Summary
Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.
Abstract
Gentherapie is een ideale keuze om te genezen van vele aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever. Ex-vivo, lentivirale vectoren hebben met succes gebruikt in de behandeling van vele hematopoietische ziekten bij de mens, als hun gebruik biedt stabiele transgenic expressie als gevolg van de vector vermogen om te integreren in het genoom van de gastheer. Deze methode blijkt de toepassing van ex vivo gentherapie van hepatocyten op een grote diermodel van erfelijke tyrosinemia type ik. Dit proces bestaat uit 1) isolatie van primaire hepatocyten van het autologe donor/ontvanger dier, 2) ex vivo gene levering via hepatocyte transductie met een lentivirale vector, en 3) autologe transplantatie van gecorrigeerde hepatocyten via portaal veneuze injectie. Succes van de methode is in het algemeen afhankelijk van efficiënte en steriele verwijdering van de lever resectie, zorgvuldige behandeling van het verwijderde exemplaar voor isolatie van levensvatbare hepatocyten voldoende voor opnieuw enten, hoge-percentage transductie van de geïsoleerde cellen, en aseptische chirurgische procedures hele om infectie te voorkomen. Technische storing op elk van deze stappen resulteert in lage rendement van levensvatbare getransduceerde hepatocyten voor autologe transplantatie of infectie van het dier donor/ontvanger. Het varken model van menselijke type 1 erfelijke tyrosinemia (HT-1) gekozen voor deze aanpak is uniek vatbaar voor dergelijke methode, aangezien zelfs een klein percentage van de engraftment van de gecorrigeerde cellen tot herbevolking van de lever met gezonde cellen op basis van een krachtige leiden zullen selectief voordeel ten opzichte van native-zieke hepatocyten. Hoewel de selectie van deze groei niet voor alle indicaties gelden zal, deze benadering is een Stichting voor uitbreiding naar andere indicaties en zorgt voor manipulatie van deze omgeving te pakken van bijkomende ziekten, zowel binnen de lever en daarbuiten, terwijl controle voor blootstelling aan virale vector en de mogelijkheid voor off-target toxiciteit en tumorigeniciteit.
Introduction
Aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever is een familie van genetische ziekten die collectief maar liefst 1 in 800 levendgeborenen1 beïnvloeden. Veel van deze ziekten zijn enkel gen gebreken2 en functioneel kunnen worden genezen door de invoering van een enkele gecorrigeerde kopie van het betrokken gen in een voldoende aantal hepatocyten3. Het werkelijke percentage van hepatocyten die moeten worden gecorrigeerd door de ziekte4 varieert en is grotendeels afhankelijk van de aard van het eiwit het codeert, bijvoorbeeld, uitgescheiden eiwitten versus cytoplasmatische. In de meeste gevallen is de werkzaamheid van een behandeling van metabole ziekte gemakkelijk vehiculumcontrolegroep door de aanwezigheid van biomarkers vaak beschikbaar in de omloop.
HT-1 is een aangeboren afwijking van de stofwisseling van de lever die uit een defect in fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, de laatste enzymatische stap in tyrosine metabolisme6 voortvloeit. FAH-deficiëntie leidt tot de ophoping van giftige metabolieten in de lever die kan leiden tot acute insufficiëntie van de lever en dood of in de chronische vorm van de ziekte kan leiden tot levercirrose en hepatocellulaire carcinoom. De ziekte is klinisch beheerd door toediening van 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), een klein molecuul remmers van het enzym stroomopwaarts van FAH in het metabolisme van tyrosine. De ziekte biedt een ideale omgeving waarin aan gene therapie testmethoden, zoals succesvolle correctie van zelfs een klein aantal hepatocyten uiteindelijk in de herbevolking van de gehele lever met gecorrigeerde cellen in zowel de grote als de kleine dierlijke modellen resulteren zal 7 , 8. Dit komt doordat gecorrigeerd cellen hebben een diepe overleven voordeel ten opzichte van niet-gecorrigeerde cellen als gevolg van de accumulatie van toxische metabolieten in de laatste. Het verlies van niet-gecorrigeerde hepatocyten zorgt voor selectieve uitbreiding van gecorrigeerde hepatocyten consistent met het regeneratief vermogen van de lever. Behandeling kan gemakkelijk worden gevolgd door het meten van de afname van de circulerende tyrosine en succinylacetone niveaus na transplantatie.
