات الخواص. بطيخ (سيترولوس صوفي [ثونب]. Mansf.)، ومحصولا هاما كوكوربيت نمت في جميع أنحاء العالم، وهو عرضه لدرجات الحرارة المنخفضة. زجاجة قرع (قرع التزيين [مولينا] (ستاندل.) كوكوربيت أكثر مرونة في مناخ يشيع استخدام المزارعين ل graft مع البطيخ. أن الهدف الأساسي للدراسة الحالية وضع معيار، تتسم بالكفاءة، وأسلوب مناسب لصنع هيتيروجرافتس بين البطيخ (سيترولوس صوفي [ثونب]. منصف). وزجاجة قرع (ستاندلقرع التزيين [مولينا]). كما يوفر هذا البروتوكول مخطط تجريبي تفصيلية والإجراءات التحليلية لدراسة تنظيم التعبيرات ميرنا بعد التطعيم، التي مفيدة للكشف عن الآليات الكامنة وراء مزايا هيتيروجرافتينج.
وتشمل المواد النباتية المستخدمة في هذه الدراسة الصنف البطيخ و landrace زجاجة قرع. هو البطيخ الأصناف المستنبطة الصنف تجاري مع عالية الغلة لكن عرضه لدرجات الحرارة المنخفضة. زجاجة قرع landrace أصول شعبية للتطعيم بالبطيخ، والخيار، وزجاجة قرع، سبب عن التسامح ممتازة لانخفاض درجات الحرارة21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-التعقيم وإنبات البذور
- للتعقيم السطحي، نقع بذور قرع الزجاجة في كوب 500 مل مليئة بالمياه في 58 درجة مئوية مع إثارة العرضية، حتى تنخفض درجة حرارة المياه إلى 40 درجة مئوية.
- وفي الوقت نفسه، وضع 3 كغم من التربة الخصبة في كيس نايلون، وتعقيم، اﻷوتوكﻻف في 120 ° C/0.5 الآلام والكروب الذهنية لمدة 20 دقيقة.
- الاحتفاظ بنقع بذور زجاجة قرع ح 4-5 أكثر مع لا التحريك.
- وبمجرد وصول الماء إلى درجة حرارة الغرفة، شطف بذور 2 x-x 3 مع الماء المقطر.
- استنزاف المياه الزائدة، وتسمح للبذور لتنبت في كيس شاش 28 درجة مئوية في دائرة نمو في الظلام.
- بعد الإنبات، تبذر البذور في الأواني البلاستيكية (6 سم في القطر) مملوءة بالتربة الخصبة معقمة.
- عندما وضعت الشتلات زجاجة قرع cotyledons مسطح اثنين، كرر الخطوات 1.1-1.3 مع بذور البطيخ.
ملاحظة: إدارة الوقت هذا يضمن تطابق أحجام سليل وأصول لتطعيم ناجحة.
2-النمو الشتلات وتطعيم
- زراعة الشتلات في دائرة نمو مع دورة الظلام 16-ح/8-h خفيفة، الحفاظ على درجة حرارة 28 درجة مئوية خلال النهار (الضوء) وإلى 22 درجة مئوية خلال الليل (الظلام). ري الشتلات عن طريق إضافة المياه 1 x يوميا في وقت متأخر من بعد الظهر.
- استخدام أسلوب قطع تطعيم22 جعل هيتيروجرافتس عندما شتلة من زجاجة قرع (أصول) في المرحلة الحقيقية-ورقة واحدة وكوتيليدونس البطيخ (سليل) ظهرت (غير مسطح حتى الآن).
- قطع هيبوكوتيلس شتلات البطيخ في سم 2-3 أدناه كوتيليدونس، ويترك الجزء العلوي من زجاجة قرع الشتلات في الموقع مباشرة فوق الحقيقية.
- استخدام مسواك لجعل ثقب في الجزء العلوي من الشتلات المشذبة زجاجة قرع. إدراج شتلات البطيخ قلصت في الثقوب شتلات زجاجة قرع جعل هيتيروجرافتس.
- استخدام أسلوب مماثل كما عرضت في الخطوة 2، 2 لجعل هوموجرافتس.
