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Bioengineering

Endothelial कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एकाधिक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग कर कतरनी तनाव को उजागर

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/58478
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Summary

यहां, द्रव कतरनी तनाव के तहत endothelial कोशिकाओं की संस्कृति और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया है । शामिल एक साथ आवास और एक नियंत्रित वातावरण में एकाधिक प्रवाह कक्षों की निगरानी और मात्रात्मक पीसीआर के लिए एक exogenous संदर्भ आरएनए के उपयोग के लिए एक भौतिक व्यवस्था है ।

Abstract

हम endothelial कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एक स्थिर लामिना प्रवाह एकाधिक मॉनिटर समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग करने के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन । Endothelial कोशिकाओं रक्त वाहिकाओं के भीतरी सेलुलर अस्तर फार्म और जीर्ण कतरनी तनाव नामक रक्त प्रवाह के घर्षण बल को उजागर कर रहे हैं । शारीरिक स्थितियों के तहत, endothelial कोशिकाओं विभिन्न कतरनी तनाव की स्थिति की उपस्थिति में कार्य करते हैं । इस प्रकार, में इन विट्रो मॉडल में कतरनी तनाव शर्तों के आवेदन vivo मेंendothelial प्रतिक्रियाओं में अधिक से अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर पहले लेन एट अल द्वारा प्रकाशित । 9 उपस्थिति और स्थिर (गैर गुणवाला) लामिना प्रवाह के अभाव में endothelial जीन विनियमन अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है । यहां प्रस्तुत के रूप में लामिना प्रवाह के लिए सेट अप में मुख्य रूपांतरों घर समवर्ती प्रवाह सर्किट के लिए एक बड़े, समर्पित वातावरण में शामिल हैं, वास्तविक समय में प्रवाह की दर की निगरानी, और के सामान्यीकरण के लिए एक exogenous संदर्भ आरएनए का समावेश मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर डेटा । कतरनी तनाव के आवेदन के साथ कई उपचार/स्थितियों का आकलन करने के लिए, एकाधिक प्रवाह सर्किट और पंपों एक ही गर्म और humidified मशीन के भीतर एक साथ प्रयोग किया जाता है । प्रत्येक प्रवाह सर्किट की दर प्रवाह लगातार प्रयोग भर में कतरनी तनाव की स्थिति को मानकीकृत करने के लिए वास्तविक समय में मापा जाता है । इन प्रयोगों एक से अधिक शर्तों है, क्योंकि हम भी आरएनए निष्कर्षण और पहली किनारा सीडीएनए संश्लेषण क्षमता के सामान्यीकरण के लिए आरएनए निष्कर्षण के समय में नुकीला है कि एक exogenous संदर्भ आरएनए का उपयोग करें. इन चरणों नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को छोटा करें । इस रणनीति हमारे पाइपलाइन में कतरनी तनाव समानांतर-प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग कर प्रयोगों के साथ विश्लेषण अभिव्यक्ति के लिए कार्यरत है, लेकिन इस रणनीति के कुछ हिस्सों, जैसे exogenous संदर्भ आरएनए स्पाइक में, आसानी से कर सकते हैं और लागत प्रभावी ढंग से के लिए इस्तेमाल किया जा अंय अनुप्रयोग ।

Introduction

संवहनी endothelial कोशिकाओं उच्च प्रजातियों के बंद हृदय प्रणाली में रक्त वाहिकाओं के भीतरी सेलुलर अस्तर के रूप में । वे रक्त और ऊतकों के बीच इंटरफेस फार्म और चमकदार और abluminal सतहों की विशेषता है । endothelium एक विविध, सक्रिय, और अनुकूली प्रणाली है कि रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करता है, पोषक तत्वों की तस्करी, प्रतिरक्षा, और नए रक्त वाहिकाओं के विकास1. शरीर में, endothelial कोशिकाओं को आम तौर पर जहां वे संचलन के घर्षण बल, कतरनी तनाव2के संपर्क में है एक वातावरण में मौजूद हैं । कतरनी तनाव endothelial सेल जीन अभिव्यक्ति3का एक महत्वपूर्ण नियामक है, और endothelial कोशिकाओं को दिया एक सीमा के भीतर कतरनी तनाव बनाए रखने का प्रयास2,4। Endothelial कोशिकाओं कतरनी तनाव5 कि ऊतक छिड़काव में सुधार कर सकते हैं के अभाव में angiogenic पैटर्न का प्रदर्शन । परेशान प्रवाह और बदल कतरनी तनाव के क्षेत्रीय पैटर्न भड़काऊ जीन6 की अभिव्यक्ति और7atherosclerosis,8के विकास के साथ जुड़े रहे हैं । इस प्रकार, मॉडल है कि कतरनी तनाव शामिल endothelial जीन विनियमन को समझने का एक प्रमुख घटक हैं ।

हम कतरनी तनाव के तहत संवहनी endothelial कोशिकाओं में जीन विनियमन अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन । इस प्रणाली के गैर गुणवाला प्रवाह का उपयोग करता है और द्रव कतरनी तनाव का स्तर और ऑक्सीजन एकाग्रता है कि धमनी endothelial कोशिकाओं के लिए मॉडल शर्तों की नकल । इस प्रोटोकॉल जीन आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) का उपयोग कर पछाड़ना के लिए तरीकों का ब्यौरा शामिल है, सेट-कतरनी तनाव के आवेदन के लिए समानांतर प्लेट प्रवाह तंत्र का उपयोग कर, और स्पाइक के लिए तरीके एक exogenous संदर्भ आरएनए के द्वारा विश्लेषण करने से पहले रिवर्स-transcriptase मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR). इस पाइपलाइन की उपस्थिति और लामिना कतरनी तनाव के अभाव में endothelial कोशिकाओं में जीन विनियमन के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है और समानांतर की एक अनुकूलन-प्लेट प्रवाह लेन एट अल द्वारा वर्णित उपकरण शामिल हैं । 9. इस विशेष सेट अप कतरनी तनाव की स्थिति के प्रत्यक्ष तुलना, साथ ही आरएनए विश्लेषण के सामान्य की अनुमति देता है कि कई प्रयोगात्मक स्थितियों के एक साथ मूल्यांकन की सुविधा के लिए बनाया गया था. नियंत्रित आर्द्रता के साथ एक बड़ी गर्म इकाई के लिए एकाधिक अलग प्रवाह कक्षों और पंपों की अनुमति के लिए एक साथ प्रवाह दर वास्तविक समय में प्रत्येक प्रवाह चैंबर विधानसभा के लिए निगरानी के साथ चल रहा है उपयोग किया जाता है । इस सेट के आवेदन जीन पछाड़ना लामिना प्रवाह/कतरनी तनाव की सेटिंग में RNAi का उपयोग कर के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के पहलुओं आरएनए अभिव्यक्ति के किसी भी आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

endothelial कोशिकाओं के लिए कतरनी तनाव के आवेदन के लिए आम दृष्टिकोण microfluidic सिस्टम10, एक शंकु और प्लेट11विस्कोमीटर, और एक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर12शामिल हैं । विभिंन निर्माताओं से Microfluidic प्रणालियों कई कोशिका और ऊतक प्रकार और भौतिक उत्तेजनाओं की एक किस्म में mechanobiology और mechanotransduction का अध्ययन करने में उपयोगी हो गया है । endothelial कोशिकाओं के लिए, वे अलगाव में endothelial कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही endothelial कोशिकाओं की बातचीत और प्रतिरक्षा या ट्यूमर कोशिकाओं के तस्करी10. हालांकि, इन सिस्टमों में से9कक्षों की बड़ी संख्या की पुनर्प्राप्ति के लिए कम उपयुक्त हैं । शंकु और प्लेट दोनों विस्कोमीटर और समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर धाराप्रवाह monolayers12में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की वसूली की अनुमति देते हैं । इन प्रणालियों कतरनी बलों और12पैटर्न की एक सीमा उत्पंन कर सकते हैं । समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर विधानसभा9 लाभ है कि वास्तविक समय इमेजिंग कांच की खिड़की के माध्यम से किया जा सकता है किसी भी समय बिंदु पर सेलुलर आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए है । इसके अलावा, perfusate बाँझ शर्तों के तहत एकत्र किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत प्रणाली के लिए, प्रवाह भी वास्तविक समय में और एक बहु में निगरानी की जा सकता है-चैंबर सेट अप, जो कक्षों के बीच कतरनी शर्तों के रखरखाव की सुविधा ।

