Summary
Denne protokollen er ment å beskrive svin hepatocyte isolasjon og ex vivo gen levering å kurere modeller av metabolske sykdommer via autologous cellen transplantasjon. Selv om denne modellen har unike fordeler som favoriserer vellykket behandling, er programmet et relevant grunnlag for å ta flere sykdommer og indikasjoner.
Abstract
Genterapi er et ideelt valg å kurere mange medfødte feil av metabolism i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har blitt brukt med hell i behandlingen av mange blodkreft sykdommer hos mennesker, som deres bruk tilbyr stabile transgene uttrykket på grunn av vektoren evne til å integrere i vert genomet. Denne metoden viser bruk av ex vivo genterapi hepatocytes til en stor dyr modell av arvelige tyrosinemia type jeg. Denne prosessen består av 1) isolasjon primære hepatocytes fra autologous donor/mottaker dyret, 2) ex vivo gen levering via hepatocyte signaltransduksjon med lentiviral vektor og 3) autolog transplantasjon korrigert hepatocytes via portalen vene injeksjon. Suksessen til metoden generelt avhengig av effektiv og sterile fjerning av leveren resection, forsiktig håndtering av forbrukeravgift prøven for isolering av levedyktig hepatocytter tilstrekkelig for nytt engrafting, høy andel signaltransduksjon isolert cellene, og aseptiske kirurgiske prosedyrer gjennom å hindre infeksjon. Teknisk svikt på noen av disse trinnene vil føre lav yield hepatocytes levedyktig transduced for autolog transplantasjon eller infeksjon av donor/mottaker dyret. Gris modell av menneskelig type 1 arvelig tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilnærmingen er unikt mottakelig for slik metode, som selv en liten prosentandel av engraftment korrigert celler vil føre til repopulation i leveren sunn cellene basert på en kraftig selektiv fordel over native-syke hepatocytter. Selv om dette vekst valget ikke vil være sant for alle indikasjoner, denne tilnærmingen er et grunnlag for ekspansjon i andre indikasjoner og gir mulighet for manipulasjon av dette miljøet å ta flere sykdommer, både i leveren og utover, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighet for off-målet giftighet og tumorigenicity.
Introduction
Medfødte feil av metabolism av leveren er en familie av genetiske sykdommer som kollektivt påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange av disse sykdommene er ett gen mangler2 og funksjonelt kan kureres ved å introdusere én korrigert kopi av berørte genet til et tilstrekkelig antall hepatocytter3. Den faktiske prosenten av hepatocytter som må rettes varierer fra sykdom4 , og er svært avhengig av typen protein det koder, for eksempel utskilles proteiner versus cytoplasmatiske. I de fleste tilfeller er effekten av behandling for metabolsk sykdom lett assayed gjennom tilstedeværelse av biomarkers ofte tilgjengelig i sirkulasjon.
HT-1 er en medfødt feil av metabolismen av leveren som skyldes en feil i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, siste enzymatisk trinn i tyrosin metabolisme6. FAH mangel fører til bygge av giftige metabolitter i leveren som kan forårsake akutt leversvikt og død eller i kronisk form av sykdommen kan føre til skrumplever og hepatocellulært karsinom. Sykdommen er klinisk styrt av administrasjonen av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lite molekyl inhibitor av et enzym oppstrøms av FAH i tyrosin metabolisme. Sykdommen gir et ideelt miljø å teste gene terapi metoder, som vellykket korrigering av selv en liten antallet av hepatocytter vil resultere i repopulation i hele leveren med korrigert celler i både små og store dyr modeller 7 , 8. Dette skjer fordi korrigert celler har en dyp overlevelse fordel over uncorrected celler på grunn av opphopning av giftige metabolitter i sistnevnte. Tap av uncorrected hepatocytter tillater selektiv ekspansjon korrigert hepatocytes samsvar med regenerativ kapasiteten til leveren. Behandling kan lett følges ved å måle nedgangen i sirkulerende tyrosin og succinylacetone nivåer etter transplantasjon.
