Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Berika och utöka sällsynta Antigen-specifika T-celler med magnetiska nanopartiklar

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Antigen-specifika T-celler är svårt att karakterisera eller utnyttja i terapier på grund av sin extremt low-frekvens. Häri, vi tillhandahåller ett protokoll för att utveckla en magnetiska partikel som kan binda till antigen-specifika T-celler för att berika dessa celler och sedan expandera dem flera gånger för både karakterisering och terapi.

Abstract

Vi har utvecklat ett verktyg för att både berika och utöka antigen-specifika T-celler. Detta kan vara användbart i fall A) upptäcka förekomsten av antigen-specifika T-celler, B) sond dynamiken i antigen-specifika svaren, C) förstå hur antigen-specifika svar påverka sjukdomstillstånd såsom autoimmunitet, D) avmystifiera heterogena Svaren för antigen-specifika T-celler, eller E) utnyttja antigen-specifika celler för behandling. Verktyget är baserat på en magnetiska partikel att vi konjugat antigen-specifika och T-cell co-stimulatory signaler och att vi termen som konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Följaktligen, eftersom tekniken är enkel att tillverka, det kan lätt antas av andra laboratorier. Således är vårt syfte här att beskriva i detalj tillverkning och efterföljande användning av aAPCs. Vi förklarar hur man fäster antigen-specifika och co-stimulatory signaler i aAPCs, hur man utnyttjar dem att berika för antigen-specifika T-celler och hur att utöka antigen-specifika T-celler. Dessutom kommer vi att belysa engineering design överväganden baserad på experimentella och biologisk information om våra erfarenheter med kännetecknar antigen-specifika T-celler.

Introduction

Med ökningen av många immunterapier finns det ett behov av att kunna karakterisera och styra immunsvar. I synnerhet är det adaptiva immunsvaret av intresse på grund av specificitet och hållbarhet av cellerna. Nyligen, chimär-antigen-receptor T cell terapier har godkänts för cancerbehandling; antigen-receptorerna baseras dock utanför den gemensamma cell ytantigen CD19, i stället för antigenerna som är specifika för cancer1. Bortom specificitet, kan immunterapier också lida av bristen på kontroll och begränsad förståelse dynamiska immunsvaret inom cancer eller autoimmunitet.

En av utmaningarna som studerar antigen-specifika svaren är deras extremt low-frekvens, t.ex., antigen-specifika T-celler är 1 av varje 104 106 T celler2,3. Således, för att undersöka vilka T celler är närvarande eller svarar, cellerna måste antingen vara berikad och expanderat eller deras signal behöver förstärkas. Det är dyrt och svårt att upprätthålla feeder cellerna med aktuella tekniker med fokus på expansion av antigen-specifika celler. Aktuella tekniker som fokuserar på att förstärka signalen för antigen-specifika T-celler, som den enzymkopplad immunospot (ELISPOT) assay, begränsa användningen av dessa T-celler4. Slutligen, på grund av låg känslighet, dessa två tekniker behöver ofta kombineras för antigen-specifika uppräkning.

För att lösa dessa frågor, har vi utvecklat den magnetiska nanopartiklar-baserade konstgjorda antigen presenterande cell (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan vara functionalized med ett antigen-specifika signal-peptid laddade stora histocompatibility komplex (pMHC)- och co-stimulatory molekyler -t.ex., en anti-CD28 antikropp-både berika antigen-specifika T-celler och sedan därefter stimulera deras utvidgning (figur 1). Partiklarna kan alltså vara en kostnadseffektiv off-the-shelf produkt som kan vara både anpassas efter antigen-specifika stimuli ännu standardiserat över experiment och patienter. Utför den berikning och expansionen bearbeta resultaten i hundratals till tusentals gånger expansion av antigen-specifika CD8 + T-celler och kan resultera i frekvenser upp till 60 procent efter bara en vecka, aktivera den karakterisering eller terapeutiska användningen av de stora antalet celler. Häri, vi beskriva hur man gör nanopartiklar aAPCs, vissa kritiska designöverväganden att välja nanopartiklar egenskaper, och visar några typiska resultat från att använda dessa partiklar i isolera och expanderar sällsynta antigen-specifika CD8 + T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss kvarstod per riktlinjer som godkänts av Johns Hopkins universitetets institutionella Review Board.

1. Ladda dimeriskt Major Histocompatibility Complex immunglobulin fusionsprotein (MHC-Ig) med önskad Antigen peptid sekvens.

Obs: Om du använder H - 2Kb: Ig, sedan följa protokollet beskrivs i steg 1.1; Om du använder H-2Db:Ig och sedan följa protokollet anges i steg 1.2.