प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए, मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) है, जो एक macrovascular endothelial कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, का उपयोग किया जाता है, और कतरनी तनाव शर्तों हम (1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) धमनी की स्थिति को प्रतिबिंबित (०.१-०.७ फिलीस्तीनी अथॉरिटी) । हालांकि, इस प्रोटोकॉल अंय endothelial सेल प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, और कतरनी तनाव शर्तों प्रयोगात्मक प्रश्न के अनुसार समायोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मानव endothelial कोशिकाओं के मूल्यांकन की स्थिति में है कि मॉडल शिरापरक परिसंचरण कतरनी तनाव के निचले स्तर (1-6 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) की आवश्यकता होगी और अध्ययन है कि मॉडल microvascular संचलन ०.४ के कतरनी तनाव के स्तर का उपयोग किया है-१.२ pa13 , 14. इसके अलावा, कतरनी तनाव भी एक ही रक्त वाहिका6के भीतर endothelial कोशिकाओं के बीच भिंन हो सकते हैं । वर्तमान सेट-अप में, एक एकल निगरानी प्रणाली एक साथ चार अलग प्रवाह छोरों की निगरानी कर सकते हैं कि प्रयोग किया जाता है. प्रयोगशालाओं के लिए है कि और अधिक प्रवाह छोरों की जरूरत है, वहां एक अतिरिक्त निगरानी प्रणाली के लिए समर्पित वातावरण में जगह है ।

आरटी-qPCR कतरनी तनाव की स्थापना में जीन अभिव्यक्ति की निरपेक्ष quantitation के लिए प्रयोग किया जाता है । लक्ष्य जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति अक्सर शर्तों के पार आरएनए अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कुछ आरएनए प्रजातियों बहुत कम मात्रा में मौजूद हैं या अनुपस्थित हो सकते हैं, इस प्रकार रिश्तेदार माप उलझी । उदाहरण के लिए, endothelial कोशिकाओं में लंबे समय से कोडिंग RNAs सेल5प्रति अपेक्षाकृत कम प्रति संख्या पर शक्तिशाली प्रभाव डालती कर सकते हैं । इसके अलावा, प्राइमरी दक्षता में अंतर डेल्टा-डेल्टा साइकिल दहलीज (सीटी) विधि के डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग से एक गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस चिंता को हल करने के लिए, हम प्लाज्मिड डीएनए की एक ज्ञात मात्रा का उपयोग कर एक मानक वक्र पैदा करके निरपेक्ष quantitation प्रदर्शन करते हैं । इसके अलावा, पूरक डीएनए (सीडीएनए) संश्लेषण एक अकुशल प्रक्रिया है, और सीडीएनए दक्षता में मतभेद शर्तों और बीच15नमूनों के बीच आरएनए अभिव्यक्ति में अंतर के लिए खाते कर सकते हैं. कतरनी तनाव और/या अभिकर्मक रिएजेंट के आवेदन सेल प्रसार, apoptosis, और व्यवहार्यता, या आरएनए अलगाव और/या सीडीएनए संश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि घटकों को जोड़ने को प्रभावित कर सकते हैं । आरएनए अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण से पूर्वाग्रह की संभावना के लिए खाते में, हम एक स्पाइक में लैब में संश्लेषित नियंत्रण का उपयोग, आरएनए निष्कर्षण के समय में जोड़ा और आरटी-qPCR के माध्यम से प्रत्येक सीडीएनए संश्लेषण के साथ मापा. यह न केवल आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण में तकनीकी मतभेदों के लिए समायोजन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी कोशिका गिनती जाना जाता है जब सेल प्रति निरपेक्ष मात्रा, की गणना की अनुमति देता है.

यह सिस्टम शर्तों के बीच तकनीकी अंतरों के लिए समानता या खाता बनाए रखने के लिए अतिरिक्त चरणों का उपयोग करता है । हम विशेष रूप से इन प्रयोगों है, जो कई शारीरिक सेट अप और प्रयोगात्मक शर्तों है कि प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते है शामिल की जटिल प्रकृति के इन कदमों पर जोर ।

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Protocol

1. Exogenous संदर्भ आरएनए की तैयारी

नोट: एक exogenous संदर्भ आरएनए चुनें जो प्रजातियों या रुचि के मॉडल में मौजूद नहीं है । स्तनधारी प्रणालियों के लिए, जुगनू luciferase आरएनए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. exogenous संदर्भ आरएनए प्लाज्मिड के Linearization
    1. प्रत्याशित आरएनए निष्कर्षण से पहले exogenous संदर्भ शाही सेना को कम से ४८ एच तैयार करें । इस तरह के लिए उपयुक्त एक प्लाज्मिड वेक्टर में एक जुगनू luciferase सीडीएनए क्लोन के रूप में चुना exogenous संदर्भ आरएनए, की एक सीडीएनए क्लोन प्राप्त या निर्माण इन विट्रो प्रतिलेखन ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. प्रदर्शन प्रतिबंध एंजाइम (RE) पूर्ण लंबाई प्लाज्मिड के 1 µ जी के पाचन (जुगनू luciferase प्लाज्मिड है pSP-ल्यूक + जो ४१०० बीपी है) का उपयोग कर एकल कटर पुनः (XhoI) में १.५-एमएल microfuge ट्यूबों । एक पुनः चुनें कि एक एकल कटर है (केवल प्लाज्मिड कटौती 1x) exogenous संदर्भ आरएनए अनुक्रम है कि एक 5 ' बदस्तूर या कुंद अंत पत्ते के 3 ' अंत में । एक ठेठ तैयारी के लिए, सात प्लाज्मिड linearization प्रतिक्रियाओं (कदम 1.1.4-1.1.7) समानांतर में प्रयोग या एक परियोजना के एक सेट को पूरा करने के लिए पर्याप्त आरएनए एकाग्रता और मात्रा उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
      1. spectrophotometry या spectrofluorometry का उपयोग कर प्लाज्मिड एकाग्रता को मापने ।
      2. प्रत्येक ट्यूब में एक पुनः मिश्रण तैयार: XhoI के 4 µ एल जोड़ें (२०,००० इकाइयों/एमएल), 8 µ एल के पुनः बफर, एक्स µ एल के प्लाज्मिड (1 µ जी), और पर्याप्त एच2ओ के कुल समाधान तक पहुंचने के लिए ८० µ l
      3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए पुनः मिश्रण मशीन । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पुनः उपयोग करें, क्योंकि किसी भी संशोधनों में वृद्धि हुई स्टार गतिविधि या लक्ष्य डीएनए के गैर-विशिष्ट क्लीवेज का परिणाम हो सकता है. हीट ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को निष्क्रिय ।
      4. प्रत्येक ट्यूब में इथेनॉल वर्षण के साथ पुनः डाइजेस्ट समाप्त । री मिक्स करने के लिए, सीधे ०.५ मीटर EDTA पीएच ८.०, 8 µ एल के 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.२, और १००% इथेनॉल के १८४ µ एल के 4 µ एल जोड़ें । मिश्रण अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण फ्रीज ।
      5. १६,१०० x gके एक रिश्तेदार केंद्रापसारक बल (आरसीएफ) में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण नीचे स्पिन
      6. एक ठीक टिप के साथ supernatant निकालें, गोली छूने के बिना । एयर-5 मिनट के लिए गोली सूखी और यह 6 µ एल में resuspend एच2ओ के (३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम) ऊपर और नीचे 5x-10x pipetting द्वारा ।
      7. एक 1 केबी + सीढ़ी, एक ethidium सीढ़ी के साथ साथ ब्रोमाइड EtBr (supercoiled) युक्त 2% agarose जेल पर पच उत्पाद चलाकर luciferase प्लाज्मिड के linearization की पुष्टि करें, और कट और बिना खतना के प्लाज्मिड । जेल का निरीक्षण और इन विट्रो प्रतिलेखन में आगे बढ़ना अगर कट प्लाज्मिड के लिए लेन ~ 4 kb पर एक बैंड से पता चलता है (बिना खतना प्लाज्मिड तीन बैंड होगा; चित्रा 1) ।
        सावधानी: EtBr यलो है । एक रासायनिक धुएं हुड में काम करते हैं ।
  2. सन् इन विट्रो प्रतिलेखन की exogenous संदर्भ आरएनए प्लाज्मिड
    1. पचा प्लाज्मिड उत्पादों की एक ट्यूब के लिए, इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग इन विट्रो प्रतिलेखन विधि में प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) । निर्माता के निर्देशों का पालन करें और उपयुक्त फेज आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें । सीडीएनए संश्लेषण की विधि एक पाली (एक) पूंछ की आवश्यकता है, या अन्य अनुप्रयोगों के एक पाली की आवश्यकता होती है (क) पूंछ, इन विट्रो प्रतिलेखन की एक विधि का चयन करें कि एक पाली (एक) पूंछ इसके अलावा शामिल ( सामग्री की तालिकादेखें).
    2. सभी में गठबंधन इन विट्रो एक एकल १.५ मिलीलीटर के उत्पादों में प्रतिलिखित शुद्धि करने से पहले ट्यूब ।
  3. Purif ication से आरएनए के इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया
    1. इन विट्रो में शुद्ध इन विट्रो प्रतिलेखन साफ-किट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ उत्पादों प्रतिलिखित । कृपया निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    2. spectrophotometry का उपयोग कर २६० एनएम पर अवशोषक को मापने के द्वारा आरएनए एकाग्रता का आकलन करें ।
      नोट: आरएनए एकाग्रता बियर-Lambert कानून का उपयोग कर की गणना की है । यह बताता है कि न्यूक्लिक एसिड के अवशोषण (जो २६० एनएम में प्रकाश दृढ़ता से अवशोषित) एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । १.० का एक अवशोषक एक-कतरा आरएनए के ४० µ g/एमएल के बराबर है ।
  4. Aliquoting प्रयोगात्मक उपयोग के लिए पीसीआर ट्यूबों में शेयर आरएनए
    1. आरएनए एकाग्रता सुनिश्चित करें 1 µ g/µ l
      1. यदि आरएनए एकाग्रता है > 1 µ g/µ l, पीसीआर ट्यूबों में स्टॉक को 1 µ g/µ l Aliquot 1 µ l तक पतला करें और उन्हें-८० ° c पर स्टोर करें ।
      2. यदि आरएनए एकाग्रता < 1 µ g/µ l है, तो 5 M अमोनियम एसीटेट का उपयोग करते हुए अतिरिक्त तेज़ी (किट में दिए गए) को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया जा सकता है । यदि आरएनए एकाग्रता अभी भी < 1 µ g/µ l है, तो aliquoting 1 µ l के साथ पीसीआर ट्यूबों में आगे बढ़ें ।