For å rettferdiggjøre invasiv art på prosedyren, som inneholder en delvis hepatectomy, må målet av denne tilnærmingen være en holdbar kur. Derfor brukes replikering inkompetente lentiviral vektorer fordi de vil stabilt integrere i hepatocyte genomet9. sikre levering av korrigert genet til alle datter celler som leveren vokser og utvides for å erstatte rask tap uncorrected celler. Dette er en fordel over adeno assosiert virus (AAV) vektorer, som hovedsakelig finnes som episomes bare kan bli sendt til en enkeltcelle datter under mitose10 og dermed miste noen effekt av terapi i løpet av uker.
Selv om en økende mengde litteratur støtter sikkerheten til lentivirus11, bekymringer over kontrollere gentoksisk hendelser ved å begrense Albin på verten cellene til et kontrollert i vitro miljø. Gratis vector er aldri systemisk introdusert til verten når denne metoden utføres, begrense eksponering for hepatocytter som vil bli re-introdusert med autolog transplantasjon via portalen blodåre.
Denne rapporten beskriver metoden for den kirurgiske og ex vivo prosedyrer brukes til å isolere hepatocytter for gene terapi ex vivo og påfølgende autolog transplantasjon12 for behandling av HT-1 gris8. Den fullstendige prosessen inkluderer 1) en delvis hepatectomy som fungerer som en kilde til hepatocytter og vekst stimulans for vertens leveren, 2) isolering av hepatocytter fra forbrukeravgift leveren etterfulgt av ex vivo genet korreksjon, og til slutt 3) gjeninnføring av den korrigert hepatocytter tilbake til verten. Metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noen endring, men bare FAH dårlig gris13 vil ha fordelen av selektiv miljøet for korrigert hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer blir ble utført institusjonelle retningslinjer og gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) før studie oppførsel. Prosedyrene som er beskrevet her ble utført på mannlige og kvinnelige store hvite jorbruk pigs (50% Landrace/50% store hvite genetisk bakgrunn) opp til 3 måneder gammel som anses sunt og passer for kirurgi. Dyrene ligger sosialt med mindre betraktes som inkompatible av institusjonelle veterinary bekymre ansatte. Dyr er matet riktig nivå av chow to ganger daglig og observerte for klinisk underskriver av omsorg ansatte minst én gang daglig.
1. forberedelse til operasjon
- Administrere 5 mg/kg telazol og 2 mg/kg xylazine intramuskulært å indusere sedasjon. Administrere buprenorfin SR subcutaneously på en dose 0,18 mg/kg for postoperativ analgesi (forventet analgesi fra denne dose vil være opp til 72 h). Manuelt når dyret for Svar å bekrefte sedasjon.
- Når bedøvet, setter du inn en intravenøs kateter i en ytre øret stemning for farmakologisk tilgang.
- Administrere intravenøs 25 mg/kg cefazolin og intramuskulær 5 mg/kg av ceftiofur pre-operatively.
- Administrere normal saline intravenøst å holde blodtrykk og hjertefrekvens innenfor normale fysiologiske grenser i hele denne prosedyren.
- Plass en orogastric rør for å dekomprimere magen. Utføre endotracheal intubasjon med en passende størrelse endotracheal tube bekrefter riktig plassering ved å komprimere brystet manuelt for å oppdage utpust og deretter mekanisk ventilere dyret med 1-3% isoflurane.
- Plasser elektrokardiogram (ECG) fører, blodtrykk mansjett, temperatur probe og puls-oksymeter å overvåke og registrere vitale. Plassere dyret i supine posisjon, skrubbe magen fra ribbeinet buret til bekkenet med betadine og drapere sterilely.
- Ventilere temaet med 1-3% isoflurane under prosedyren for å opprettholde et kirurgisk fly av anestesi. Fortsette å overvåke vitale for endringer og justere isoflurane tilsvarende for å opprettholde hjertefrekvens før snitt nivåer hvis blodtrykk drops, redusere isoflurane og starte institusjonelt godkjent agenter å gjenopprette vitalitet, som intravenøs adrenalin.