  1. Aktiv lastning av peptid sekvens i H - 2Kb: Ig.
    1. Förbereda nödvändiga buffertar. Förbereda denaturering bufferten genom att en lösning av 150 mM NaCl och 15mM Na2CO3 i avjoniserat vatten och sedan justera pH till 11,5. Förbereda utvinningsarbete bufferten genom att göra en lösning 250 mm Tris HCl i avjoniserat vatten och justera pH till 6,8.
      Obs: Typiskt, det kommer att kräva ca 5 mL både denaturering och utvinningsarbete buffertar för 1 mg av H - 2Kb: Ig.
    2. Denaturera H - 2Kb: Ig att tillåta förbättrade peptid bindning. Föra de H - 2Kb: Ig koncentration till mellan 0,5-2 mg/mL med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Späd sedan den H - 2Kb: Ig till en slutlig koncentration på 100-200 µg/mL med 5-10 volym medel av denaturering buffert och tillåta för att odla i rumstemperatur i 15 min.
    3. Lägga till 50 molar överskott av peptid sekvens (vanligtvis lager peptid hålls på 1 mM vid-80 ° C) till H - 2 Kb: Ig lösning.
      Obs: Vanligt peptid antigener måste upplösas inom minst 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) och läggs sedan långsamt till PBS att förbli lösligt. Beroende på den amino syra ordnar, kan mängden DMSO behöva ökas.
    4. Renature H - 2Kb: Ig med peptid. Omedelbart efter tillägg av peptiden, ge lösningen till ett pH-värde 7,4 genom att lägga till utvinningsarbete buffert. Att neutraliseras lösningen Inkubera 48 h vid 4 ° C.
    5. Koncentrera sig och tvätta peptid-loaded H - 2Kb: Ig. utnyttja en centrifugal koncentrator med en 50 kDa molekylvikt cut-off (MWCO), följ tillverkarens anvisningar att tvätta peptid-loaded H - 2Kb: Ig lösning 3 gånger med PBS, koncentrera minst 1 mg/ml och kvantifiera koncentrationen på en spektrofotometer.
  2. Aktiv lastning av peptid sekvens till H-2Db:Ig.
    1. Förbereda nödvändiga buffertar. Förbereda denaturering bufferten genom att en lösning av 131 mM citronsyra, 150 mM NaCl och 124 mM Na2HPO4 i avjoniserat vatten och sedan justera pH till 6,5. Förbereda utvinningsarbete bufferten genom att göra en lösning av 120 mM Tris HCl i avjoniserat vatten och justera pH till 8,8.
      Obs: Typiskt, det kommer att kräva ca 5 mL av denaturering bufferten och 1 mL utvinningsarbete bufferten för 1 mg av H-2Db:Ig.
    2. Denaturera H-2Db:Ig att tillåta förbättrade peptid bindning. Ta med H-2Db:Ig koncentration till en slutlig koncentration av 0,5-2 mg/mL med PBS. Späd sedan, H-2Db:Ig till en slutlig koncentration på 100-200 µg/mL med 5-10 volym motsvarigheter av denaturering buffert.
    3. Lägga till 50 molar överskott av peptid sekvens (vanligtvis lager peptid hålls på 1 mM vid-80 ° C) till H-2Db:Ig lösning och låt Inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
    4. Lägga till β2-mikroglobulin och renature H-2Db:Ig med peptid. Lägg till 2-faldigt molar överskott av β2-mikroglobulin. Sedan föra lösningen till ett pH-värde 7,4 genom att lägga till utvinningsarbete buffert. Att neutraliseras lösningen Inkubera under 24 timmar vid 4 ° C.
    5. Koncentrera sig och tvätta peptid-loaded H-2Db:Ig. använda en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO, följ tillverkarens anvisningar att tvätta peptid-loaded H - 2 Kb: Ig lösning 3 gånger med PBS, koncentrera minst 1 mg/ml och kvantifiera den koncentration på en spektrofotometer.

2. konjugat MHC-peptid komplex och Co-Stimulatory molekyler på ytan av magnetiska nanopartiklar för att bilda nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler. Använda en av tre olika metoder beroende på partikelstorlek och tillämpning.

Obs: Ett antal olika tekniker kan användas till konjugat proteinerna på ytan av partiklarna. Häri, 3 separata metoder beskrivs: amine-belagda partiklar (steg 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-belagda partiklar (steg 2,2) och anti-biotin-belagda partiklar (steg 2,3). Dessa processer har också beskrivits i detalj i avsnittet metoder av två uppsatser publicerade6,7. Utföra alla steg i dragskåp biosäkerhet med sterila lösningar att upprätthålla sterilitet lager aAPC partiklar.