ملاحظة: تركيبات هومو-وهيتيروجرافتينج دائماً وينبغي في نفس الوقت (الشكل 1)، والذي، في هذه الحالة، ينتج ما يلي: البطيخ/زجاجة قرع (البنك الدولي، هيتيروجرافت) والبطيخ/البطيخ (رطب، هوموجرافت) وزجاجة قرع/bottle قرع (BB, هوموجرافت).
رقم 1: رسم توضيحي لتركيبات الاختلاس وهياكل النباتية المطعمة. البنك الدولي = البطيخ/زجاجة قرع هيتيروجرافتينج؛ ث ث = البطيخ البطيخ/هوموجرافتينج؛ BB = زجاجة قرع/زجاجة قرع هومو-تطعيم النبات؛ البنك الدولي-S = سليل أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/الزجاجة التي استخرجت؛ البنك الدولي-R = أصول أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/الزجاجة التي استخرجت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-بوستجرافتينج الإدارة والمعاملة الباردة، وأخذ العينات
- لف الشتلات المطعمة بأكياس البولي إثيلين الشفاف للحفاظ رطوبة عالية نسبيا والمحافظة عليها لمد 7 تحت ظروف بيئية خفيفة/8-ح 16-ح الظلام دورات، والحفاظ على درجة حرارة 28 درجة مئوية خلال النهار (الضوء) وإلى 22 درجة مئوية خلال الليل (الظلام).
- كشف في أكياس البولي إيثيلين شفاف في اليوم السابع. تنمو النباتات لاضافي 7-10 أيام تحت نفس الظروف.
- تقسيم الشتلات موحدة صحية إلى فريقين، أحدهما للعلاج البارد (أكد) وواحد لعنصر التحكم (غير أكد). لمجموعة المراقبة، تترك الشتلات في نفس الدائرة النمو (في 28 درجة مئوية) ح 48 إضافية، بينما للفريق أكد الباردة، ونقل الشتلات إلى دائرة نمو مع درجة حرارة ثابتة في 6 درجة مئوية، مع ظروف الضوء/الظلام كما هو موضح في الخطوة 2.1.
- عينة من أوراق سليل وأصول من الطعوم (الشكل 1). تجميد العينات فورا في النتروجين السائل وتخزينها في-70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4-المكتبة إعداد وترتيب الفائق
- نقل العينات المجمدة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل في نيتروجين سائل.
- إضافة حبة الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 5 ملم) لكل أنبوبة تحتوي على الأنسجة.
- مجانسة الأنسجة إلى مسحوق ناعم باستخدام الخالطون طاحونة حبة لمدة 30 ثانية.
- لكل تركيبة التطعيم، يأخذ كميات متساوية (0.1 g) من عينة الأرض من شتلات عشرة ومزجها في أنبوب الطرد مركزي 10 مل. إضافة مبلغ مناسب من جوانيديوم هيدروكلوريد كاشف (جدول المواد) استناداً إلى الشركة المصنعة المقترحات المقابلة لوزن الأنسجة.
- إزالة المجينية الحمض النووي التلوث عن طريق إضافة خالية من الجيش الملكي النيبالي الدناز أنا إلى 150 يو/مليلتر في 37 درجة مئوية ح 1.
- تحديد الإجمالي كمية الحمض النووي الريبي على نظام التفريد ميكروكابيلاري لضمان سلامة الحمض النووي الريبي رقم > 7.0.
ملاحظة: ورين > 7.0 يضمن نزاهة عالية من عينات الحمض النووي الريبي. - تعد مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام مجموعة أدوات تجارية (جدول المواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع كل عينة لبدء.
- ذوبان الجليد مكتبة تطبيع الكواشف والمحولات طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. اضطر الكشف الصغيرة مع محولات 3 'و 5' والوت وتنقية لها. ثم عكس نسخ 5 و 3 ' متصلة الكشف صغيرة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- أداء [بكر] تضخيم وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. تقييم نوعية وكمية للمكتبات كدنا استخدام نظام التفريد ميكروكابيلاري.
- تحميل 1 ميليلتر مكتبة الجيش الملكي النيبالي على نظام التفريد ميكروكابيلاري لضمان رين > 7.0.
- التسلسل في مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة على صك تسلسل الفائق كما هو موضح في مكان آخر من23.