Ter rechtvaardiging van het invasieve karakter van de procedure, waaronder een gedeeltelijke hepatectomy, moet het doel van deze aanpak een duurzaam genezen. Daarom, replicatie incompetente lentivirale vectoren worden gebruikt omdat zij stabiel in de hepatocyte genoom9zal integreren. waarborgen van de levering van de gecorrigeerde gen aan alle dochtercellen als de lever groeit en breidt ter vervanging van het snelle verlies van niet-gecorrigeerde cellen. Dit is gunstig over adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren, die voornamelijk bestaan als episomes die alleen kunnen worden doorgegeven aan een eencellige dochter tijdens de mitose10 waarbij u verliest geen effect van de therapie in een kwestie van weken.
Hoewel een groeiend lichaam van literatuur ondersteunt de veiligheidvan lentivirus11, zorgen zijn genotoxisch gebeurtenissen verzacht door de signaaltransductie van cellen van de gastheer voor een gecontroleerde in vitro milieu te beperken. Gratis vector wordt nooit systemisch geïntroduceerd op de host wanneer deze methode wordt uitgevoerd, beperking van de blootstelling aan de hepatocyten die weer opgenomen met autologe transplantatie via de portal ader worden zal.
Dit verslag beschrijft de methode van de chirurgische en ex vivo procedures gebruikt om hepatocyten voor gene therapie ex vivo en latere autologe transplantatie12 voor de behandeling van de HT-1 varken8te isoleren. Het volledige proces omvat 1) een gedeeltelijke hepatectomy dat als een bron van hepatocyten en een stimulans van de groei voor de host de lever, 2) isolatie van hepatocyten uit de verwijderde lever gevolgd door ex vivo gene correctie, en tenslotte 3) herinvoering van fungeert de gecorrigeerde hepatocyten terug naar de host. De beschreven methode is van toepassing op alle grote dierlijke modellen met enige aanpassing, maar alleen de FAH-deficiënte varken13 zal hebben het voordeel van de selectieve omgeving voor gecorrigeerde hepatocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele en herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) voorafgaand aan de studie gedrag. Hier beschreven procedures werden uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke grote witte boerderij varkens (50% Landrace/50% Large Wit genetische achtergrond) omhoog, tot 3 maanden oud die gezond en geschikt voor chirurgie worden geacht. Dieren zijn sociaal gehuisvest tenzij beschouwd als onverenigbaar door institutionele veterinair zorgvuldigheid personeel. Dieren worden gevoed passende niveaus van chow tweemaal daags en voor klinische symptomen waargenomen door zorg personeel ten minste eenmaal per dag.
1. voorbereiding op de operatie
- 5 mg/kg telazol en 2 mg/kg xylazine intramuscularly voor het opwekken van sedatie beheren. Beheren van buprenorfine SR subcutaan bij een dosis van 0,18 mg/kg voor postoperatieve analgesie (verwachting analgesie uit deze dosis zal maximaal 72 uur). Handmatig controleren of het dier voor reacties om te controleren of de sedatie.
- Zodra gedrogeerd, invoegen een intraveneuze katheter in een perifere oor ader voor farmacologische toegang.
- Intraveneuze 25 mg/kg cefazolin en 5 mg/kg intramusculair van ceftiofur pre-operatively beheren.
- Beheren van normale zout intraveneus te houden van de bloeddruk en hartslag binnen normale fysiologische grenzen gedurende de hele procedure.