  1. Coat antigen-specifika och stimulerande signaler till amine-belagd magnetiska partiklar (figur 2). Denna process beskrivs för 100 nm, amine-belagd superparamagnetiska nanopartiklar.
    Obs: Detaljerade protokoll för att fästa antikroppen till ytan av en amine belagda partikel kan hittas på https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, där Technote 201 beskriver hur till thiolate antikroppar och konjugat till maleimide functionalize partiklar och 202 beskriver den process som behövs för att functionalize amine-belagda partiklar med maleimide funktionella grupper. Här, markeras endast smärre ändringar för MHC-Ig och co-stimulatory signaler kopplade till dessa partiklar.
    1. Thiolate antikroppar med Trauts reagens (Technote 201).
      1. Förbereda en 10 x PBS-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra buffert (0,1 M PBS och 100 mM EDTA). Lägg till 10 x PBS-EDTA buffert att antikropparna på en 1:10 baserat på att förhindra oxidation av gratis tioler tillsätts antikropparna.
      2. Lägg 20 molar överskott av Trauts reagens (2-iminothiolane) till antikroppen och inkubera i 2 h vid rumstemperatur med blandning. Mäta ut de Trauts reagens (pulver) inom kemiska dragskåp att undvika andning eftersom det konverterar amine grupper till thiol grupper.
      3. Tvätta noggrant med 1 x PBS-EDTA buffert 3 gånger med en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO och följ tillverkarens anvisningar, koncentrera tills en slutlig volym av 500 µL. mätning av koncentrationen av antikroppar lösning med en spektrofotometer.
    2. Konvertera de amine funktionella grupperna på den magnetiska nanopartiklar till maleimide grupper med sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) (Sulfo-SMCC, Technote 202) cyklohexan-1-bildas.
      1. Lägg till 10 x PBS-EDTA buffert att antikropparna på en 1:10 baserat partiklar.
      2. Lös upp Sulfo-SMCC i avjoniserat vatten och vortex att resuspendera vid en koncentration av 1 mg/mL. Mäta ut de Sulfo-SMCC (pulver) inom kemiska dragskåp att undvika andning eftersom det konverterar amine grupper till maleimide grupper.
      3. Lägg till 0,016 nmol Sulfo-SMCC lösning för varje kvadrera millimetern yta av partiklarna. För 1 mg 100 nm partiklarna, använda 0,3 mg av Sulfo-SMCC. Tillåta för att reagera för 1,5 h i rumstemperatur.
      4. Tvätta partiklarna med 1 x PBS-EDTA buffert 3 gånger med ett magnetfält med en magnetisk kolumn och återsuspendera i 500 µL av 1 x PBS-EDTA buffert.
        Obs: Om du använder partiklar mindre än 200 nm, såsom 100 nm partiklarna beskrivs häri, troligen permanenta magneter kommer inte vara tillräckligt stark att dra partiklarna för tvättning eller koncentrera ändamål. Således, för att tvätta de mindre partiklarna, använda en magnetisk kolumn består av ferromagnetiska sfärer för att förstärka det magnetiska fältet.
    3. Reagera maleimide-functionalized partiklar med thiolated antikroppar (Technote 201).
      1. Lägga till partiklarna i en injektionsflaska av glas scintillation, lägga till en mini-magnetiska uppståndelse, placera bara en tum ovanför en magnetiska rör tallrik och inducera magnetiska blandning av partikel lösningen.
      2. Blandningslösning, tillsätt thiolated antikroppar (0,5 mg av antikropp för varje 1 mg av partiklar) droppvis. Tillåta för att reagera över natten i rumstemperatur.
      3. Tvätta med 1 x PBS-bufferten 3 gånger med ett magnetfält och återsuspendera i 500 µL 1 x PBS. Etikett och förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
        Obs: Maximalt konjugation effektivitet uppstår när maleimide-functionalized partiklar blandas omedelbart med thiolated protein.
  2. Coat antigen-specifika och stimulerande signaler till NHS-belagd magnetiska partiklar (figur 3). Denna process beskrivs för 200 nm, NHS-belagd superparamagnetiska nanopartiklar.
    1. Förbereda den resuspension buffert och släcka buffert lagring buffert. Resuspension bufferten är 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES) med 0,01% Tween-20 justerad till pH 6.0. Släcka bufferten är en 100 mM lösning Tris-HCl vid pH 7,4. Lagring bufferten är en lösning av 10 mM PBS och 0,01% Tween vid pH 7,4.
    2. Återsuspendera frystorkade partiklarna i 1 mL av resuspension bufferten. Vortex kraftigt i minst 15 min tills inga aggregat är synliga.
    3. Placera de magnetiska partiklarna på en magnetisk stå att avlägsna supernatanten, blandas med 0,5 mL av resuspension buffert och överföring till en glasflaska för scintillation. Vortex tills inga aggregat är synliga.
    4. Lägg 0,1 mg totalt protein per 1 mg av återsuspenderade partiklar. Vortex att blanda och reagera vid rumstemperatur för 2,5 h under omrörning.
    5. Tillsätt 0,1 mL snabbkylning buffert och reagera i rumstemperatur i 30 min under omrörning.
    6. Placera injektionsflaskan med scintillation på en magnetisk stå och tvätta partiklarna. Vänta tills supernatanten är klar att ta bort. Ta bort partiklarna från magnetiska stativet, tillsätt 1 mL resuspension buffert och vortex tills inga aggregat är synliga. Upprepa denna process tre gånger och återsuspendera partiklarna i 1 mL av resuspension buffert. Lagra partiklarna vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  3. Coat antigen-specifika och stimulerande signaler till anti-biotin-belagd magnetiska partiklar (figur 4). Denna process beskrivs för 50-100 nm, anti biotin superparamagnetiska nanopartiklar.
    1. Biotinylate MHC-Ig eller co-stimulatory molekyler.
      1. Justera proteinkoncentration till 0,5-2 mg/mL i PBS-bufferten. Återsuspendera sulfo-NHS-biotin vid en koncentration på 10 mg/mL avjoniserat vatten och tillsätt 20-fold molar överskott till stimulerande antikroppar. Odla i rumstemperatur i 45 min.
      2. Tvätta noggrant med PBS 3 ggr med en centrifugal koncentrator med en 50 kDa MWCO, följ tillverkarens anvisningar, koncentrera tills en slutlig volym av 500 µL. mätning av koncentrationen av antikroppar lösningen med en spektrofotometer.
    2. Konjugerade biotinylerade MHC-Ig eller co-stimulatory signaler för anti biotin nanopartiklar. För 500 µL av lager anti biotin partiklar, tillsätt 0,5 nmol stimulerande antikroppar och inkubera vid 4 ° C över natten.
    3. Tvätta konjugerad aAPC nanopartiklar. Eftersom dessa partiklar är mindre än 200 nm, blöt en magnetisk kolumn och sätta på en magnetisk stå.
    4. Lägg till partikel och protein suspensionen i kolumnen. Tillåt alla protein/partiklarna helt Ange kolumnen.
    5. Tvätta genom att tillsätta 0,5 mL PBS tre gånger till kolumnen.
    6. Eluera genom att ta bort kolumnen från den magnetisk stå, att tillsätta 0,5 mL PBS i kolumnen och använda kolven, expulse den partikel aAPCs in i en injektionsflaska av glas scintillation. Lagra partiklar vid 4 ° C i upp till 6 månader.
      Obs: Partiklarna är stabil vid 4 ° C (får ej frysas) för upp till 6 månader. Högre temperaturer minskar funktionaliteten hos partiklarna och vissa partikel sammanläggning har observerats (inga data anges). Förvara inte i rumstemperatur längre tid eftersom detta avsevärt minskar hållbarheten av partiklarna.