5. ميرنا و "التنبؤ بالجينات المستهدفة"
- لكل تركيبة التطعيم، استخدام المصدر المفتوح سرنا جمعية الإسبرانتو العالمية منضدة الإصدار 2.4-مصنع24 لإزالة تسلسل رديئة النوعية وتقليم تسلسل محول من يقرأ الخام. تجاهل تسلسل التي تكون أصغر من 18 nt أو أكبر من 32 nt.
- قارن تسلسل "نظيفة" عالية الجودة لقاعدة بيانات المصدر المفتوح 11.0 رفام الاعتراف وإزالة ما يلي الرنا الريباسي والحمض الريبي النووي النقال، سنورنا وأخرى سنرناس.
- محاذاة على ما يلي المتبقية للجينوم مرجع باستخدام أداة محاذاة تسلسل قصيرة للقراءة25. مسموح لا عدم تطابق في هذه الخطوة.
ملاحظة: الجمعية الجينوم "97103" البطيخ V126 كان يستخدم لمحاذاة مع على ما يلي من سليل، والجمعية الجينوم "هرتز" زجاجة قرع V127 كانت تستخدم للقراءة من أصول. - مقارنة القراءات المتبقية ضد ميرناس ناضجة المعروفة في ميرباسي 22.0 مفتوحة المصدر28. وتصنف القراءات التي مثلى ميرناس المعروفة ميرناس مصانة.
- مقارنة التسلسلات التي لا تتطابق مع السلائف ميرنا المعروفة مع تسلسل الجينوم. استخدام خوارزمية29 ميرياب للكشف عن ميرناس رواية محتملة تحت الإعدادات الافتراضية.
6-التفاضلية التعبير والتحليل الجيني علم الوجود
- مقارنة مستويات التعبير ميرناس استناداً إلى التهم القراءة. ميرناس مع فتعتبر القيمة (اختبار فيشر الدقيق) < 0.05 وسجل مطلق2 قيمة > 2 الإعراب عن خلطات.
- استخدام العقاقير اليغنوكليوتيد موقع هدف اختيار أداة (تارجيتفيندير)30 للتنبؤ مرناس التكميلية المحتملة (ميرنا الجينات المستهدفة) إلى ميرناس أعرب عن خلطات تحت المعلمات الافتراضية.
- استخدام علم الوجود الجينات (الذهاب) الإثراء أداة تحليلية31 الكشف عن علم الجينات المستهدفة الوجود ميرنا (GO) أنماط تحت فعتبه قيمة 0.05 لدلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رقم 2: تعمل مختلف الطعوم في درجة حرارة الغرفة والظروف الباردة-وأكد- () هذا الفريق يظهر هومو-وشتلات هيتيروجرافتيد في درجة حرارة الغرفة كعنصر التحكم. (ب) يظهر هذا الفريق هومو-وشتلات هيتيروجرافتيد بعد 48 ساعة علاج البارد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
باستخدام الطريقة الموصوفة، حصلنا على نسبة نجاح عالية (بقاء) 98 في المائة للتطعيم. تعمل مختلف الطعوم في درجة حرارة الغرفة والظروف الباردة أكد مبينة في الشكل 2. بعد 48 ساعة معاملة الباردة، أظهرت نباتات البطيخ هوموجرافتيد تأخر النمو الواضح بأوراق ذابلة الشباب، بينما أظهرت النباتات هوموجرافتيد زجاجة قرع وهيتيروجرافتس قرع بطيخ/زجاجة نمو قوي أكثر بكثير. أي أعراض الأضرار التي لوحظت في أوراق هيتيروجرافتس، التي فاقت حتى النباتات هوموجرافتيد زجاجة قرع، حيث تضررت يترك أدنى صحيح. هذه النتائج تبين بوضوح في استفادة هيتيروجرافتس في منح التسامح الباردة.
تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة من مكتبات ثمانية أسفرت عن مجموعة القراءات الخام 258 مليون. بعد مراقبة النوعية (QC)، كان ما مجموعة 146 مليون ما يلي المقابلة لتسلسل فريدة من نوعها حوالي 30 مليون الاحتفاظ (الجدول 1). استناداً إلى هذه المجموعة من تسلسلات سرنا نظيفة، 323 ميرناس، بما في ذلك 10 المعروفة و 313 رواية ميرناس، وكانت توقع من زجاجة قرع، وقد تنبأ ميرناس الرواية المعروفة و 802 20 من watermelon.sRNAs 24 nt تتكون الفئة الأكبر من سرناس في تطعيم جميع مجموعات، بغض النظر عن درجة حرارة الغرفة أو ظروف أكد الباردة (الشكل 3).
| العلاج | مدونة | لا. ما يلي: | سرنا | |
| المجموع | فريدة من نوعها | |||
| ث ث-كورونا تشيكية | الخام | 30612962 | ||
| تنظيف | 19727501 | 3858868 | ||
| تعيين للجينوم | 19059359 | 3777952 | ||
| باء-كورونا تشيكية | الخام | 30845546 | ||
| كورونا تشيكية | تنظيف | 16832061 | 3787866 | |
| تعيين للجينوم | 16375142 | 3694388 | ||
| البنك الدولي-كورونا-S | الخام | 39492123 | ||
| تنظيف | 26783053 | 6319473 | ||
| تعيين للجينوم | 25919944 | 6132389 | ||
| البنك الدولي-كورونا-R | الخام | 23763619 | ||
| تنظيف | 10187791 | 1784447 | ||
| تعيين للجينوم | 8946929 | 1537867 | ||
| ث ث-CL | الخام | 27557577 | ||
| تنظيف | 17879038 | 3336242 | ||
| تعيين للجينوم | 17153763 | 3259960 | ||
| باء-CL | الخام | 29780991 | ||
| تنظيف | 13342206 | 3235570 | ||
| الباردة | تعيين للجينوم | 12949972 | 3164329 | |
| البنك الدولي-CL-S | الخام | 45708415 | ||
| تنظيف | 23071845 | 4310276 | ||
| تعيين للجينوم | 22363113 | 4224166 | ||
| البنك الدولي-CL-R | الخام | 30585408 | ||
| تنظيف | 19029266 | 3541729 | ||
| تعيين للجينوم | 17364239 | 3196106 | ||
الجدول 1: إحصاءات الكشف الصغيرة في مختلف الطعوم في درجة حرارة الغرفة أو تحت العلاج البارد.
رقم 3: توزيع حجم سرنا يقرأ في مختلف الطعوم. يظهر هذا الفريق () توزيع حجم سرنا يقرأ في هيتيروجرافتس تحت المراقبة أو الظروف الباردة. (ب) يظهر هذا الفريق توزيع حجم سرنا يقرأ في هوموجرافتس تحت المراقبة أو الظروف الباردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
عليه ح 48 المعاملة الباردة، كانت ميرناس 30 و 268 أعلى-ودوونريجولاتيد، على التوالي، في أوراق سليل في هيتيروجرافتس. وكان هذا في تناقض حاد مع النتائج في الأوراق من أصول، حيث 31 وميرناس فقط 12 كان أعلى-ودوونريجولاتيد، على التوالي (الشكل 4). في هوموجرافتس البطيخ/البطيخ، كانت ميرناس 64 و 83 يصل ودوونريجولاتيد، على التوالي. في هوموجرافتس القرع زجاجة قرع/زجاجة، كانت هذه الأرقام 30 و 28. بسبب هيتيروجرافتينج على ما يبدو، إعادة برمجة عميقة من التعبيرات ميرنا. الذهاب لتخصيب تحليلات الجينات المستهدفة المفترضة من ميرناس أعرب عن خلطات حددت شروط الذهاب المخصب 78 في سليل هيتيروجرافتس، مع 40 تصنيف في العمليات البيولوجية، 2 إلى المكونات الخلوية، و 36 في وظائف الجزيئية (الشكل 5). وجدنا أن عدة معروفة الذهاب شروط/مسارات المتصلة بالإجهاد اللاأحيائية والأحيائية/توصيل المقاومة وإشارة، على سبيل المثال، عملية تقويضي كيتين (الذهاب: 0006030، انتقل: 0006032)، مما يشير إلى مسار تنشيط الإيثيلين (الذهاب: 0009873)، بولياميني عملية السكروز (الذهاب: 0006596)، وتوصيل الإشارة من الفسفرة البروتين (الذهاب: 0009755)، متورطين. جنبا إلى جنب، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن downregulation ميرناس، بضبط وفرة النصوص للجينات المستهدفة، قد تمثل إليه هامة الكامنة وراء تعزيز التسامح الباردة. في الطعوم قرع بطيخ/زجاجة، هيتيروجرافت في حد ذاتها أثرا كبيرا على أنماط ميرنا التي تشكل مزايا الابتزاز.