- Plaats een buis van orogastric om de maag te decomprimeren. Endotracheale intubatie met een gepaste afmetingen endotracheale buis uitvoeren, controleren van juiste plaatsing door het comprimeren van de borst handmatig te detecteren uitademing en mechanisch ventileren dan het dier met 1-3% Isofluraan.
- Elektrocardiogram (ECG) leidt, bloeddruk manchet, temperatuursonde en puls-oximeter naar monitor en record vital borden plaatsen. Plaats het dier in een liggende positie, de buik van de ribbenkast aan bekken met betadine scrub en sterilely te draperen.
- Ventileer onderwerp met 1-3% Isofluraan tijdens de procedure om een chirurgische vliegtuig van de verdoving. Blijven volgen van de vitale functies voor wijzigingen en dienovereenkomstig aan te passen Isofluraan om hartslag op pre-incisie niveaus als bloeddruk daalt dramatisch, Isofluraan verminderen en initiëren van institutioneel-erkende agenten om te herstellen van vitaliteit, zoals intraveneuze epinefrine.
- Record hartslag, ademhalingsfrequentie, bloeddruk en lichaamstemperatuur op een chirurgische ingreep record bijhouden en onderhouden van dierenwelzijn per instelling-specifieke beleid tot naleving van de normen voor grote dierenwelzijn.
2. de laparoscopische gedeeltelijke Hepatectomy
- Uitvoeren van eerste haven site binnenkomst met behulp van een open Hassen techniek craniale naar de navel. Wanneer de buikvlies is gevisualiseerd, veilig voeren een 12 mm trocar in de buikholte. Een 5 mm, 30°, scope passeren door deze poort.
- Insufflate van de buik met CO2 tot 15 mmHg. Onder directe visualisatie met de laparoscopische camera, plaatst u twee extra 5 mm-poorten triangulating op de linker laterale kwab van de lever. Exacte plaatsing van de poorten zal afhangen van grootte en anatomie van het dier.
- Op dit punt, plaatst u de laparoscoop in één van de 5 mm-poorten.
- Het identificeren van de linker laterale segment van de lever op het punt van de grote horizontalis van linker kwab. Deze horizontalis scheidt de medische en linker laterale segmenten. Beveiligen van de portal structuren samen met de hepatische ader langs deze kloof met behulp van een chirurgische nietmachine (Zie Tabel van materialen). Transect de parenchym via deze horizontalis met behulp van opeenvolgende firings uit de nietmachine met 60, 45 of 30 mm lang vasculaire ladingen.
- Wanneer parenchymal resectie voltooid is, beoordeelt de restant lever om ervoor te zorgen voldoende hemostase. Controle elke bloeden uit de parenchym met brandijzer of hechtdraad.
- De lever gedeelte gebruiken Endoscopische graspers en een Endoscopische weefsel ophalen zak halen.
- Verwijderen van de poorten en sluit de insnijding poort 12 mm in drie lagen met onderbroken maat 0 hechtdraad voor de middellijn fascia, een lopende hechtdraad 2-0 voor de diep dermale laag en een lopende 4-0 Sutuur (geologie) voor de subcuticular laag. De 5 mm-poorten kunnen worden afgesloten in één laag met 2-0.
- Plaats een steriele dressing op de insnijdingen (Zie Tabel van materialen).
- Wanneer cellen klaar in minder dan 4 uur zijn zal, behouden de dieren onder algemene verdoving post-operatively tot het tijdstip van autotransplantation.
- Anderzijds als cel manipulaties langere periodes vereist (zodanig toestaan vorming van hepatocyte spheroïden of langere transductie/selectie op basis van afzonderlijke toepassingen van deze methode) toestaan het dier om te herstellen van anesthesie en herhaal de verdoving inductie stappen voorafgaand aan autotransplantation wanneer de cellen klaar bent.