- Registrerer hjertefrekvensen, pustefrekvens, blodtrykk og kroppstemperatur på en kirurgisk prosedyrepost til å spore og vedlikeholde dyrevelferd som institusjon-spesifikke politikken for å sikre samsvar med store dyrevelferd standarder.
2. laparoskopisk delvis Hepatectomy
- Utføre porthastighet området post ved hjelp av en åpen Calson teknikk cephalad til navlen. Når peritoneum er visualisert, trygt innføre en 12 mm trocar i bukhulen. Passere en 5 mm, 30°, omfang gjennom denne porten.
- Insufflate magen med CO2 til 15 mmHg. Under direkte visualisering med laparoskopisk kameraet, plasserer du to ekstra 5 mm porter triangulating på den venstre lateral flik av leveren. Eksakt plassering av portene avhenger av størrelsen og anatomi av dyret.
- På dette punktet, plass laparoscope i en av 5 mm portene.
- Identifisere den venstre laterale delen av leveren ved store kom ut av venstre lobe. Denne sprekk skiller medisinsk og venstre lateral segmentene. Sikre portalen strukturer samt hepatic venen langs denne sprekk benytter et kirurgisk stiftemaskin (se Tabell for materiale). Mudderbunn parenchyma gjennom denne sprekk med sekvensiell firings fra går med 60, 45 eller 30 mm lange vaskulær laster.
- Når parenchymal reseksjon er fullført, vurdere rest leveren for å sikre tilstrekkelig hemostasen. Control blødninger fra parenchyma med cautery eller Sutur.
- Hente leveren delen bruke endoskopisk graspers og en endoskopisk vev henting bag.
- Fjern portene og stenger incision 12 mm havn i tre lag med avbrutt størrelse 0 Sutur for midtlinjen fascia og en kjører 2-0 Sutur for dypt dermal laget en kjører 4-0 Sutur for subcuticular-laget. 5 mm portene kan være stengt i ett lag med 2-0.
- Plass en bakteriefri bandasje på incisions (se Tabell for materiale).
- Når celler vil være klar i mindre enn 4 timer, opprettholde dyrene under narkose post-operatively inntil autotransplantation.
- Alternativt, hvis cellen manipulasjoner krever lengre perioder (som at hepatocyte spheroids eller lengre signaltransduksjon/utvalg perioder basert på individ søknadene av denne metoden) tillate dyr å gjenopprette fra anestesi og gjenta den anestesi induksjon trinn før autotransplantation når cellene er klar.
3. hepatocyte isolasjon
- Koble en peristaltiske pumpe perfusjon skal levere varme spredning løsninger (vedlikeholdes i 43 ° C vannbad) til katetre plasseres i store synlige blodårene i delen lever slik at løsningen temperaturen er 38 ° C på introduksjon til vev. Alle rør, utstyr og løsninger må opprettholdes sterilt å sikre cellene er egnet for transplantasjon.
- Prime pumpen og rør med Per II til en stopcock plassert for å veksle mellom Per jeg og Per II leveranse til vev. Bytte av stopcock til Per jeg posisjon og fyll resten av slangen settet, fylle en innebygd boble felle helt for å hindre introdusere luftbobler i vevet.
- Forberede en ren tverrstilt kuttet vinkelrett til nedsatt sirkulasjon å avsløre tverrsnitt av portalen blodåre, og lever vener for catheterization.
- Catheterize tilgjengelig eksponert vener med en tettsittende kateter for å unngå perfusate. Cannulate minst 1 portal og 1 hepatic venen å sikre tilstrekkelig perfusjon i vevet.
- Kontroller at catheter(s) er primet fri luft før du plasserer kateter i en blodåre.
- Perfuse med varm Per jeg på 100 mL/min, flytte stikkontakt røret fra venen til vene 30 sekunder til 1 min. syklus gjennom alle tilgjengelige årer i 15-20 min. Under Per jeg angi infusjon, en evakuering rør tømme prosedyren skuffen i avfallsbeholderen under vakuum.