3. karakterisera proteinhalten på konstgjorda antigenpresenterande Cell nanopartiklar använder fluorescerande antikropp-detektering.

Obs: Detta är en användbar kvalitetskontroll av de producerade konstgjorda antigenpresenterande celler. Mängden stimulerande signal används också för att producera motsvarande aAPC doser över partier och olika aAPC (t.ex., olika storlekar).

  1. Mäta den partikel koncentrationen av belagda aAPCs.
    1. Använda okonjugerat partiklar från stamlösning och göra en dostitrering för 1:2 i en lösning av PBS över en 96 brunnar flatbottnad vävnadsodling plattan med 100 µL per brunn.
    2. Läs partiklar på en tallrik-läsning spektrofotometer vid 405 nm till skapa en standardkurva från en känd partikel koncentration.
    3. Ta ett prov av den konjugerade aAPCs, späd i PBS till en total volym av 100 µL och läsa på spektrofotometern.
  2. Ta bort ett prov av fabricerade aAPCs och fläckar med fluorescerande antikroppar.
    1. Att beräkna hur mycket prov att ta bort, uppskatta antalet antikroppar på ytan av partikeln.
      Obs: För dessa tekniker, anta en densitet på cirka 1000 antikroppar/µm2 av partikel yta. För att kunna upptäcka fluorescensen, krävs det ca 1011 MHC-Ig eller CD28 molekyler totalt per fluorescerande test.
    2. Ta den totala volymen av aAPCs upp till 100 µL i PBS, lägga till färgning antikropparna vid en spädning 1: 100 och inkubera i 1 h vid 4 ° C.
      Obs: Exempel antikroppar framgångsrikt använt FITC konjugerad råtta-anti-mus Ig λ1, λ2, λ3 ljusslinga, klona R26 46 för att upptäcka MHC-Ig och FITC konjugerad musen anti armeniska/Syrian hamster IgG, klon G192-1, för att upptäcka antimus CD28.
  3. Tvätta partiklarna och läsa fluorescensen på en fluorescerande Plattläsare.
    1. Magnetiskt tvätta (enligt beskrivningen i steg 2) färgade aAPC fraktioner tre gånger med 0,5 mL PBS.
    2. Eluera de tvättade aAPCs med 0,5 mL PBS.
    3. Tillsätt 100 µL av de eluerade aAPCs till en 96 brunnar flatbottnad tallrik att läsa koncentrationen med absorbansen som i steg 3.1.
    4. Ta den resterande 400 µL, delas upp i två 200 µL portioner och lägga till två brunnar i en svart, polystyren 96 brunnar, flatbottnad tallrik. Titrera i förhållandet 1:2 ner plattan genom att ta 100 µL av lösningen och blanda med den nästa brunn som har 100 µL av PBS i varje väl åtminstone fyra gånger.
      Obs: Genomsnittliga flera replikerar av mätningen att minska bullret i mätningen.
    5. På den samma svarta plattan med 96 brunnar, göra en standardkurva av fluorescerande antikropp används för att färga, genom att lägga till det på 1: 200 i en brunn med 200 µL av PBS och titreringen ner i 1:2 för minst 12 brunnar.
    6. Efter både aAPC och fluorescerande antikroppar är på tallriken, läsa plattan med en fluorescerande Plattläsare.
  4. Beräkna mängden protein per partikel. Bestämma koncentrationen av antikroppar genom att jämföra värdena till standardkurvan, där antikroppkoncentrationen är känd, förutsatt att förhållandet 1:1 av färgning antikroppar mot upptäckt antikropp. Sedan dividera denna koncentration av upptäckta antikropp med koncentrationen av partiklar bestäms absorbansen analysen ger antalet antikroppar per partikel.

4. berika Antigen-specifika CD8 + T-celler med förberedda nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler.