3. de hepatocyte isolatie
- Verbinden met een peristaltische pomp met perfusie instellen om warme dispersie oplossingen (behouden in waterbad 43 ° C) te leveren katheters worden geplaatst in de grote blootgestelde schepen van de lever afdeling, zodanig dat oplossing temperatuur 38 ° C bij invoering aan het weefsel. Alle leidingen, apparatuur en oplossingen moeten worden gehandhaafd om ervoor te zorgen dat de cellen zijn geschikt voor transplantatie steriel.
- Prime de pomp en leidingen met Per II tot een afsluiter gepositioneerd om te schakelen tussen Per I en II-Per levering aan het weefsel. De afsluiter overschakelen naar de Per ik plaats en de rest van de set buizen, prime vullen een in-line waterventiel volledig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen in het weefsel.
- Bereiden van een schone dwarse snede loodrecht naar de hepatische circulatie te onthullen kruissecties van portal vein takken en hepatische veins voor catheterisatie.
- Catheterize de beschikbare blootgestelde aderen met een katheter snug-fitting te voorkomen lekkage van het perfusaat. Cannulate ten minste 1 portaal en 1 hepatische ader om voldoende perfusie van het weefsel.
- Ervoor zorgen dat de catheter(s) primer/gratis lucht alvorens de katheter te plaatsen in een ader.
- Perfuse met warme Per ik op 100 mL/min, naar de uitlaat buis van ader naar ader elke 30 seconden 1 min. cyclus door alle beschikbare aderen voor 15-20 min. Tijdens Per ik stel infusie, een evacuatie buis voor het leegmaken van het Dienblad van de procedure in een afval container onder vacuüm.
- Overschakelen naar Per II op 100 mL/min, fietsen door de aderen als met Per I, voor een totaal van 30 min. Gebruik tijdens Per II, een terugkeer pomp te recyclen Per II terug naar het reservoir voor opnieuw beheer voor de instandhouding van de voorbereiding van het actieve enzym. De terugkeer van de pomp ingesteld op minder dan de uitstroom pomp (dat wil zeggen, 94 mL/min), dat evenwel niet tot buitensporige lucht terug te keren naar de bron-fles.
- Als de lever capsule breekt, kan ditmaal worden verminderd.
- Als de lever wordt niet volledig verteerd (blijft niet golvend met zachte focal druk) een extra 5 min van perfusie kan worden uitgevoerd.
- Af en toe (ongeveer elke 5 minuten) document oppervlaktetemperatuur van de waterventiel en/of lever om ervoor te zorgen de hepatocyten zijn niet koud. Als de lever wordt koud (< 35 ° C) verhogen van de warmte van het waterbad om te herstellen van de lever temperatuur dichter tot 38 ° C. De lever moet blanche de perfusie opbrengst.
- Lever voor steriele plaat of petrischaal voor vervoer naar cel cultuur kap verwijderen. Cover steriel veld met een steriele draperen om integriteit te handhaven tijdens de hepatocyte verwerking.
- De lever sectie van steriele draperen bloot en dompelen de lever met koude hepatocyte wassen media (HWM). Verstoren de capsule door te slepen schaar aan de bovenkant. Steriele handschoenen, zachtjes masseren de lever om los van de hepatocyten in het medium.
- Filter de HWM hepatocyten via steriel gaas met in grote (~ 200 mL) centrifuge flessen. Het wassen van de hepatocyten via de volgende procedure in drievoud, het combineren van de pellet van de cel van de meerdere flessen na de eerste resuspensie (naar gelang van het geval):
- Centrifuge op 50 x g, 5 min, 4 ° C.
- Gecombineerd en resuspendeer in 150 mL HWM.
- Laat de pellet in HWM na de 3rd wassen.