- Bytt til Per II på 100 mL/min, sykling gjennom årene som med Per I totalt 30 min. Under Per II, bruke en retur pumpe for å resirkulere Per II tilbake til reservoaret re administrasjonen å spare forberedelse av aktiv enzym. Satt tilbake pumpen til mindre enn utløp pumpen (dvs. 94 mL/min), være forsiktig med å returnere høy til kilde flasken.
- Hvis leveren kapselen bryter, kan denne gangen bli redusert.
- Hvis leveren ikke blir fullt fordøyd (ikke forblir dimpled med lett fokal press) en ekstra 5 minutter av perfusjon kan utføres.
- Noen ganger (ca hvert 5 minutt) dokument overflatetemperatur boble felle og/eller lever slik hepatocytter ikke blir kaldt. Hvis leveren blir kaldt (< 35 ° C) øke varmen av vannbad gjenopprette leveren temperaturen nærmere til 38 ° C. Leveren bør blanche mens perfusjonsmåling pågår.
- Fjerne leveren sterilt plate eller Petriskål for transport til celle kultur hette. Dekk sterile feltet med et sterilt drapere å opprettholde integritet under hepatocyte behandling.
- Vise delen lever fra sterilt drapere og senke leveren med kaldt hepatocyte vask media (HWM). Forstyrre kapselen ved å dra saks øverst. Bruk sterile hansken, forsiktig massasje leveren å løslate av hepatocytter til medium.
- Filtrere HWM som inneholder hepatocytter gjennom sterilt gasbind i store (~ 200 mL) sentrifuger flasker. Vaske hepatocytter gjennom fremgangsmåten i tre eksemplarer, kombinere i celle pellet fra flere flasker etter den første rørets (ettersom gjelder):
- Sentrifuger på 50 x g, 5 min, 4 ° C.
- Sug opp og resuspend i 150 mL av HWM.
- La pellet i HWM etter 3rd vask.
- Telle celle konsentrasjon bruke en hemocytometer eller en annen enhet, som er tilgjengelig. Disse cellene er nå klar for ex vivo manipulasjon av interesse, inkludert genterapi, celle sortering eller andre spesialisering før autotransplantation. Siste bind i HWM kan justeres for å målrette en bestemt konsentrasjon (celler/mL).
4. hepatocyte signaltransduksjon
- Resuspend hepatocytter i media (Dulbeccos endret eagle medium [DMEM], 10% fosterets bovin serum [FBS], Penicillin-Streptomycin, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre [HEPES], deksametason, epidermal vekstfaktor [EGF] og NTBC) på 1 – 2 millioner celler per mL i et konisk rør på is.
- Tine lentiviral vektor ved romtemperatur og legge til konisk tube på isen på målet 20 mangfold av infeksjon (MOI) binde cellene. Rotere cellene på 4 ° C på 10 rpm for 90 min binde viral vektoren til celleoverflaten.
- Overføre rør til 37 ° C for 30-40 min. Inverter å blande hver 5 minutter for å lette vektoren transducing bundet cellene.
- Sentrifuge cellene på 50 x g ved 4 ° C i 4 min. Resuspend celle pellet i saltvann i ønsket konsentrasjon på is. Gjenta denne vask slik fjerning av enhver ubundet vektor fra forberedelse.
- Hvis mulig, plate tilstrekkelig dele celler (dvs. 500.000 celler per brønn i en 6 vel celle kultur plate) etter levedyktighet, vedheft, signaltransduksjon effektivitet, osv.
Merk: Det er ofte ikke mulig å vurdere disse parameterne før autotransplantation, spesielt for samme dag prosedyrer. For eksempel ansatt prosedyren beskrevet her en ukodede Fah cDNA under kontroll av alfa-1 antitrypsin lever-spesifikke selskapet, som ikke var lett assayable i hepatocytter før transplantasjon. Men kan disse belagt cellene bli assayed etter autotransplantation som en indikator på suksessen til signaltransduksjon (dvs. via Western blotting) eller en prediktor for generelle suksessen av prosedyren.