  1. Isolera CD8 + T-celler.
    1. Euthanize djuren av exponering för isofluran följt av cervikal dislokation.
    2. Ta bort mjälten och lymfkörtlarna från vildtyp C57BL/6j möss och placera i en lösning av PBS. Lös upp organen och eluera cellerna genom en steril 70 µm cell SIL med täta tvättar av PBS.
    3. För att eliminera icke - CD8 + T-celler, använda en no-touch CD8 + T cell isolering kit och följ tillverkarens anvisningar.
      Obs: Varje antigen villkor kräver minst 3 x 106 CD8 + T-celler.
  2. Lägg till de nanopartiklar aAPCs att binda till de CD8 + T-cellerna.
    1. Efter isoleringen, koncentrera sig till en volym av 100 µL i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA.
    2. Avgör hur många av aAPCs att lägga till genom att beräkna baserat på förhållandet mellan 1011 aAPC-bundet, peptid-loaded MHC-Ig för varje 106 CD8 + T-celler.
    3. Inkubera aAPC partiklar och CD8 + T-celler för 1 h vid 4 ° C med kontinuerlig blandning i en steril 5 mL polystyren runt botten rör.
  3. Förbereda kompletterade media och T-cell tillväxtfaktor (TCGF) till eluera och kultur CD8 + T-celler.
    1. För kompletterade media, komplettera komplett RPMI 1640 media (med glutamin) med 1 x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natrium pyruvat, 0,4 x vitamin lösning, 92 µM 2-merkaptoetanol, 10 µM ciprofloxacin och 10% fetalt bovint serum (FBS).
    2. Att göra TCGF, följ den protokoll redan etablerade och refererade här9.
      Obs: TCGF är en egen cocktail av humant immun cytokiner som är väsentligt att T-celler med ytterligare stimulering signaler behövs för att växa. TCGF kunde bytas mot kända T-cell stimulerande cytokiner såsom IL-2, IL-7 eller IL-15; dock kan varje polarisera T-cellssvar med detta. Protokollet beskrivs häri har inte optimerats med dessa drinkar; således andra tekniker bör konsulteras för koncentrationer och kombinationer om TCGF används med exempel listas10,11.
  4. Tvätta och berika aAPC och CD8 + T cell blandning.
    1. Tvätta den magnetiska partikel aAPCs som beskrivs i steg 2. Dock tvätta först med PBS-bufferten med 0,5% BSA och 2 mM EDTA, andra använder kompletteras media och tredje använder kompletteras media med 1% TCGF.
    2. Eluera aAPCs och berikade CD8 + T celler i 500 µL kompletterade medier med 1% TCGF.
    3. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och plattan i en 96 U-botten plattan i 160 µL per brunn kompletterade medier med 1% TCGF vid en koncentration på 2,5 x 105 CD8 + T celler/mL.
    4. Om isolera med aAPCs med endast laddade peptid-MHC-Ig på ytan (ingen co-stimulatory signaler), sedan komplett steg 4,5. Om isolera med aAPCs med båda peptid-loaded MHC-Ig på ytan och co-stimulatory signaler, Fortsätt sedan till steg 5.
  5. Lägg de magnetiska partiklarna belagd med co-stimulatory signaler på ytan för att den berikas fraktionen och ett magnetfält för att klustra Co stimulerande signalerna på ytan av T-cellerna.
    1. Att de berikas fraktionerna, Lägg en equimolar (eller större beroende på applikation-se avsnittet om aAPC egenskaper till kontroll) stimulerande antikroppar till numrera av peptid-loaded MHC-Ig på partikeln.
    2. Co-stimulatory magnetiska partiklar att binda till anrikat CD8 + T-celler för 1 h vid 4 ° C.
    3. Lägg till magnetfält genom att placera kultur plattan mellan två N52 magneter neodymium disk 1,9 cm (0,75 tum) långa.
      Obs: N52 disk magneter har en extremt stark fält. Försiktighet bör iakttas både lagra dem med distanser mellan magneter, som det är svårt att ta bort från varandra, och när att sätta dem på kultur plattorna. För att minimera magneter fastnar metallkomponenter i inkubatorn, placera dem i 50 mL koniska tube Styrofoam containrar på både botten och toppen.

5. expandera och upptäcka Antigen-specifika CD8 + T-celler med förberedda nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler.

  1. Lägga till 96 U-bottnat väl plattan med aAPCs och CD8 + T celler i en fuktad 5% CO2, 37 ° C inkubator för 3 dagar. Dag 3, mata cellerna med 80 µL per brunn kompletterade medier med 2% TCGF och plats tillbaka in i inkubatorn tills dag 7.
  2. Dag 7, skörda stimuleras cellerna i en 5 mL rund botten tube för inventering.
  3. En gång alla de lösning skördas, spinn ner skördade cellerna att resuspendera i 0,5 mL PBS med 0,05% natriumazid och 2% FBS. Räkna viabla celler av färgning med trypan blå och räknar på en hemocytometer.
  4. Ta bort 50 000-500 000 räknade celler in två nya 5 mL rund botten rör för antigen-specifika färgning. En tub kommer att användas för cognate peptid-MHC fläcken och andra röret kommer att användas för icke-besläktat fläcken för att bestämma bakgrundsfärgning.
  5. Lägg till 1 µg av biotinylerade MHC-Ig (med den teknik som beskrivs i steg 2) i respektive besläktat och icke-besläktat rör i 100 µL av PBS med 0,05% natriumazid och 2% FBS med allophycocyanin (APC)-konjugerade råtta antimus CD8a, klona 53-6,7 (utspädningsfaktorn av 1: 100) för 1 h vid 4 ° C.
  6. Lägg till sekundära streptividin och levande döda fläcken. Tvätta ur överflödig biotinylerade MHC-Ig med PBS genom centrifugering. Sedan färga alla prover med en 1:350 förhållandet av fykoerytrin (PE)-märkt streptividin och 1: 1000 förhållandet mellan en live/dead fastställbara grön döda cellen fläck under 15 minuter vid 4 ° C.
  7. Läs alla prover på en flödescytometer att bestämma specificiteten och antalet antigen-specifika celler.
    1. Tvätta ur överflödig sekundär och live/dead fläcken genom centrifugering och resuspendera med 150 µL av PBS-bufferten med 0,05% natriumazid och 2% FBS att läsa på en flödescytometer.
  8. Fastställa antalet procent av antigen-specifika celler med data analysprogram.
    1. För att avgöra procenten av antigen-specifika celler, använder du följande portar i respektive ordning live +, lymfocyter + (framåt scatter av side scatter), CD8 + och Dimer +. Fastställa Dimer + porten genom att jämföra den icke-besläktat på cognate fläcken.
    2. Bestämma procentandelen av antigen-specifika celler i ett prov genom att subtrahera procentandelen av Dimer + cognate MHC-Ig fläcken från icke-besläktat MHC-Ig fläcken.
    3. Använder denna procentandel av antigen-specifika celler, multiplicera det med antalet celler räknas, ger antalet antigen-specifika celler resulterande från anrikning och expansion.
      Obs: Ersättning måste ställas in på flödescytometer eftersom det finns spektrala överlappning med de fluorophores som används i den här panelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att slutföra en lyckad anrikning och expansion av antigen-specifika T-celler, den peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler bör framgångsrikt bifogas aAPC partikeln. Baserat på de 3 metoderna för partikel fastsättning, ger vi några representativa uppgifter för en framgångsrik konjugation procedur resultatet (figur 5a). Faktiskt om ligand densitet är för låg, då det inte blir effektiv stimulering av antigen-specifika CD8 + T celler där detta sker runt linjära avståndet mellan liganderna över 100 nm i vår erfarenhet (Figur 5b)7.