- Graaf cel concentratie met behulp van een hemocytometer of een ander apparaat, als beschikbaar. Deze cellen zijn nu klaar voor ex vivo manipulatie van belang, met inbegrip van gentherapie, cel sorteren of andere specialisatie voorafgaand aan autotransplantation. Eindvolume van HWM kan worden aangepast om te richten op een specifieke concentratie (cellen/mL).
4. de hepatocyte transductie
- Resuspendeer hepatocyten in media (Dulbecco van gemodificeerde eagle medium [DMEM], 10% foetale runderserum [FBS], penicilline-streptomycine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur [HEPES], dexamethason, epidermale groeifactor [EGF] en NTBC) bij 1-2 miljoen cellen per mL in een conische buis op ijs.
- Lentivirale vector op kamertemperatuur ontdooien en voeg aan conische buis op ijs op de doelgroep 20 multipliciteit van infectie (MOI) te binden de cellen. Draaien cellen bij 4 ° C bij 10 omwentelingen per minuut gedurende 90 minuten de virale vector binden aan het celoppervlak.
- Buizen overbrengen op 37 ° C gedurende 30 – 40 min. omdraaien om te mixen om de 5 minuten om te vergemakkelijken de vector transducing de afhankelijke cellen.
- Centrifugeer cellen bij 50 x g bij 4 ° C voor 4 min. resuspendeer cel pellet in een zoutoplossing op de gewenste concentratie op ijs. Herhaal deze wassing om ervoor te zorgen verwijderen van een niet-afhankelijke vector van de voorbereiding.
- Indien mogelijk, plaat voldoende aliquots van cellen (dat wil zeggen, 500.000 cellen per putje in een 6 cel goed cultuur plaat) om te controleren voor de levensvatbaarheid, hechting, signaaltransductie efficiëntie, enz.
Opmerking: Het is vaak niet mogelijk om te beoordelen van deze parameters voorafgaand aan autotransplantation, vooral voor dezelfde dag procedures. De hierin beschreven procedure gebruikt bijvoorbeeld een niet-gecodeerde Fah cDNA onder de controle van de alpha-1 antitrypsine lever-specifieke promotor, die niet gemakkelijk assayable in de hepatocyten voorafgaand aan de transplantatie was. Echter kunnen deze vergulde cellen worden bepaald na de autotransplantation als een indicator van het succes van signaaltransductie (dat wil zeggen, via het westelijke bevlekken) of een voorspeller van het algemene succes van de procedure.
5. de hepatocyte transplantatie
- Het identificeren van de ader van de portal via echografie met behulp van een 2 tot 5 MHz transducer. Direct een 18 G, 5 inch naald naar de belangrijkste portal vein proximale aan zijn bifurcatie.
- Trage handmatige infusie van van 1 x 109 hepatocyten (ongeveer 10 g) met behulp van een injectiespuit te beginnen. Monitor portal druk tijdens transplantatie met behulp van een katheter infusie.
- Als portal druk meer dan 8 mmHg boven de basislijn verhogen, onderbreken infusie en laat de druk om terug te keren naar niveaus van de basislijn.
- Als portal druk niet tot basislijn na onderbreken terugkeren infusie voor vijf minuten, staken de infusie.
- Na transplantatie en verwijdering van de katheter, gebruiken de echografie te evalueren voor de aanwezigheid van trombotische gebeurtenissen en stroming in de ader van de portal.
6. postoperatieve herstel en onderhoud
- Verplaats onder voorbehoud van een goede herstel-gebied en observeren totdat het dier volledig ambulant is, controle hartslag, zuurstof saturatie en lichaamstemperatuur elke 15-30 min. handhaven lichaamstemperatuur met warme dekens of een lucht-verwarmd wrap, zo nodig.
- 1 mg/kg omeprazol beheren via de mond dagelijks (tot het einde van de studie) ter vermindering van de kans op maag ulceratie die kunnen optreden met vlagen van eetlustgebrek.
- Postoperatief, het dier is nauwlettend gevolgd door lab en veterinair personeel en meestal vereist geen extra pijn medicatie los van de pre-operatieve buprenorfine dosis. Als tekenen van nood/pijn worden waargenomen door gekwalificeerde veterinair zorgvuldigheid personeel (incisie bewaken, anorexie, lethargie), kunnen anti-inflammatoire stoffen (dat wil zeggen, Carprofen) worden toegediend.
7. recepten
- Zie tabel 1 voor recepten die in dit protocol worden gebruikt.
| Reagens | HWM | Reagens | Per I (10 x) | Per II (10 x) |
| Williams'-E poeder (g/L) | 10,8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| Pen/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| Foetale runderserum (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-cysteïne | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| Nitroglycerine (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2 H2O (g/L) | - | 7 | ||
| Collagenase D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
Tabel 1: Recepten voor oplossingen gebruikt Hepatocyte los van lever secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lever resectie en autologe transplantatie worden schematisch weergegeven in Figuur 1. In een representatieve cohort van 5 varkens die hepatische resectie onderging, had de meeste opbrengsten van > 1 x 109 hepatocyten met ongeveer 80% levensvatbaarheid (tabel 2), bieden tal van cellen voor elk type gewenst manipulaties, met inbegrip van gene therapie. Latere cultuur van het niet-getransplanteerde gedeelte van bereid hepatocyten uit elk van die 5 varkens toonde goede levensvatbaarheid en adhesie, met typische hepatocyte morfologie 46 uur na transductie en eerste platen (Figuur 2). Deze resultaten zijn representatief voor een succesvolle voorbereiding, terwijl slechte resultaten met lage aantallen cellen, levensvatbaarheid of minimale hechting van de cellen in een enkelgelaagde zou worden vermeld.
Een lever biopsie voorafgaand aan de behandeling van de Fah- / - varken toont geen uitdrukking van FAH via immunohistochemistry (Figuur 3). Eerste engraftment is afhankelijk van de hoeveelheid cellen opnieuw tijdens de transplantatie. Transductie frequenties van varkens hepatocyten in vitro met behulp van lentivirus op een MOI van 10 TU/hepatocyte is meestal 70-100%. Het werk cellen zal klonaal uitbreiden in de Fah- / - lever totdat de gehele lever opnieuw door de gecorrigeerde cellen bevolkt is. Representatieve biopsieën op 2, 6 en 12 maanden tonen een tijdlijn van FAH-positieve cel expansie, die meestal voltooid op 12 maanden na de transplantatie (Figuur 3 is). Zelfs een laag percentage van engraftment zou worden verwacht uiteindelijk repopulate de lever, hoewel de werkelijke oorspronkelijke engraftment tarieven zijn niet geëvalueerd in dit experiment.
Varkens zijn zorgvuldig bewaakte na transplantatie voor gewichtstoename, zoals gebrek aan gedijen een teken is dat onvoldoende gecorrigeerd hepatocyten aanwezig zijn. In dit geval zijn de dieren fietste terug op NTBC als nodig totdat de gecorrigeerde hepatocyte bevolking voldoende is om complete spenen van de drug. Evaluatie van de circulerende biomarkers biedt eenvoudige toegang om te volgen van de therapie. Zodra een dier heeft bereikt ongeveer 20% herbevolking van gecorrigeerde hepatocyten in de lever, tyrosine en succinylacetone niveaus zal normaliseren in vergelijking met wild-type dieren (figuur 4A). Bovendien toont het onder-behandeld of onbehandeld Fah- / - varken aan soortgelijke fibrotische lever veranderingen gezien in de getroffen mensen, die kunnen worden gevolgd door de Masson trichrome kleuring van seriële biopsieën8. Surrogaat markers van lopende lever schade kunnen worden geëvalueerd door de keuring circulerende leverenzymen, zoals aspartaataminotransferase en alkalische fosfatase. Terwijl ongecorrigeerd dieren aanzienlijke hoogte in beide parameters vergeleken met wild type dieren vertonen, ex vivo gentherapie waarden als resultaat gegeven deze serum normaal (figuur 4B en 4 C). Tot slot, algemene lever metabole gezondheid wordt verstoord in onbehandelde Fah- / - varkens, zoals aangegeven door de waterstand in het circuleren van ammoniak. Herbevolking van de lever met gecorrigeerde cellen herstelt wild-achtige velden van ammoniak (Figuur 4 d).
Figuur 1: Hepatectomy en autologe transplantatie. (Met de klok mee van boven) Een gedeeltelijke lever resectie is uitgevoerd op het onderwerp om een bron van hepatocyten en lever regeneratie stimuleren. Hepatocyten zijn geïsoleerd uit de resected lever (blauwe cellen), getransduceerde ex vivo met de lentivirale vector met de transgenic van belang (bruin cellen), waarna de getransduceerde cellen autologously worden getransplanteerd terug naar de bron dier via Portal vein injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: primaire varken hepatocyten van lever secties. Hepatocyten werden gekweekt uit lever resections van 5 verschillende varkens, getransduceerde met lentivirale vector en toegestaan om te groeien voor 48 h om aan te tonen van de morfologie, levensvatbaarheid, zuiverheid en hechting op cultuur gerechten. Deze kwalitatieve evaluaties in vitro dienen als surrogaat indicatoren voor de kans op succesvolle engraftment in vivo voor elk preparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Gecorrigeerde hepatocyten Repopulate de Fah- / - varken lever. FAH immunohistochemistry lever biopsieën 0, 2, 6 en 12 maanden na de therapie van het gen van de ex vivo van autologe hepatocyten. Onbehandeld Fah- / - varkens-Toon geen FAH-positieve cellen in de lever (A). Twee maanden na de transplantatie (B), worden individuele foci van FAH positieve hepatocyten gezien, die vervolgens expansie ondergaan ter vervanging van 50-60% van de lever op 6 maanden (C) gevolgd door de volledige vervanging, gezien op 12 maanden (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Serum biochemie aan 10 maanden post ex vivo de therapie van het gen in Fah - / - varkens. 10 maanden na therapie, tyrosine, aspartaat-aminotransferase14, alkalische fosfatase (ALP) en ammoniak niveaus zijn aanzienlijk lager dan onbehandelde FAH gebrekkige dieren en zijn niet te onderscheiden van wild-achtige velden. Gegevens werden geanalyseerd voor de betekenis met behulp van de Mann-Whitney U test (p -waarden zoals gepresenteerd). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Varken | Total cellen (x 106) | Levende cellen (x 106) | Levensvatbaarheid (%) |
| 1 | 1,381 | 1,160 | 84 |
| 2 | 1.000 | 770 | 77 |
| 3 | 1.213 | 995 | 82 |
| 4 | 38½ | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| Gemiddelde | 1,140 | 914 | 80 |
| St Dev | 244 | 194 | 5 |
Tabel 2: Vertegenwoordiger hepatocyte voortvloeit uit primaire isolatie van 5 varkens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit verslag beschrijft een ex vivo autologe gene therapie aanpak om te genezen van een varkens model voor HT-1. Het gaat om een gedeeltelijke hepatectomy, gevolgd door ex vivo hepatocyte isolatie en transductie van geïsoleerde hepatocyten met lenti virus uitvoering van de corrigerende transgenic. Gecorrigeerde autologe hepatocyten worden vervolgens terug naar het dier FAH tekort via de portal vein8getransplanteerd. Hoewel de beschreven methode is van toepassing op alle grote dierlijke modellen met enige aanpassing, heeft het varken FAH-deficiënte het unieke voordeel van een zeer selectieve klimaat voor gecorrigeerde cellen13,15. Deze methode is een effectieve remedie voor de HT-1, zoals proefdieren de autonome groei van de NTBC met de normalisatie van biochemically gemeten metabolieten en inflammatoire lever biomarkers, preventie van cirrose en HCC en de volledige omkering van vroege fibrose gezien tonen met NTBC fietsen. Bovendien, een meer recente studie waarbij uitgebreide histologische analyse heeft aangetoond dat geen detecteerbare ongecorrigeerd cellen, fibrose, levercirrose of tumorigeniciteit 3 jaar post therapie (manuscript in herziening). Echter kan het nut van de achtergrond FAH-null dienen als hulpmiddel voor de evaluatie van een breed scala van ondervragingen in hepatocyte vermeldingen van de Fysiologie en ziekte buiten de HT-1 toestaan.