2. स्लाइड कोटिंग

नोट: २.१-२.१० चरण अनुमानित कक्ष सीडिंग करने से पहले 24-48 h किया जाना चाहिए ।

  1. २५० ° c करने के लिए ओवन कचौरी ।
  2. बाँझ दस्ताने का प्रयोग, एल्यूमीनियम पंनी के साथ एक गिलास स्लाइड 2x लपेटो । सीधे स्लाइड की सतह को छूने से बचें ।
  3. २५० डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ओवन में स्लाइड सेंकना और स्लाइड कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति ।
    नोट: यह कदम किसी भी दूषित endotoxin को नष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. जबकि स्लाइड ठंडा कर रहे हैं, आसुत जल के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल के एक fibronectin स्टॉक समाधान बनाने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए यह मशीन भंग करने के लिए । बना १००-µ l aliquots । तत्काल उपयोग के लिए aliquots को अलग सेट करें और शेष aliquots को भविष्य में उपयोग के लिए फ़्रीज़ करें.
  5. एक सुरक्षा कैबिनेट में कांच स्लाइड डालने से पहले एल्यूमीनियम पंनी के बाहरी कवर खोलना । २.६-२.७ और २.९-सुरक्षा कैबिनेट में चरण निष्पादित करें ।
  6. एक बाँझ आयताकार 4-अच्छी तरह से सेल संस्कृति पकवान में कांच स्लाइड प्लेस ।
  7. आसुत जल के साथ fibronectin स्टॉक समाधान 1:100 पतला । कोट पतला fibronectin के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक स्लाइड, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, एक पिपेट का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि पूरी स्लाइड को कवर किया गया है ।
  8. 24-48 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति मशीन में स्लाइड की मशीन ।
  9. इस मशीन के बाद, महाप्राण 4-well सेल संस्कृति पकवान झुकाव द्वारा fibronectin । aspirator के साथ सीधे स्लाइड को छूने से बचें ।

3. ग्लास स्लाइड पर सेल सीडिंग

  1. गणना के प्रारंभिक मार्ग पर मानव endothelial कोशिकाओं (गद्यांश 2-5) और बीज ~ १.० x 10 प्रत्येक fibronectin-लेपित ग्लास स्लाइड पर6 कोशिकाओं मीडिया के 1 एमएल के साथ (१.० x 106 कोशिकाओं/ लामिना प्रवाह के प्रत्याशित आवेदन करने से पहले कोशिकाओं को 24 एच बीज अगर कोई अंय उपचार किया जा करने के लिए है ।
    नोट: ये संख्या प्रवाह के 24 ज के साथ प्रयोगों के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जाता है ।
    1. कोशिका संचयन और आरएनए निष्कर्षण के समय कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह monolayer प्राप्त करने के लिए बीज का घनत्व समायोजित करें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्लाइड का पालन कोशिकाओं चलो ।
  3. सेल संस्कृति के प्रत्येक कुआं में मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें स्लाइड को कवर करने के लिए, और 5% सह2के साथ 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।

४. लहान दखल आरएनए (सिरना) अभिकर्मक

  1. सिरना अभिकर्मक और प्रवाह प्रयोगों के लिए ग्लास स्लाइड पर कोशिकाओं की तैयारी
    1. चरण 2 में प्रोटोकॉल का पालन करें (स्लाइड कोटिंग) और 3 (कांच स्लाइड पर सेल बोने की तैयारी) कांच के लिए तैयार है और प्रवाह प्रयोगों के लिए कोटिंग ।
    2. बीज कोशिकाओं 24 सिरना उपचार से पहले एच (४८ एच लामिना प्रवाह के आवेदन करने से पहले) ।
    3. बीज मानव endothelial कोशिकाओं एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में ७५०,००० पर 1 एक्स 106 सेल प्रति स्लाइड ८५% प्राप्त करने के लिए-९५% संगम अगले दिन ।
      नोट: HUVEC इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते हैं ।
  2. सिरना-लिपिड-आधारित अभिकर्मक एजेंट परिसरों की तैयारी (प्रति स्लाइड)
    1. प् याज के वांछित जीन के लिए कस् siRNAs या ऑर्डर की बनी siRNAs का डिजाइन ।
      नोट: एक सुरक्षा कैबिनेट में निम्न चरणों का पालन करें ।
    2. कम सीरम मध्यम के ४१४ µ एल में सिरना (20 µ एम स्टॉक) के 6 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण ।
    3. पतला ४९.५ µ एल के धीरे मिश्रित लिपिड आधारित अभिकर्मक रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) में कम सीरम मध्यम के १३०.५ µ l.
    4. धीरे मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    5. पतला siRNAs और लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट का मिश्रण, धीरे से मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गर्मी । मिश्रण धीरे लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट परिसरों के विघटन से बचने के लिए ।
      नोट: समाधान के रूप में जटिल प्रपत्र बादल प्रकट हो सकता है ।
    6. जबकि परिसरों के गठन कर रहे हैं, विकास के माध्यम को हटाने और कम सीरम माध्यम के साथ सेल 1x धो लो ।
    7. प्रत्येक स्लाइड में २.४ मिलीलीटर कम सीरम मध्यम जोड़ें ।
    8. जोड़ें ६०० µ धीरे मिश्रित सिरना-लिपिड-आधारित अभिकर्मक रिएजेंट परिसरों के प्रत्येक थाली के लिए, और थाली रॉक आगे और पीछे मिश्रण करने के लिए । सिरना की अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित ४० एनएम है । सुनिश्चित करें कि स्लाइड पूरी तरह से कवर किया गया है ।
    9. 4 एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
    10. एंटीबायोटिक दवाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें-मुक्त endothelial सेल विकास मीडिया 3x युक्त अभिकर्मक मिश्रण को हटाने के बिना भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के सामांय एकाग्रता ।
    11. उपयोग करने के लिए तैयार जब तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।

5. वांछित कतरनी तनाव9 के आधार पर प्रवाह की दर की गणना

  1. निंनलिखित समीकरण के अनुसार वांछित कतरनी तनाव के आधार पर प्रवाह की दर की गणना:
    Equation 1
    यहाँ
    Q एमएल/मिनट में प्रवाह की दर है;
    τ डाइन/cm2 में वांछित कतरनी तनाव है (1 Pa = 10 डाइन/cm2);
    डब्ल्यू सेमी में समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर की चौड़ाई है;
    एच सेमी में समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर की ऊंचाई है;
    µ सीपी में मीडिया की चिपचिपाहट है (जी/cm · s).
    नोट: ठेठ लामिना कतरनी तनाव प्रयोगों (गैर गुणवाला) इस कार्यप्रवाह में τ पर आयोजित कर रहे हैं = 1 Pa (10 डाइन/cm2). µ एक शंकु के रूप में एक विस्कोमीटर का उपयोग कर मापा जा सकता है और प्लेट विस्कोमीटर और सीरम और अतिरिक्त dextran9सहित मीडिया की सामग्री के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
  2. एक विशिष्ट τ (कतरनी तनाव) को प्राप्त करने के लिए, प्रवाह की दर को समायोजित करें और/ उच्च प्रवाह दर पर, अनुयाई कक्ष स्लाइड से अलग कर देना हो सकता है । ठेठ प्रवाह कक्षों के साथ नमूना प्रवाह दर तालिका 1में दिखाए जाते हैं ।