Förutom både kvantitativa fluorescerande antikropp utläsningar och transgena CD8 + T cell expansioner, kan nanopartiklar aAPCs kontrolleras för kvalitetskontroll av dopning i cognate transgena antigen-specifika CD8 + T-celler. Detta kan göras genom att isolera CD8 + T-celler från en transgen mus som till exempel en Pmel mus som har gp100-specifika antigen-specifika CD8 + T-celler och dopning i en B6 bakgrund i förhållandet 1: 1000. Räkna och färgning före och efter anrikning tillåter uppräkning av både fold anrikning (figur 6a) och procent återvinning (figur 6b)6. I dessa representativa resultat visar vi att signal-1 bara aAPCs ger mest effektiv anrikning (nästan 10-faldig) och omkring 80% cell återhämtning, som förstärks över traditionella signal 1 och 2 aAPCs som har icke-specifika anti-CD28 på partikeln liksom.

En gång partikel aAPCs tillräckligt har karaktäriserats och kvalitet kontrolleras, då de kan användas i anrikning och expansion av sällsynta antigen-specifika CD8 + T-celler från vildtyp möss. För exakta resultat är det viktigt att ha funktionella upptäckt reagens, såsom biotinylerade dimeren. Kvalitetskontroll av biotinylerade dimeren kan också göras på transgena CD8 + T celler att verifiera färgning. Här visar representativa resultat positiva färgningen med gp100-specifika CD8 + T celler med B6 CD8 + T-celler som bakgrund kontroll (figur 7). Figur 7 visar också att om det finns för höga nivåer av biotinylerade dimeren, då det kommer att minska dess aviditet eftersom det kommer att konkurrera med sig själv och uppvisar mono-valent bindande.

Efter anrikning och expansion av mus CD8 + T-celler i sju dagar, man kan förvänta sig mellan 5 och 50 procent antigen-specifika CD8 + T celler, med nästan 20 000 till 200 000 antigen-specifika CD8 + T-celler efter börjar med 5 x 106 CD8 + T-celler per tillstånd (Figur 8) 6. särskilt när färgning för antigen-specifika CD8 + T-celler, är det viktigt att veta bakgrunden färgningen av biotinylerade dimeren, där i detta fall det var 4,15%. någon procent lägre än detta från cognate fläcken anses ett negativt resultat (figur 8a). Dessutom visas där att dra flöde flödescytometri grindarna för att avgöra den faktiska procentuella antigen-specifika CD8 + T-celler. Detta är viktigt i fall där antigen-specifika CD8 + T-celler inte har distinkta populationer (som visas i figur 8a) men kan visas som ett brett utstryk.