Relatieve succes van de procedure kan worden geëvalueerd door het aantal cycli van NTBC nodig is voordat het onderwerp kan volledig worden gespeend van deze beschermende drug. In talrijke iteraties met dit model en in andere kleine dierlijke modellen van HT-1 is ongeveer 20% correctie vereist voordat NTBC onafhankelijke groei wordt bereikt. Meer fietsen met NTBC is kenmerkend voor slechte eerste engraftment/levensvatbaarheid, geavanceerde leverziekte ten tijde van de eerste engraftment of slechte transgenic expressie, hoewel andere factoren kunnen ook een rol spelen. Biochemische merkers van lever gezondheid (AST, ALT en ammoniak) zijn direct beschikbaar en bieden inzicht in de mate van expansie van de gecorrigeerde hepatocyte, maar uiteindelijke verificatie van fenotypische kuur is best bewezen door de normalisering van serum tyrosine en succinylacetone en histologische bevestiging van hepatocyten FAH-uitspreken in afwezigheid van fibrose. Dit wordt bereikt wanneer de lever heeft opnieuw zijn gevuld met gecorrigeerde hepatocyten.
De doeltreffendheid van de procedure is zwaarst gebaseerd op de integriteit van de hepatocyten, die moet worden gehandhaafd, steriel en levensvatbare gedurende het hele proces van isolement, transductie en transplantatie. Herinvoering van niet-levensvatbare of ongecorrigeerd hepatocyten zal het fenotype niet redden, en een mislukte procedure kon nemen maanden van onderwerp observatie om te verifiëren.
In dit model is goede transgenic uitdrukking van het functionele FAH-enzym een minimumvereiste voor lever herbevolking. Lentivirus is slechts één manier om het leveren van een doeltreffende kopie van de transgenic. Deze methode zal de mogelijkheid voor het gebruik van andere afgiftesystemen met inbegrip van niet-virale systemen en die gericht zijn op de specifieke genomic defect bewerken toestaan. Uiteindelijk, dit model zal zorgen voor een uitgebreid scala aan mogelijkheden, met inbegrip van de correctie van andere gebreken in de FAH gebrekkig bioreactor. Zolang de getransplanteerde cel geeft uiting aan een functionele FAH enzym, zou iedere andere wijziging van de cellen ex vivo ook worden doorgegeven. Hierdoor zouden de aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever in de FAH- / - achtergrond worden gecorrigeerd. Zoals de expansie van de gecorrigeerde hepatocyten uiteindelijk de lever werkt, kan relevante nummers van hepatocyten voor een indicatie van de ziekte worden bereikt, die de waarde van dit model en de procedure als een basiswetenschap en preklinische therapie model onderstreept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Duane Meixner voor expertise in het uitvoeren van de portal-veneuze injectie, Steve Krage Joanne Pederson en Lori Hillin voor ondersteuning tijdens de chirurgische procedures. Dit werk werd gesteund door het Children's Hospital of Minnesota Foundation en regeneratieve geneeskunde Minnesota. R.D.H. werd gefinancierd door middel van een NIH K01 DK106056 award en een Mayo kliniek centrum voor regeneratieve geneeskunde Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