6. सेट-अप की निगरानी के लिए एक समर्पित पर्यावरण प्रणाली और कई समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर (चित्रा 2)

  1. एकाधिक अलमारियों, आंतरिक बिजली का उपयोग, और कांच के दरवाजे के साथ एक बड़ी गरम इकाई/मशीन का प्रयोग करें-समुद्र तट के रूप में निर्दिष्ट (समायोज्य सह2 और गर्मी के साथ वातावरण में निर्मित)-एकाधिक प्रवाह कक्षों के लिए एक साथ प्रयोग के लिए घर है कि दोनों कतरनी तनाव और दो या अधिक उपचार या outputs के बीच प्रत्यक्ष तुलना की आवश्यकता (यानी, डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन) ।
    नोट: समुद्र तट प्रवाह की दर सहित लगातार निगरानी के लिए अनुमति देता है, पर्यावरण के लगातार व्यवधान के बिना ।
  2. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त सह2 प्रयोग के लिए उपलब्ध है और सह2 मॉनिटर कार्यात्मक है । सुनिश्चित करें कि पानी की ट्रे को उचित रूप से भरा गया है, जैसे कि वहां humidified हवा होगी ।

7. समानांतर प्लेट प्रवाह तंत्र के सेट अप

नोट: समानांतर प्लेटों के निर्माण के लिए, कृपया लेन एट अल देखें । 9.

  1. आटोक्लेव के प्रवाह चैंबर प्लेटें, जलाशय, भीगा हुआ, टयूबिंग, और Luers के लिए प्रत्येक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर सेट अप के रूप में तालिका 2में संकेत दिया ।
  2. प्रवाह पाश विधानसभा (चित्रा 3) के सेट अप ।
    1. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तौलिए प्लेस । जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर के बिना, पहले प्रवाह पाश प्रणाली को इकट्ठा.
    2. जलाशय के लिए टयूबिंग विधानसभा कनेक्ट:
      1. एक छेद में एक #14 हार्ड ट्यूब डालें और प्रवाह जलाशय की टोपी में अंय दो छेद में दो #14 नरम ट्यूबों । सुनिश्चित करें कि मुलायम ट्यूबों में से एक बहिर्वाह टयूबिंग के रूप में जलाशय के नीचे छू लेती है ।
      2. #14 हार्ड ट्यूब के अंत में एक 1/16 "पुरुष Luer प्लेस और एक हवा वेंट के रूप में एक बाँझ फिल्टर देते हैं ।
      3. एक 1/16 "नरम बहिर्वाह ट्यूब #14 के अंत में महिला Luer प्लेस, जलाशय से आ रहा है, और एक 4 तरह टोंटी देते हैं ।
        नोट: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण या अंय अध्ययनों के लिए जहां perfusates एकत्र की जरूरत नहीं है, 2-way stopcocks इस प्रोटोकॉल में 4 तरह stopcocks के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      4. एक 1/16 "नरम बहिर्वाह ट्यूब #14 के अंत में पुरुष Luer प्लेस, जलाशय से आ रही है ।
    3. एक #13 हार्ड ट्यूब (पंप टयूबिंग) के प्रत्येक छोर पर एक 1/16 "महिला Luer जगह: जलाशय बहिर्वाह ट्यूबिंग पंप करने के लिए टयूबिंग कनेक्ट । 1/16 "पुरुष और महिला Luers एक साथ जोड़ने के द्वारा #13 हार्ड ट्यूब के लिए जलाशय से नरम बहिर्वाह ट्यूब #14 कनेक्ट ।
    4. ' भीगा हुआ पुल ' टयूबिंग के साथ पंप टयूबिंग कनेक्ट: एक 1/8 "पुरुष Luer और एक 1/8" एक #16 नरम ट्यूब के प्रत्येक छोर पर महिला Luer जगह है । कनेक्ट 1/16 "#13 हार्ड ट्यूब के महिला Luer (पंप टयूबिंग के बहिर्वाह अंत में) के साथ 1/8" #16 सॉफ्ट ट्यूब के पुरुष Luer ।
    5. प्रवाह भीगा के लिए टयूबिंग इकट्ठा: #25 नरम टयूबिंग के एक छोर पर एक 3/16 "पुरुष Luer प्लेस और प्रवाह भीगा के दूसरे पक्ष के लिए इस दोहराने । प्रवाह भीगा के प्रत्येक पक्ष के लिए #25 नरम ट्यूबों के मुक्त सिरों देते हैं ।
    6. प्रवाह गीला करने के लिए टयूबिंग के साथ ' भीगा हुआ पुल ' टयूबिंग कनेक्ट: ' भीगा हुआ पुल ' का उपयोग 1/8 "महिला Luer ' #16 से ' भीगार पुल ' की ओर और पहले से ही रखा 3/16" नर Luer के #16 नरम ट्यूब के साथ प्रवाह भीगा से एक #25 नरम ट्यूब कनेक्ट #25 नरम भीगा ट्यूब साइड से ।
    7. ' चैंबर पुल ' टयूबिंग इकट्ठा:
      1. प्लेस एक 1/8 "महिला Luer और एक 1/8" पुरुष Luer एक #16 सॉफ्ट ट्यूब के प्रत्येक छोर पर (' चैंबर ब्रिज ' टयूबिंग) ।
      2. कनेक्ट 1/8 "महिला Luer ' चैंबर पुल ' के साथ 3/16" पुरुष Luer पर #25 नरम ट्यूब प्रवाह भीगा के मुक्त अंत से.
      3. 1/8 "कक्ष ' पुल टयूबिंग के पुरुष Luer (मुक्त अंत) में, जगह एक 4 तरह टोंटी ।
    8. कनेक्ट 4-रास्ता टोंटी से ' चैंबर ' ब्रिज मुक्त अंत करने के लिए 4-रास्ता टोंटी जलाशय से बहिर्वाह नरम टयूबिंग (से कदम 7.2.2.3) । stopcocks बंद करा.
    9. जलाशय और भीगा हुआ मीडिया जोड़ें । कतरनी तनाव के लिए ४८-h जोखिम के लिए, जलाशय के लिए मीडिया के ३५ मिलीलीटर और भीगा करने के लिए 25 मिलीलीटर जोड़ें । प्रवाह प्रयोग की अवधि और वरीयता प्राप्त कक्षों की संख्या के आधार पर मीडिया की मात्रा समायोजित करें ।
    10. समुद्र तट में पंप करने के लिए इकट्ठे प्रवाह पाश प्रणाली लाओ । पंप सिर में #13 हार्ड ट्यूब (पंप टयूबिंग) प्लेस और यह सुरक्षित । stopcocks खोलें ।
    11. पंप पर बारी और धीरे पंप गति में वृद्धि । मीडिया लूप सिस्टम के माध्यम से प्रसारित करने दें । किसी भी रिसाव या रुकावट के लिए जाँच करें (जैसे, दबाव बिल्ड-अप). सुनिश्चित करें कि मीडिया जलाशय में वापस बह रहा है ।
  3. प्रवाह चैंबर विधानसभा के सेट अप
    1. एक #16 नरम ट्यूब के एक छोर पर एक 1/8 "महिला Luer प्लेस और एक 4 तरह टोंटी देते हैं । ट्यूब के शीर्ष प्लेट के दाईं ओर (बहिर्वाह पक्ष) के लिए मुक्त अंत देते हैं ।
    2. एक #16 नरम ट्यूब के एक छोर पर एक 1/8 "पुरुष Luer प्लेस और एक 4 तरह टोंटी देते हैं । शीर्ष प्लेट (बहिर्वाह पक्ष) के बाईं ओर करने के लिए ट्यूब के मुक्त अंत देते हैं ।
    3. एक 1/8 "पुरुष Luer और एक 1/8" एक #16 नरम ट्यूब (बुलबुला जाल टयूबिंग) के प्रत्येक के अंत में महिला Luer प्लेस । 1/8 "पुरुष Luer के माध्यम से बुलबुला जाल के लिए टयूबिंग संलग्न । 1/8 "महिला Luer के माध्यम से टयूबिंग के दूसरे छोर पर एक 4 तरह टोंटी देते हैं ।
    4. बाँझ चिमटी का प्रयोग, 4-अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश से नीचे थाली पर अवकाश के लिए सेल वरीयता प्राप्त गिलास स्लाइड हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि कांच की स्लाइड के ऊपर की ओर कोशिका-वरीयता का सामना करना पड़ रहा है ।
    5. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, थाली के आसपास लाल गैसकेट लाइन के भीतर नीचे की थाली के लिए गर्म मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें । मीडिया को स्लाइड के माध्यम से प्रवाहित करने और कक्षों को कवर करने दें । सीधे स्लाइड पर मीडिया जोड़ने से बचें ।
    6. धीरे नीचे थाली पर शीर्ष थाली जगह है, एक तरफ से दूसरे को संरेखित । हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचें । प्लेटों को एक साथ कसकर पेंच ।
    7. प्लेट के दाईं ओर (बहिर्वाह) पर टोंटी खोलने और धीरे गर्म एक 30 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर मीडिया के 20 मिलीलीटर निस्तब्धता से बुलबुला जाल से हवा के बुलबुले निकालें । सुनिश्चित करें कि प्लेट के बायीं ओर टोंटी (बहिर्वाह) बंद है और यह कि मीडिया बबल ट्रैप टोंटी (open) के माध्यम से बह रहा है । फ़्लश मीडिया छोड़ें ।
    8. बबल ट्रैप पर टोंटी बंद करें और टोंटी को चैंबर के बायीं ओर (बहिर्वाह) पर खोलें । एक ४५ ° कोण के लिए छोड़ दिया ओर चैंबर के (बहिर्वाह) तरक्की और धीरे गर्म एक 30 मिलीलीटर का उपयोग कर मीडिया के 20 मिलीलीटर फ्लश सही पक्ष (बहिर्वाह) चैंबर से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कक्ष से । बुलबुले खिड़की के माध्यम से visualized किया जा सकता है । फ़्लश मीडिया छोड़ें ।
    9. चैंबर और कैप के दोनों ओर stopcocks बंद करें । माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं का निरीक्षण.
    10. पहले से इकट्ठे पाश प्रणाली के साथ समुद्र तट के लिए चैंबर परिवहन ।
    11. धीरे पंप की गति कम हो और पंप रोकें । रिसाव को रोकने के लिए फ्लो लूप सिस्टम पर stopcocks बंद करें ।
    12. stopcocks के माध्यम से चैंबर और पाश प्रणाली एक साथ कनेक्ट. सभी stopcocks को खोलो ।
    13. धीरे पंप गति बढ़ाने के लिए और किसी भी रिसाव या रुकावट के लिए सेट अप की जांच । सुनिश्चित करें कि मीडिया एक दिशा में परिचालित है और जलाशय में लौटता है ।
    14. चैंबर के प्रवाह की ओर स्थित ' चैंबर पुल ' टयूबिंग पर प्रवाह संवेदक प्लेस । सुनिश्चित करें कि सेंसर प्रवाह की दिशा में ठीक से उन्मुख है.
    15. पंप गति को समायोजित प्रवाह की दर है कि पहले की गणना की थी, वांछित कतरनी तनाव के आधार पर प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: प्रवाह की दर ऊंचाई और प्रत्येक चैंबर की चौड़ाई, साथ ही साथ मीडिया की चिपचिपाहट के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
    16. सह2 टैंक पर बारी 5% सह हासिल करने के लिए2 और समुद्र तट के अंदर एक पानी की ट्रे जगह है ।