Samma process kan användas för att isolera och stimulera mänskliga antigen-specifika CD8 + T celler. Liknande kvalitetskontroll och resultaten bör ses där avsevärda ökningar i procent och antalet antigen-specifika CD8 + T celler observeras efter bara en vecka av expansion efter anrikning (figur 9)5.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av processen för antigen-specifika anrikning och expansion med nanopartiklar konstgjorda antigen-presenterande celler. Först, slutföra en no-touch CD8 + T cell isolering. Sedan lägger du till nanopartiklar aAPCs CD8 + T-cellerna. Berika med ett magnetfält, kultur, och stimulera med aAPCs. Slutligen identifiera berikad och utökade antigen-specifika CD8 + T-celler med flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk för konjugera peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler på ytan av amine-belagd magnetiska partiklar. I korthet används Sulfo-SMCC crosslinker för att functionalize magnetiska partikel ytan med maleimide funktionella grupper. MHC-Ig och co-stimulatory molekyler är samtidigt functionalized med Trauts reagens att producera thiol funktionella grupper. Den aktiverade partiklar och protein signaler är reagerade tillsammans och sedan tvättas för att producera antigen-presenterande antigen-specifika konstgjorda cellen magnetiska nanopartiklar. Denna siffra har ändrats från kompletterande material av vår laboratoriets publikation i Nano Letters7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk för konjugera peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler på ytan av NHS-belagd magnetiska partiklar. Kortfattat, NHS-belagd partiklarna är reagerade tillsammans med peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler och sedan tvättas för att producera antigen-presenterande antigen-specifika konstgjorda cellen magnetiska nanopartiklar. Denna siffra har ändrats från kompletterande material av vår laboratoriets publikation i Nano Letters7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Schematisk för konjugera peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler på ytan av anti-biotin-belagd magnetiska partiklar. MHC-Ig och co-stimulatory molekyler är functionalized med NHS-biotin att producera biotin funktionsgrupper. Sedan är de anti-biotin-belagda partiklarna reagerade tillsammans med functionalized peptid-loaded MHC-Ig och co-stimulatory molekyler. Därefter tvättas dessa partiklar för att producera antigen-presenterande antigen-specifika konstgjorda cellen magnetiska nanopartiklar. Denna siffra har ändrats från kompletterande material av vår laboratoriets publikation i Nano Letters7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Konjugation effektivitet är avgörande för anrikning och expansion av antigen-specifika T-celler. (a) representant för konjugation effektivitet med tre konjugation metoder till tre olika databas magnetiska partiklar som beskrivs i uppsatsen: amine-belagda partiklar, NHS-belagda partiklar och anti-biotin-belagda partiklar. Varje datapunkt representerar en annan partikel förberedelse teknik och felstaplar representera S.E.M. (b) hur ligand densitet påverkar transgena CD8 + T cell stimulering, där ligand tätheten representeras som linjära avståndet mellan ligander i nanometer på 600 nm och 50 nm aAPCs (n = 5 och felstaplar representera S.E.M.). Denna siffra har ändrats från våra laboratoriets publikation i Nano Letters7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Kvalitetskontroll av aAPC anrikning. Transgena Pmel gp100-specifika CD8 + T-celler var dopade i i förhållandet 1: 1000 till vildtyp B6 CD8 + T-celler. (a) vik anrikning mättes med flödescytometri efter anrikningen av färgning congenic markören Thy1.1 och CD8. Här var en jämförelse mellan signal 1 enda partiklar eller Db-Ig laddad med gp100, traditionella signal 1 och 2 partiklar eller Db-Ig laddad med gp100 och anti-CD28 och icke-besläktat signal 1 och 2 partiklar. (b) celler räknades också före och efter för att mäta cell återvinning av alla metoder. Data representerar tre oberoende experiment och fel barer representera S.E.M. Data kombinerat mättes genom envägs ANOVA med Tukeys post-test (*p< 0,05, **p< 0,01). Denna siffra har ändrats från våra laboratoriets publikation i Nano bokstäver6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Kvalitetskontroll av biotinylerade dimer. Gp100-specifika CD8 + T celler isolerades från en transgen mus som Pmel och färgas i 100 µL av PBS med tre koncentrationer av biotinylerade Db-Ig laddad med gp100 och APC anti-CD8a, med vildtyp B6 CD8 + T-celler som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Anrikning och expansion av antigen-specifika CD8 + T celler. B6 vildtyp CD8 + T-celler var berikad med antingen signalen endast 1 (Kb-Ig laddad med TRP2) eller signal 1 och 2 (Kb-Ig laddad med TRP2 och anti-CD28 konjugerat till ytan av partikeln). Signal 2 lades sedan till anrikat fraktionen av signal 1 bara aAPCs och alla celler odlades i 7 dagar. (a) CD8 + T celler färgas och gated på en live/dead fluorescerande fläck, sedan gated CD8 + och KbTRP2 +, och jämfört med en icke-besläktat Kb-Ig att upptäcka antigen-specifika CD8 + T-celler. (b) procent och (c) antal TRP2-specifika CD8 + T celler kan således vara beslutsam, där högre procentsatser och antalet antigen-specifika CD8 + T celler kan upptäckas från metoden signal 1 bara berikande (n = 7, felstaplar representera standardavvikelsen, tvåsidiga parade t-test *p < 0,05, **p < 0,01). Denna siffra har ändrats från våra laboratoriets publikation i Nano bokstäver6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Anrikning och expansion av mänskliga antigen-specifika CD8 + T celler. (a) representant flow flödescytometri tomter på dag 0 innan den berikning och dag 7 visar de dramatiska effekterna av berikande och expanderande antigen-specifika CD8 + T-celler från friska donatorer med traditionella nanopartiklar aAPCs där A2-Ig laddad med NY-ESO1 och A2-Ig laddad med MART1 antigener visas. (b) Detta genererar höga procentsatser (~ 10-20%) och siffror (0,5-1 x 106) av antigen-specifika CD8 + T-celler av dag 7 (n = 3 från oberoende givare, felstaplar representera S.E.M.). Denna siffra har ändrats från våra laboratoriets publikationen i ACS Nano5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1-Box 1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. 

Kompletterande fil 2-Box 2. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har skapat en roman antigen-specifika T-cell isolering teknologien baserat på nanopartiklar konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Nanopartiklar aAPCs har peptid-laddat MHC på ytan som gör att antigen-specifika T-cell bindning och aktivering tillsammans med co-stimulatory aktivering. aAPCs är också paramagnetiska och därmed kan användas för att berika sällsynta antigen-specifika T-celler med hjälp av ett magnetfält. Vi har optimerat och studerade nyckel nanopartiklar egenskaper storlek, ligand densitet, och ligand val och deras inflytande på bindande, anrikning, aktivering och cell-anrikning (Kompletterande fil 1-Box 1).