5. hepatocyte transplantasjon
- Identifisere portalen blodåre via ultralyd bruker en 2 til 5 MHz svinger. Direkte en 18 G, 5 tommer p mot viktigste portalen blodåre proksimale til sin bifurkasjonen.
- Starte langsom manuell infusjon av opp 1 x 109 hepatocytter (ca 10 g) bruker en sprøyte. Overvåke portalen press under transplantasjon ved hjelp av en infusjon kateter.
- Hvis portalen press øker mer enn 8 mmHg over grunnlinjen, stoppe infusjonen og la press for å gå tilbake til opprinnelige nivåer.
- Hvis portalen press ikke tilbake til opprinnelig etter pause infusjon i fem minutter, stoppe infusjonen.
- Etter transplantasjon og kateter fjerning, kan du bruke ultralyd å evaluere etter trombotiske hendelser og videresende flyt i portalen blodåre.
6. postoperative gjenvinning og vedlikehold
- Flytt underlagt et riktig område og observere til dyret er fullt oppegående, overvåking hjertefrekvens, oksygenmetning og kroppstemperatur hver 15-30 min. opprettholde kroppstemperatur med varme tepper eller en luft-oppvarmet brytes, etter behov.
- Administrere 1 mg/kg omeprazole gjennom munnen daglig (gjennom slutten av studien) for å redusere sjansene for mage sår som kan oppstå med utbrudd av inappetence.
- Postoperatively, dyret overvåkes nøye av lab og veterinary stab og vanligvis krever ikke ekstra smertestillende medikamenter atskilt fra pre-operative buprenorfin dosen. Hvis tegn på distress/smerte er observert av kvalifisert veterinær omsorg ansatte (snitt vokter, inappetence, apati), kan anti-inflammatoriske midler (dvs. Carprofen) administreres.
7. oppskrifter
- Se tabell 1 for oppskrifter i denne protokollen.
| Reagens | HWM | Reagens | Per jeg (10 x) | Per II (10 x) |
| Williams'-E pulver (finans) | 10.8 | NaCl (finans) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (finans) | 2.2 | KCl (finans) | 5 | 5 |
| HEPES (finans) | 2.6 | HEPES (finans) | 24 | 240 |
| Penn/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (finans) | 9.5 | - |
| Fosterets bovin Serum (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-cystein | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N--vekselstrøm, g/L) | ||
| Nitroglyserin (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2t2O (finans) | - | 7 | ||
| Collagenase D (mg/mL) | - | 0,2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
Tabell 1: Oppskrifter for løsninger brukes Hepatocyte isolert fra lever deler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leveren resection og autolog transplantasjon er representert skjematisk i figur 1. I en representant kohort av 5 griser som gjennomgikk hepatic resection, de fleste hadde avkastning av > 1 x 109 hepatocytter med ca 80% levedyktighet (tabell 2), sørger for mange celler for alle typer ønsket manipulasjoner, inkludert gen terapi. Etterfølgende kultur av ikke-transplanted delen forberedt hepatocytes fra hver av de 5 griser viste god levedyktighet og vedheft, med typiske hepatocyte morfologi 46 timer etter signaltransduksjon og første plating (figur 2). Disse resultatene er representant for en vellykket forberedelse, mens dårlige resultater ville angis med et lavt antall celler, levedyktighet eller minimal etterlevelse av celler i en monolayer.
En leveren biopsi før behandling av Fah- / - grisen viser ingen uttrykk av FAH via immunohistochemistry (Figur 3). Første engraftment vil variere etter mengden celler gjeninnføres under transplantasjon. Signaltransduksjon frekvenser av svin hepatocytter i vitro bruker lentivirus på en MOI av 10 TU/hepatocyte er vanligvis 70-100%. Engrafted cellene utvide clonally i Fah- / - leveren til hele leveren er nytt av korrigert cellene. Representant biopsier 2, 6 og 12 måneder viser en tidslinje over FAH-positive celleutvidelse, som er vanligvis full på 12 måneder etter transplantasjon (Figur 3). Med en lav prosentandel av engraftment forventes å til slutt gjenbefolke leveren, selv om selve første engraftment priser ikke var evaluert i dette eksperimentet.