8. कोशिकाओं की कटाई और प्रवाह कक्ष से आरएनए के निष्कर्षण

  1. एक बार वांछित समय प्रवाह की अवधि के पूरा हो गया है, धीरे से 0 को सिकुड़नेवाला पंप गति नीचे बारी और बिजली बंद । जल्दी से सभी खुले stopcocks बंद करो और चैंबर और प्रत्येक के अंत पर एक टोंटी के साथ संलग्न टयूबिंग निकालें ।
  2. एक साफ benchtop के लिए चैंबर ले लो और धीरे से शीर्ष प्लेट को हटाने के लिए सभी शिकंजा बिगाड़ना । सुई नाक चिमटी का उपयोग करना, नीचे थाली से गिलास स्लाइड को हटाने और यह एक १०० मिमी व्यास ऊतक संस्कृति डिश में जगह है ।
  3. इस स्लाइड को ठंडे फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं-खारा (पंजाब)-/-और प्रवाह की दिशा में सेल पालन और संरेखण की पुष्टि करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें ।
  4. पंजाबियों को प्लेट से महाप्राण और स्लाइड को क्लीन १०० एमएम व्यास डिश में ट्रांसफर करें । lysis बफर के ३५० µ एल आरएनए निष्कर्षण किट से जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), बीटा के 1/100 युक्त-mercaptoethanol, स्लाइड करने के लिए.
    चेतावनी: एक रासायनिक धुएं हुड में बीटा-mercaptoethanol जोड़ें ।
  5. एक पॉलीथीन-ब्लेड वाले सेल स्क्रैप का उपयोग करके कक्षों को स्लाइड से बाहर नोच । ऊतक संस्कृति पकवान झुकाव, तल पर पूल के लिए तरल को सक्षम करने, और संदंश के साथ कांच स्लाइड हटा दें । पिपेट सेल को १.५-एमएल ट्यूब में lysate और इसे बर्फ पर रखें ।
  6. यह नमूना करने के लिए जोड़ने से पहले सीरियल कमजोर पड़ने के माध्यम से शेयर exogenous संदर्भ आरएनए (luciferase आरएनए) ०.००२५ एनजी/µ एल पतला । उदाहरण के लिए, यदि शेयर एकाग्रता है 1 µ g/µ l, 1/400000 के एक कमजोर पड़ने ०.००२५ एनजी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है/µ l. बहाव आरएनए अलगाव और विश्लेषण के लिए सेल µ के प्रत्येक नमूने के लिए पतला luciferase आरएनए के 10 lysate एल जोड़ें.
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें, या निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने के लिए सक्षम जब तक-८० ° c lysate फ्रीज ।

9. आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण की दक्षता की गणना

नोट: RT-qPCR के बाद luciferase दक्षता की गणना सैद्धांतिक उपज और प्रयोगात्मक उपज की तुलना करके.

  1. luciferase आरएनए के लिए सैद्धांतिक उपज का निर्धारण ।
    1. प्रति नमूना जोड़ा luciferase प्रतियों की कुल राशि का निर्धारण । (जोड़ने ०.०२५ एनजी/नमूना = २.७३ एक्स 107 आरएनए निष्कर्षण करने से पहले नमूना प्रति luciferase आरएनए की प्रतियां.)
    2. ३३० g/मोल की न्यूक्लियोटाइड प्रति एक औसत आणविक जन का उपयोग करके luciferase आरएनए के आणविक द्रव्यमान की गणना और जुगनू luciferase आरएनए, १६५२ न्यूक्लियोटाइड की लंबाई से गुणा ।
    3. दाढ़ मात्रा उपज के लिए आणविक जन द्वारा आरएनए निष्कर्षण करने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ा (०.०२५ एनजी) luciferase आरएनए की राशि विभाजित करें । फिर, अवोगाद्रो की संख्या से प्रति नमूना जोड़ा प्रतियां उपज करने के लिए कि गुणा ।
    4. समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक RT-qPCR प्रतिक्रिया के लिए luciferase प्रतियों के लिए सैद्धांतिक प्राप्ति की गणना करें:
      Equation 2
  2. rt-qPCR के लिए एक मानक वक्र जनरेट करने के लिए luciferase प्लाज्मिड का उपयोग करके प्रत्येक rt-qPCR प्रतिक्रिया के लिए luciferase प्रतियों के लिए प्रयोगात्मक प्राप्ति की गणना करें ।
  3. luciferase क्षमता (%) समीकरण का उपयोग कर गणना:
    Equation 3

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Representative Results

प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर luciferase प्लाज्मिड के सफल linearization एक agarose जेल (चित्रा 1) पर पचा उत्पादों को चलाने के द्वारा पुष्टि की गई थी । रैखिक उत्पाद के आकार डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर और बिना खतना के प्लाज्मिड के साथ तुलना द्वारा पुष्टि की थी ।

हम समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर सेट अप लेन एट अल से अनुकूलित है । 9 प्रयोगों के लिए कि एकाधिक शर्तों/कतरनी तनाव या एकाधिक कतरनी तनाव की स्थिति के साथ उपचार की आवश्यकता है । हम एक समर्पित वातावरण का उपयोग करें, समुद्र तट, कि कई घर कर सकते हैं, पूरी तरह से इकट्ठे प्रवाह सर्किट है कि सभी प्रवाह दरों (चित्रा 2) की निगरानी की है । प्रवाह की दर पर नजर रखी है समानांतर-प्लेट विधानसभा (चित्रा 3) के बस ऊपर । प्रवाह सर्किट और दरों के समुद्र तट के भीतर तापमान, आर्द्रता, या गैस की सामग्री में उतार चढ़ाव के कारण के बिना कांच के दरवाजों के माध्यम से सीधे निगरानी की जा सकती है ।

विनिर्माण प्रक्रियाओं चैंबर ऊंचाई में छोटे बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, प्रवाह दरों प्रत्येक चैंबर के लिए गणना की जानी चाहिए एक ही कतरनी तनाव (1 टेबल) को प्राप्त करने के लिए । सिद्धांत रूप में, एक समान ऊंचाइयों के साथ चैंबर एक ही कतरनी तनाव को प्राप्त करने के लिए समान प्रवाह दरों का उपयोग कर सकते हैं और श्रृंखला में इस्तेमाल किया जा सकता. endothelial कोशिकाओं के साथ ठेठ प्रयोगों 0 के कतरनी तनाव का उपयोग-१.५ pa. 1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लामिना कतरनी तनाव मॉडल धमनी endothelial कतरनी तनाव को इस कार्यप्रवाह में इस्तेमाल किया गया था । वहां भी पंप सिर सेटिंग्स के बीच बदलाव और उपयोग के साथ समय पर पंप प्रमुखों के भीतर हो सकता है । प्रवाह मीटर का उपयोग इन मतभेदों के लिए खाते कर सकते हैं ।

कतरनी तनाव के आवेदन का उपयोग प्रयोग अक्सर कई कतरनी तनाव की स्थिति, उपचार की स्थिति, और समय अंक शामिल । जहां संभव हो, हम प्रयोगात्मक सेट-अप में किसी भी variabilities के लिए खाते के लिए एक अंतर्जात संदर्भ आरएनए का उपयोग करें । कुछ प्रयोगों के लिए, मात्रात्मक स्थिरता के साथ एक अंतर्जात संदर्भ आरएनए ढूँढना संभव16नहीं है. इसके अलावा, मात्रात्मक स्थिरता या नमूनों के बीच अंतर्जात संदर्भ जीन की अस्थिरता सेलुलर अभिव्यक्ति के स्तर या आरएनए निकालने या रिवर्स प्रतिलेखन की क्षमता में बदलाव पर या तो उत्तेजना पर निर्भर प्रभाव के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । इन अक्षमताओं के लिए खाते में, और सेटिंग में जहां एक अंतर्जात संदर्भ जीन मात्रात्मक रूप से स्थिर नहीं है, हम एक कील का उपयोग exogenous संदर्भ जीन में । स्तनधारी endothelial कोशिकाओं में लामिना कतरनी तनाव को शामिल प्रयोगों के लिए, हम एक exogenous आरएनए स्पाइक में (चित्रा 4a) के रूप में एक जुगनू luciferase आरएनए का उपयोग करें ।

चित्रा 4 से पता चलता है विश्लेषण RT-कतरनी तनाव Krüppel का आकलन-कारक 2 (KLF2) के नुकसान की तरह समारोह सिरना का उपयोग कर प्रयोग से प्रयोगात्मक डेटा qPCR । KLF2 एक प्रतिलेखन कारक endothelial कोशिकाओं और endothelial प्रवाह2की स्थापना में लामिना जीन अभिव्यक्ति की एक प्रमुख transcriptional मध्यस्थ द्वारा विनियमित लामिना प्रवाह है ।

चित्रा 4a तीन अलग प्रयोगों के लिए luciferase क्षमता से पता चलता है, प्रत्येक दो प्रवाह कक्षों का उपयोग कर । Luciferase क्षमता एक प्रयोग के नमूनों के बीच समान हो सकता है (प्रयोग 1) या कुछ परिवर्तनशीलता (प्रयोग 2 और 3) (चित्रा 4a) दिखाओ । ये परिणाम प्रयोगात्मक प्रणालियों में विशेष रूप से मूल्यवान है जहां केवल छोटे निरपेक्ष परिवर्तन देखा जाता है । एक exogenous संदर्भ जीन के उपयोग के प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, जहां प्रयोगात्मक उपचार रिवर्स प्रतिलेखन या पीसीआर17की दक्षता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । चित्रा 4a में चित्रित परिणाम ठेठ हैं । 5% की एक luciferase क्षमता इंगित करता है कि luciferase आरएनए के 5% (यानी, आरएनए के आरंभिक प्रारंभिक राशि) के नमूने से पहले आरएनए निष्कर्षण के लिए जोड़ा गया RT-qPCR द्वारा पता लगाया है. एक ही प्रयोग के भीतर नमूनों या शर्तों के बीच, luciferase क्षमता आमतौर पर ५०% ± रहे हैं । परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए अगर luciferase क्षमता की परिवर्तनशीलता है > ५०% और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और शर्तों की समीक्षा शामिल होना चाहिए ।

चित्रा 4B दोहराया कतरनी तनाव प्रयोगों से RT-qPCR के ठेठ प्रयोगात्मक परिणाम से पता चलता है, प्रत्येक एकाधिक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों का उपयोग कर । प्रत्येक प्रयोग के भीतर, KLF2 mRNA अभिव्यक्ति तीन मायनों में सामान्यीकृत है । पहला सामांयीकरण एक अंतर्जात संदर्भ आरएनए, Cyclophilin ए (CycA) का उपयोग करता है । दूसरा सामांयीकरण एक exogenous संदर्भ आरएनए, जुगनू luciferase (ल्यूक) का उपयोग करता है । तीसरा सामांयीकरण अंतर्जात और exogenous संदर्भ आरएनए दोनों का उपयोग करता है । प्रत्येक प्रयोग के भीतर चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, सभी तीन सामांय तरीकों (अंतर्जात संदर्भ जीन को सामांय, exogenous संदर्भ जीन, और दोनों अंतर्जात और exogenous संदर्भ जीन एक साथ) इसी तरह के परिणाम पैदावार । यदि सामांय विधि परिणाम बदलता है (उदा., करने के लिए लीड > ५०% अंतर), परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए । जब सामांयीकरण के तरीकों के बीच काफी परिवर्तनशीलता है, अंतर्जात संदर्भ जीन (ओं) की समीक्षा की जानी चाहिए, क्योंकि यह प्रयोगात्मक प्रणाली में एक निर्भर चर हो सकता है । इसी प्रकार प्रायोगिक प्रक्रियाओं एवं शर्तों की समीक्षा की जानी चाहिए । चित्रा 4Bमें, KLF2 पछाड़ना तीन अलग प्रयोगों के बीच सिरना पैदावार समान पछाड़ना क्षमता का उपयोग कर (प्रयोग 1, 2, और 3) । हम इन प्रयोगों के लिए तीन अलग जैविक नमूनों का इस्तेमाल किया, दो एक साथ एक प्रयोग के लिए 1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी में कतरनी तनाव के साथ प्रवाह मंडलों चल रहा है ।

Figure 1
चित्रा 1: exogenous luciferase प्लाज्मिड के linearization की Agarose जेल छवि । Supercoiled और 1 kb + डीएनए सीढ़ी मार्कर के रूप में दोनों काटा हुआ और kilobases (kb) में luciferase प्लाज्मिड आकार में कटौती का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक समर्पित वातावरण के भीतर कई प्रवाह सर्किट विधानसभाओं के योजनाबद्ध सिंहावलोकन (समुद्र तट) । दोनों प्रवाह सर्किट में प्रवाह दरों को आसानी से वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं, पर्यावरण परेशान बिना, और दोनों सर्किट एक साथ चला सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक एकल प्रवाह सर्किट विधानसभा के योजनाबद्ध सिंहावलोकन । टयूबिंग आकार और इस्तेमाल किया Luers इस आंकड़े में संकेत दिया जाता है । यह सुनिश्चित करें कि प्रवाह मीटर प्रवाह की दिशा में उंमुख और प्रवाह चैंबर के ऊपर रखा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मानव endothelial कोशिकाओं में KLF2 हानि के समारोह प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम कतरनी तनाव को उजागर (1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए 24 एच । (क) यह पैनल तीन पृथक प्रवाह प्रयोगों में exogenous luciferase आरएनए के ठहराव को दिखाता है. Luciferase क्षमता एक प्रयोग के नमूनों के बीच समान हो सकता है (प्रयोग 1) या कुछ परिवर्तनशीलता (प्रयोग 2 और 3) दिखाएँ. Luciferase (निरपेक्ष प्रतियां) एक मानक वक्र का उपयोग निरपेक्ष quantitation द्वारा रिवर्स-transcriptase मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) द्वारा पता चला Luciferase आरएनए की प्रतिलिपि संख्या है । Luciferase दक्षता प्रयोगात्मक Luciferase प्रत्येक १०० द्वारा गुणा नमूना के लिए सैद्धांतिक Luciferase प्रतियां द्वारा विभाजित प्रतियां है (प्रोटोकॉल के चरण 8 देखें) । सापेक्ष luciferase दक्षता प्रत्येक प्रयोग के भीतर संदर्भ शर्त (प्रवाह + Ctlsi) द्वारा विभाजित प्रत्येक नमूने की luciferase क्षमता है । (ख) इन पैनलों नमूना कतरनी तनाव प्रयोगों का एक सेट में जीन अभिव्यक्ति के सामांय दोनों अंतर्जात और exogenous संदर्भ जीन का उपयोग कर दिखाते हैं । परिणाम रिवर्स-transcriptase मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) से हैं । KLF2 mRNA अभिव्यक्ति की पछाड़ना 24 ज. एफसी के लिए 1 Pa के कतरनी तनाव के साथ लामिना प्रवाह की उपस्थिति में दिखाया गया है = गुना बदलें; CycA = cyclophilin एक, एक अंतर्जात संदर्भ आरएनए के रूप में इस्तेमाल किया; ल्यूक = luciferase, एक exogenous संदर्भ आरएनए के रूप में इस्तेमाल किया. डेटा मैन एट अल से अनुकूलित । 5. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चैंबर ऊंचाई
(माइक्रोन; µm)		 चैंबर चौड़ाई
(सेंटीमीटर; मुख्यमंत्री) 		1 Pa कतरनी तनाव के लिए प्रवाह दर (एमएल/ चिपचिपापन (centipoise; सीपी)
३०३.८० १.९० १९.४८ ०.९०
३२६.१० १.९० २२.४५ ०.९०
३४४.८४ १.९० २५.१० ०.९०
३१९.०६ १.९० २१.४९ ०.९०

तालिका 1: चैंबर हाइट्स और विभिंन प्रवाह कक्षों के लिए प्रवाह दरों के उदाहरण 1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के कतरनी तनाव को प्राप्त करने के लिए ।

जंमू क्लॉथ
चिमटी
जलाशय की बोतल और कैप
भीगा और कैप
प्रवाह लूप
1/16 "नर Luer x 3
1/16 "महिला Luer x 3
1/8 "नर Luer x 2
1/8 "महिला Luer x 4
3/16 "पुरुष अनुकूलक एक्स 2
14 L/एस हार्ड ट्यूब (2 इंच) x 1
14 L/एस सॉफ्ट ट्यूब (5 इंच) x 2
16 L/एस सॉफ्ट ट्यूब (3 इंच) x 2
25 L/एस सॉफ्ट ट्यूब (3 इंच) x 2
13 L/एस हार्ड ट्यूब (10 इंच) x 1
फ्लो चैंबर
1/8 "नर Luer x 2
1/8 "महिला Luer एक्स 2
16 L/एस सॉफ्ट ट्यूब (3 इंच) x 3
ऊपर और नीचे प्लेटें
शिकंजा

तालिका 2: पार्ट्स प्रोटोकॉल के चरण ६.२ में autoclaved किया जा करने के लिए ।

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Discussion

कतरनी तनाव एक शारीरिक हालत है कि endothelial समारोह, भाग में, स्थिर-राज्य जीन अभिव्यक्ति2,5को प्रभावित करने से संग्राहक है । विभिंन कतरनी तनाव की स्थिति में जीन विनियमन के मॉडल endothelial समारोह की एक बड़ी समझ में योगदान देगा । इस व्यावहारिक कार्यप्रवाह एक प्रवाह सर्किट लेन एट अल से अनुकूलित एक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग भी शामिल है । 9 और लामिना, गैर गुणवाला प्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । कुल मिलाकर स्थापित करने के लिए प्रयोग की सुविधा है कि कई प्रवाह कक्षों की आवश्यकता है और इस सेटिंग में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था ।

प्रवाह सर्किट विधानसभा इस कार्यप्रवाह का एक प्रमुख घटक है और लेन एट अल से अनुकूलित है । 9. इस विधानसभा और प्रोटोकॉल के कई रूपांतरों प्रयोगात्मक प्रणालियों में मतभेदों को प्रतिबिंबित करने के लिए किए गए थे । एक बड़े गर्म इकाई, समुद्र तट, एक ही वातावरण के भीतर एक साथ आपरेशन और कई प्रवाह सर्किट की निगरानी की सुविधा है कि एक अनुकूलन है. इस प्रणाली को सफलतापूर्वक विभिंन समय अवधि के लिए endothelial कोशिकाओं के लिए कतरनी तनाव के आवेदन के लिए इस्तेमाल किया गया है, 1 ज से 7 दिनों के लिए, और कतरनी तनाव के कई स्तरों पर (जैसे, १.०, १.५, और २.० फिलीस्तीनी अथॉरिटी) । यह प्रणाली भी जीन पछाड़ना अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया एक प्रवाह के समारोह-उत्तरदायी endothelial के कार्य का आकलन करने के लिए कतरनी तनाव की सेटिंग में जीन (4 चित्रा)5. वहां पंपों और पंप सिर, जो भी समय के साथ सामांय पहनने और आंसू की वजह से बदल सकता है के बीच काफी परिवर्तनशीलता है । इन मतभेदों के लिए खाते में, हम प्रवाह चैंबर के लिए लगातार प्रवाह दर की निगरानी समीपस्थ स्थित एक प्रवाह संवेदक का उपयोग करें । टयूबिंग और Luers के विभिंन आकारों में प्रत्येक घटक के लिए एक तंग फिट सुनिश्चित करने के लिए और प्रयोगों के दौरान किसी भी रिसाव को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है । हम कोशिकाओं गिना और गिलास स्लाइड, dropwise प्रति लगभग १,०००,००० कोशिकाओं वरीयता प्राप्त है, और फिर कोशिकाओं 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन पालन क्षमता बढ़ाने के लिए । endothelial जनक कोशिकाओं की तुलना में, जो कम समय के लिए कतरनी तनाव9के आवेदन करने से पहले के लिए वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, हम छोटे से कम 24 के लिए endothelial कोशिकाओं बीज कतरनी तनाव के आवेदन करने से पहले एच । कम अवधियों के प्रवाह के दौरान कोशिकाओं के विनियोजित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या endothelial कोशिकाओं की एक सतत परत, यहां तक कि उचित बोने की सघनता के साथ. हम दोनों से पहले और कतरनी तनाव के आवेदन के बाद endothelial कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह monolayer के लिए स्लाइड के निरीक्षण पर जोर दिया । हम पाते है कि स्लाइड fibronectin, एक प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स घटक18के साथ लेपित, endothelial monolayer अधिक लगातार जिलेटिन (विकृत fibrillar प्रकार मैं कोलेजन) के साथ लेपित पक्षों की तुलना में बनाए रखने । अंत में, इस प्रोटोकॉल में प्रवाह गीला करने वाले मीडिया के 30 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, अंय निर्माताओं के लिए मीडिया के १९० मिलीलीटर की तुलना में ।

प्रवाह सर्किट विधानसभा में कई कदम अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता है । endothelial कोशिकाओं की एक भी monolayer कतरनी तनाव के आवेदन करने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए । स्लाइड का पालन करने वाले कक्षों की संख्या बढ़ाने के लिए कांच स्लाइड dropwise पर बीज कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, और इस प्रकार, समग्र स्लाइड कवरेज । सेल सीडिंग के बीच प्रतीक्षा समय और स्लाइड में अतिरिक्त मीडिया जोड़ने से आम तौर पर क्षमता में सुधार होता है क्योंकि यह कक्षों को बहु-स्लाइड ट्रे में दूर धोने के बजाय स्लाइड का पालन करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है । नेत्रहीन कोशिकाओं से पहले निरीक्षण, के दौरान, और कतरनी तनाव के आवेदन के बाद । एक खुर्दबीन इस प्रयोजन के लिए समुद्र तट में रखा जा सकता है । प्रवाह संवेदक सही अभिविन्यास में संलग्न किया जाना चाहिए और लक्ष्य प्रवाह दर प्रत्येक व्यक्ति प्रवाह चैंबर के लिए जाँच की जानी चाहिए. प्रवाह पाश प्रणाली चैंबर बिना कोई मीडिया रिसाव या अंय समस्याओं, जैसे दबाव निर्माण, वास्तविक प्रयोगों के दौरान कोशिकाओं perturbing से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए perfused किया जाना चाहिए । के लिए निरीक्षण और प्रणाली में बुलबुले को खत्म । जबकि प्रवाह पाश प्रणाली का परीक्षण, सुनिश्चित stopcocks सभी सिकुड़नेवाला पंप पर मोड़ से पहले खुले है निर्बाध, एकतरफ़ा प्रवाह की अनुमति । सुनिश्चित करें कि सभी stopcocks लूप करने के लिए प्रवाह कक्ष संलग्न करने से पहले बंद कर रहे है और पूरी तरह से पंप शुरु करने से पहले खोला ।

हम पाते है कि एक exogenous संदर्भ जीन के अलावा परिदृश्यों की एक किस्म में सहायक है । Endothelial सेल मीडिया अक्सर हेपरिन होता है, जो पीसीआर17के एक अवरोधक है । कुछ आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल हेपरिन निकालने के लिए कदम शामिल करते हैं, मात्रा का पता लगाने के नमूनों के बीच पीसीआर क्षमता में मतभेद पैदा कर सकता है । शक्तिशाली उपचार भी एक अंतर्जात संदर्भ जीन है कि मात्रात्मक स्थिर है की पहचान बाधा हो सकता है । हमारी प्रयोगशाला एक exogenous संदर्भ आरएनए के रूप में उपयोग करने के लिए 5 '-छाया हुआ और पाली-एक पूंछ luciferase आरएनए के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का निर्माण किया है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए खरीदने की तुलना में यह कार्यनीति लागत-प्रभावी दृष्टिकोण साबित हुई है. exogenous संदर्भ आरएनए की तैयारी के दौरान, यह कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए एकल उपयोग aliquots में आरएनए aliquot करने के लिए महत्वपूर्ण है । पूरी तरह से मिश्रण और सटीक pipetting अंतर aliquot निरंतरता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । ठेठ प्रयोगों 5% ± २.५% की सीमा में एक luciferase दक्षता दिखाने के लिए, लेकिन 1% से लेकर कर सकते है-10% । यह दोनों exogenous संदर्भ आरएनए दक्षता और एक अंतर्जात संदर्भ (गृह व्यवस्था) जीन के लिए RT-qPCR परिणाम सही करने के लिए विवेकपूर्ण है ।

प्रयोगों हम आचरण के लिए, जुगनू luciferase अनुक्रम स्तनधारी मॉडल में एक गैर स्तनधारी स्पाइक-संदर्भ आरएनए के रूप में उपयोग किया जाता है । प्रयोगों में जहां जुगनू luciferase कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, यह एक उपयुक्त संदर्भ जीन नहीं होगा । अंय प्रजातियों-विशिष्ट संदर्भ जीन Caenorhabditis एलिगेंस miRNA cel-मीर-३९19 और ribulose bisphosphate carboxylase संयंत्र आरएनए20सहित, इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह फ्लो सर्किट मॉडल endothelial कोशिकाओं की एक 2-डी monolayer टिशू कल्चर प्लास्टिक या ग्लास पर उगाया जाता है, जो काफी कड़ा है । मैट्रिक्स कठोरता द्रव कतरनी21तनाव को endothelial प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं । इस मॉडल प्रणाली एक अपेक्षाकृत उच्च ऑक्सीजन और अधिक शिरापरक ऑक्सीजन सांद्रता से धमनी के समान एकाग्रता का उपयोग करता है । इस मॉडल बारीकी से एक बंद हृदय प्रणाली में बड़ा जहाजों के सीधे क्षेत्रों जैसा दिखता है और स्लाइड पर endothelial कोशिकाओं के लिए एक अपेक्षाकृत समरूप वातावरण प्रदान करता है । 3-डी संरचनाओं में अंय विशिष्ट स्थितियों, जैसे bifurcations या जहाजों की वक्रता, इस मॉडल के साथ प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं । अंय प्रणालियों vasculature के घुमावदार क्षेत्रों में उन सहित अंय प्रवाह पैटर्न मॉडल, कर सकते हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रणाली से कम कोशिकाओं उपज । इसी तरह, अंय असेंबली अधिक उपयुक्त हो सकता है यदि > 1 x 106 कक्ष आवश्यक हैं, या यदि कोई एकल-कक्ष विश्लेषण आवश्यक है । हमारे वर्तमान आवेदन मॉडल गैर गुणवाला लामिना प्रवाह । फिर भी, इस मॉडल के प्रवाह दरों लगातार निगरानी कर रहे हैं के रूप में स्थिरता के साथ, गुणवाला या थरथरानवाला waveforms सहित अन्य waveforms, उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

कुल मिलाकर, इस व्यावहारिक कार्यप्रवाह निगरानी प्रवाह दरों के साथ कई प्रवाह कक्षों के लिए कतरनी तनाव के एक साथ आवेदन के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है । इस कार्यप्रवाह में सामग्री और प्रक्रिया नमूनों और शर्तों के बीच प्रायोगिक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए डिज़ाइन की गई हैं । इस कार्यप्रवाह सफलतापूर्वक लामिना प्रवाह की सेटिंग में RNAi प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है और भी लामिना कतरनी तनाव के साथ कई शर्तों की आवश्यकता होती है किसी भी प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एकाधिक लामिना कतरनी तनाव परिमाण और/ वैकल्पिक waveforms.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम CIHR P.A.M. H.S.J.M. द्वारा समर्थित किया गया था एक कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम में अपक्षयी चिकित्सा फैलोशिप के संस्थानों के एक प्राप्तकर्ता है । H.S.J.M., A.N.S., K.H.K., और M.K.D. विज्ञान और प्रौद्योगिकी में महारानी एलिजाबेथ द्वितीय स्नातक छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA gibco 25300-062
10 mL Syringe BD 302995
10 mm2 Culture Dish Sarstedt 83.3902
30 mL Syringe BD 302832
4-Way Stopcocks Discofix D500
Aluminum foil
BEACH Darwin Chambers Company MN: HO85, SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2 Meter BioSphenix, Ltd. MN: P120, SN: 0342
CO2 Sensor BioSphenix, Ltd. MN: C700, SN: 52852
Distilled water gibco 15230-170
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- gibco 14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2 Promo Cell C-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix Promo Cell C-39216
Fibronectin (pure) Sigma-Aldrich 11051407001
Filter (0.20 um) Sarstedt 83.1826.001
Flow Dampener and Cap U of T glass blowing shop
Flow Meter: 400 Series Console Transonic Scisense Inc. T402
Flow Meter: 400 Series Tubing Transonic Scisense Inc. TS410
Flow Reservoir and Cap U of T glass blowing shop
Flow Sensor Transonic Scisense Inc. ME4PXL
Isotemp 737F Oven Fisher Scientific FI-737F
J cloth J cloth
Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) Fisherfinest 12-544-4
Paper sterilization pouch Cardinal Health 92713
Pump (Masterflex L/S Economy Drive) Cole-Parmer 7554-90
Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) Cole-Parmer 7518-00
Rectangular 4 Well Dish Thermo Scientific 267061
Tweezers
Name Company Catalog Number Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-14
Name Company Catalog Number Comments
Luer
3/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-08 For #25 tubing
1/8" Male Luer Cole-Parmer 30800-24 For #16 tubing
1/8" Female Luer Cole-Parmer 30800-08 For #16 tubing
1/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-00 For #14 tubing
1/16" Female Luer Cole-Parmer 45508-00 For #14 tubing
Name Company Catalog Number Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent Invitrogen 12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Medium gibco 31985-070
Name Company Catalog Number Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladder Thermo Scientific SM1331
MEGAclear Kit Ambion AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
pSP-luc+ Promega E4471
Supercoiled DNA Ladder New England BioLabs Inc. N0472S
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
UltraPure Ethidium Bromide Invitrogen 15585011
XhoI Restriction Enzyme New England BioLabs Inc. R0146S
Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction
Beta-mercaptoethanol Sigma M3148-100mL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४० फ्लो चैंबर कतरनी तनाव लामिना प्रवाह समानांतर प्लेट निगरानी endothelium जीन अभिव्यक्ति जीन विनियमन मात्रात्मक पीसीआर सामान्यीकरण luciferase संदर्भ आरएनए
Endothelial कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एकाधिक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग कर कतरनी तनाव को उजागर
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Man, H. S. J., Sukumar, A. N., Ku, K. H., Dubinsky, M. K., Subramaniam, N., Marsden, P. A. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. J. Vis. Exp. (140), e58478, doi:10.3791/58478 (2018).

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