الشكل 4: مقارنة بين أنماط ميرناس أعلى-ودوونريجولاتيد في استجابة للضغط البارد في مختلف الطعوم. البنك الدولي-S = سليل أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/الزجاجة التي استخرجت؛ البنك الدولي-R = أصول أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/الزجاجة التي استخرجت؛ ث ث = هوموجرافتس البطيخ/البطيخ؛ BB = هوموجرافتس القرع زجاجة قرع/زجاجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تذهب تحاليل تخصيب الجينات المستهدفة المفترضة من ميرناس خلطات المعرب عنها في سليل يترك من هيتيروجرافتس عند الضغط البارد. البنك الدولي-CL-S = سليل أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/زجاجة تحت العلاج الباردة؛ البنك الدولي-كورونا-S = سليل أوراق هيتيروجرافتس قرع بطيخ/زجاجة في درجة حرارة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، وصفت لنا بالتفصيل طريقة عالية الكفاءة واستنساخه لجعل إنسان-وهيتيروجرافتس بين البطيخ والقرع زجاجة. من السهل جداً أن تعمل هذا الأسلوب، يتطلب أي معدات خاصة، وعادة بمعدل بقاء عالية جداً للتطعيم. يمكن أيضا استخدام الأسلوب جعل الطعوم لغيرها والقرعيات، كما هو الحال بين البطيخ، والخيار، والقرع.
تجدر الإشارة إلى أن الحجم النسبي (العمر) من أصول وسليل أمر حاسم لجعل طعم نجاح (الخطوة 2، 2 من البروتوكول). لاحظنا، إذا كانت أصول المستخدمة كانت كبيرة جداً بالمقارنة مع سليل، الاتحاد الاختلاس بأنه أكثر صعوبة للنموذج تجويف تنبع سليل كان إلى حد ما. استناداً إلى بيانات البروتين أعمالنا السابقة31، إدراج سليل المطعمة ذاتيا وأصول المطعمة ذاتيا كعناصر تحكم ينصح بشدة (الخطوة 2، 3 من البروتوكول)، لأن، ثم أثر تطعيم الإصابات يمكن القضاء عليها إلى حد كبير.
كما يوفر هذا البروتوكول نظام تجريبي مفصلة وإجراءات تجريبية محددة للتحقيق الوفرة ميرناس في النظام هيتيروجرافتينج. هذه الطريقة ستكون مفيدة للدراسات أيضا في أنظمة أخرى تطعيم النبات للكشف عن آليات التنظيم ميرنا محلية أو بعيدة. في نتائج الممثل، ونحن التقرير التغييرات التعبير فقط ميرناس المحلية في سليل أو أصول ردا على درجة حرارة منخفضة. وقد أبرزت التقارير المتراكمة مشاركة الصغيرة مسافات طويلة نقل الجيش الملكي النيبالي في التغيرات المظهرية المتعلقة بالتطعيم. يمكن أيضا استخدام البروتوكول المعروضة هنا، الذي يجمع بين أساليب تحليل البيانات التطعيم والفائق، لتحليل انتقال ميرنا بين سليل وأصول. يستند المبدأ للتفريق ميرناس المنقولة من ميرناس المحلية التشابه مع تسلسل الجينوم المرجع (أي، ميرنا في سليل أن أكثر مثل الجينوم أصول يعتبر نقله من أصول، و العكس بالعكس).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة مودعة في بنك الجينات تحت رقم الانضمام SRP136842.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31772191) ومشروع البحث للمصلحة العامة في مقاطعة تشجيانغ (32027 ج 2017)، مفتاح العلم مشروع لتربية النباتات في تشجيانغ (2016 ج 02051) والبرنامج الوطني الدعم للمهنيين الشباب أرفع (المقصف).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