Griser er nøye overvåket etter transplantasjon for vektøkning, manglende trives er et tegn på at ikke nok rettet hepatocytter finnes. I dette tilfellet syklet dyr på NTBC etter behov til korrigert hepatocyte befolkningen er tilstrekkelig til at fullstendig avvenning fra stoffet. Evaluering av sirkulerende biomarkers skaffer lett adgang å følge terapi. Når et dyr har oppnådd ca 20% repopulation korrigert hepatocytes i leveren, tyrosin og succinylacetone nivåer normaliserer sammenlignet med vill-type dyr (figur 4A). Videre viser under-behandlet eller ubehandlet Fah- / - grisen lignende fibrotiske lever endringer sett i berørte mennesker, som kan være etterfulgt av Masson's trichrome farging av føljetong biopsier8. Surrogat markører for pågående skader kan bli vurdert av assaying sirkulerende leverenzymer, som aspartate aminotransferase og alkalisk fosfatase. Mens uncorrected dyr viser betydelig høyde i begge parameterne sammenlignet med vill type dyr, returnerer ex vivo genterapi disse serum verdiene til normal (figur 4B og 4 C). Til slutt, generell leveren metabolske helse blir forstyrret i ubehandlet Fah- / - gris, som indikert av høyder i sirkulerende ammoniakk. Repopulation i leveren korrigert cellene gjenoppretter vill-type nivåer av ammoniakk (Figur 4 d).
Figur 1: Hepatectomy og autolog transplantasjon. (Med klokken fra toppen) En delvis leveren resection utføres på temaet å gi en kilde av hepatocytter og stimulere leveren gjenfødelse. Hepatocytter er isolert fra resected leveren (blå celler), transduced ex vivo med lentiviral vektoren som inneholder transgene rundt (brun celler), og deretter transduced cellene transplanteres autologously tilbake til kilden dyret via portalen blodåre injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: primære gris hepatocytter fra lever inndelinger. Hepatocytter ble kultivert fra lever resections fra 5 forskjellige griser, transduced med lentiviral vektor og lov til å vokse i 48 timer å demonstrere morfologi, levedyktighet, renhet og vedheft til kultur retter. Disse i vitro kvalitative vurderinger tjene som surrogat indikatorer for sannsynligheten for vellykket engraftment i vivo for hvert preparat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Korrigert hepatocytter gjenbefolke Fah- / - gris leveren. FAH immunohistochemistry fra lever biopsier 0, 2, 6 og 12 måneder etter ex vivo genterapi autologous hepatocytes. Ubehandlet Fah- / - griser viser ingen FAH-positive celler i leveren (A). To måneder etter transplantasjon (B), er personlige foci hepatocytes FAH positiv sett, som deretter gjennomgå utvidelse å erstatte 50 – 60% av leveren på 6 måneder (C) etterfulgt av fullstendig utskifting, sett på 12 måneder (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Serum biokjemi 10 måneder post ex vivo genterapi i Fah - / - griser. 10 måneder etter terapi, tyrosin, aspartate aminotransferase14, alkalisk fosfatase (ALP) og ammoniakken høyder er betydelig lavere enn ubehandlet FAH mangelfull dyr og er utvisket fra vill-type nivåer. Dataene ble analysert for betydning ved hjelp av Mann-Whitney U testen (p verdiene som presenteres). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gris | Totalt antall celler (x 106) | Live celler (x 106) | Levedyktighet (%) |
| 1 | 1,381 | 1,160 | 84 |
| 2 | 1000 | 770 | 77 |
| 3 | 1,213 | 995 | 82 |
| 4 | 789 | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| Gjennomsnitt | 1,140 | 914 | 80 |
| St Dev | 64° | 194 | 5 |
Tabell 2: Representative hepatocyte resultater fra primære isolasjoner fra 5 griser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten beskriver en ex vivo autologous gene terapi tilnærming for å kurere en porcine modell av HT-1. Det innebærer en delvis hepatectomy, etterfulgt av ex vivo hepatocyte isolasjon og signaltransduksjon isolert hepatocytes med lenti virus bærer den korrigerende transgene. Korrigert autologous hepatocytter er deretter transplanted til FAH mangelfull dyret til portalen blodåre8. Selv om metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noe modifisering, har FAH dårlig grisen den unike fordelen av et svært selektive miljø for korrigert celler13,15. Denne metoden er en effektiv kur for HT-1, som dosed dyr viser NTBC uavhengig vekst med normalisering biokjemisk målt metabolitter og provoserende leveren biomarkers, forebygging av skrumplever og HCC og komplett reversering av tidlig fibrose sett med NTBC sykling. Videre en nyere studie som involverer omfattende histologiske analyse har vist ingen synlig uncorrected celler, fibrose, skrumplever eller tumorigenicity 3 år stolpe terapi (manuskript i review). Imidlertid kan nytten av FAH null bakgrunnen tjene som et verktøy til å tillate evaluering av en rekke avhør i hepatocyte fysiologi og sykdom indikasjoner utover HT-1.
Suksess prosedyren kan evalueres på antall sykluser av NTBC kreves før emnet kan være helt Avvent fra denne beskyttende stoff. I mange iterasjoner med denne modellen og andre små dyr modeller av HT-1 er ca 20% korreksjon nødvendig før NTBC uavhengig vekst er oppnådd. Flere sykling med NTBC er et tegn på dårlig første engraftment/levedyktighet, avansert leversykdom ved første engraftment, eller dårlig transgene uttrykk, selv om andre faktorer kan også spille en rolle. Spesifikke biokjemiske markører for leveren helse (AST, ALT og ammoniakk) er lett tilgjengelig og få innsikt i omfanget av korrigert hepatocyte ekspansjon, men endelig bekreftelse av fenotypiske kur er best bevist ved normalisering av serum tyrosin og succinylacetone og histologic bekreftelse av FAH-uttrykke hepatocytter i fravær av fibrose. Dette oppnås når leveren har vært nytt med korrigert hepatocytter.
Effekten av fremgangsmåten avhengig tettest integriteten av hepatocytter, som må vedlikeholdes sterile og levedyktig gjennom hele isolasjon, signaltransduksjon og transplantasjon prosessen. Gjeninnføring av ikke-levedyktige eller uncorrected hepatocytter vil ikke redde fenotypen, og en mislykket prosedyre kan ta måneder emnet observasjon å bekrefte.
I denne modellen er god transgene uttrykket av funksjonelle FAH enzymet et minstekrav for leveren repopulation. Lentivirus er bare en måte å levere en effektiv kopi av av transgene. Denne metoden vil tillate muligheten for bruk av andre leveringssystemer inkludert ikke-viral systemer og de rettet mot redigering bestemt genomisk feilen. Til slutt, denne modellen vil tillate et stort utvalg av muligheter, inkludert korreksjon av andre defekter i den FAH mangelfulle bioreactor. Så lenge transplantert cellen uttrykker en funksjonell FAH enzym, vil også alle andre modifisering av celler ex vivo overføres. Dette gir en av medfødte feil av metabolism i leveren rettes i FAH- / - bakgrunnen. Som utvidelse av korrigert hepatocytter repopulates slutt leveren, kan aktuelle tallene hepatocytes for noen indikasjon på sykdommen oppnås, som understreker verdien av denne modellen og prosedyren som en grunnleggende vitenskap og prekliniske terapi modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Duane Meixner for kompetanse i å utføre i portalen blodåre injeksjon, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske prosedyrene. Dette arbeidet ble støttet av barnas Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medisin Minnesota. R.D.H. ble finansiert gjennom en NIH K01 DK106056 pris og et Mayo Clinic for regenerativ medisin karriere Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