Således, anrikning och expansion förfarande resultaten i antigen-specifika CD8 + T cell expansion av flera producerar thousand-fold antigen-specifika procentsatser så hög som 60% och kan användas i både murina och människors inställningar (Kompletterande fil 2-Box 2 ). Sådana höga siffror och procentsatser av antigen-specifika T-celler aktiverar karakterisering av immunsvaret för sjukdomar (t.ex., cancer, autoimmuna, etc.), möjliggöra upptäckten av romanen immun mål och mekanismer och erbjuda möjlighet att vara används i adoptiv immunterapi. Ett exempel på ett visst program är att sekvensera patientens tumör, identifiera mutationer, lokalisera potentiella MHC-bindemedel från mutant sekvenser, producera aAPCs med de antigenerna som toppkandidat och sedan utnyttja aAPCs för att avgöra om patienten har någon tumör-specifika neoantigens.

Verkligen metodologiska begränsningar har varit en viktig barriär att studera och identifiera antigen-specifika svar. Aktuella tekniker kräva (a) betydande och arbete-tidskrävande förfaranden, (b) nuvarande svårigheter att upprätthålla cellinjer som behovet att samla autolog dendritiska celler, (c) kräva veckor av T-cell expansion före att få resultat, (d) resultat i låg särdrag (1-2%) och låga antalet antigen-specifika CD8 + T inte kan celler, (e) ofta med betydande bakgrund signal, och (f) de CD8 + T celler som produceras ofta användas eller studerade i ytterligare analyser. En metod kräver immunisering med antigen innan ELISPOT att karakterisera förekomsten av antigen-specifika svar14,15,16,17. En annan metod utnyttjar tandem-mini-genuttryck plasmider för att transfect antigenpresenterande celler kräver multiplexing tetramer fläckar med cytokin + Svaren såsom IFNγ att öka känslighet18. Även peptid pulserande kroppseget antigen presenterande celler i in vitro- kultur, bara resulterar i en ökning på 0,5% av antigen specificitet15.

Vårt arbetssätt löser dessa metodologiska begränsningar och kan därmed fungera som ett diagnostiska och terapeutiska verktyg. Kritiska steg att antigen-specifika CD8 + T cell anrikning och expansion är att 1) effektivt Ladda MHC-Ig med peptid antigen, 2) konjugat stimulerande signaler till ytan av nanopartiklar, 3) binder partiklarna till T-celler, 4) berika cellerna bundna till nanopartiklarna med ett magnetiskt fält, 5) expandera eluerade nanopartikel-bundna T-celler i kultur och 6) upptäcka antigen-specifika CD8 + T celler på dag 7 med biotinylerade, peptid-loaded MHC.

De huvudsakliga problem som dyker uppstår i protokollet anrikning och expansion uppkommer antingen felaktig produktion eller utgångna upptäckt reagenser eller nanopartiklar aAPCs. Se till att biotinylerade dimeren kan fläcka antigen-specifika CD8 + T-celler med tester på transgena antigen-specifika CD8 + T-celler. Om peptid-MHC-Ig inte har en motsvarande transgen musmodell, kan det vara bra att läsa in en positiv kontrollpeptid och testa den positiva kontrollen för att verifiera lastning. Dock vissa peptider kan inte läsa in i MHC-Ig; Detta kan simuleras med MHC-lastning algoritmer som Net-MHC eller med RMA-cell baserat experimentellt analyser13. aAPC partikel stabilitet kan minska efter 6 månader, så om det finns vissa variationer i anrikning och expansion resultat, sedan en annan fluorescerande plate reader analys kan utföras för att kontrollera stabiliteten.

I framtida arbete, vi syftar till att utöka kapacitet, bredd och djup i analysen. Vi arbetar på att öka både genomströmning och förmågan att sammankoppla med flera antigener undersökas samtidigt i ett format som plattan med 96 brunnar. För närvarande är en huvudsaklig begränsning att endast några antigener kan undersökas samtidigt. Detta arbetar vi genom att undersöka hur storleken på partikel aAPC och ligand tätheten påverkar berikning. Dessutom undersöker vi hur olika cell kompositioner effekt CD8 + T cell expansion inom kultur. Slutligen, vi strävar efter att efterlikna denna teknik inom MHC klass II för att kunna berika och utöka antigen-specifika CD4 + T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar den följande konkurrerande finansiella interest(s): under ett licensavtal mellan NexImmune och The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck har rätt till en andel av royalty fick universitetet på försäljning av produkter som beskrivs i detta artikel. Han var också en av grundarna av NexImmune och äger kapital i bolaget. Han fungerar som en medlem av Neximmunes styrelse och vetenskapliga rådgivande styrelse. Villkoren i dessa arrangemang har granskats och godkänts av The Johns Hopkins University i enlighet med dess intressekonflikt politik.

Acknowledgments

J.W.H. tack av NIH Cancer nanoteknik Training Center vid Johns Hopkins Institutet för nanobioteknik, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) och stiftelsen bågar för gemenskap stöd. Detta arbete finansierades av stöd från National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative och den Coulter Foundation (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

Engineering fråga 141 nanopartiklar magnetisk anrikning konstgjorda antigen-presenterande celler T-celler immunterapi cancer ovanlig cell anrikning T cell expansion adoptiv T cellterapi Neoantigen immunoengineering bioteknik
Berika och utöka sällsynta Antigen-specifika T-celler med magnetiska nanopartiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter