Listeria monocytogenes 뇌의 감염

그람 양성 박테리아 Listeria monocytogenes facultative 세포내 병원 체 이며 대부분 치명적인 식품을 매개로 병원 체 전세계 중 하나. L. monocytogenes 오염 된 식품의 섭취 listeriosis 인간, 주로 임산부, 신생아, 노인, 그리고 immunocompromised 개인¹타겟팅 심각한 침략 적인 질병 발생할 수 있습니다. L. monocytogenes 는 미국에서 식품을 매개로 병원 체에 의해 죽음의 주요 원인 중 하나입니다 그리고 케이스 사망자 listeriosis에서 요금은 높은 20-30%, 모든 식품을 매개로 병원 체²에 대 한 최고. 아니 백신 L. monocytogenes 현재 존재 하 고 박테리아의 능력을 효과적으로 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 횡단 하 여 말 초 장기 및 뇌 확산 생명이 수 막 염 및 뇌³ 의 식민으로 이어질 수 있습니다. ^{, 4 , 5 , 6}. 세균성 수 막 염은 일반적으로 심한; 치료를 받은 대부분의 사람들을 복구 하는 동안 감염 아이 들에 있는 심각한 합병증, 예를 들면, 뇌 손상, 청력 상실, 또는 학습 장애를 일으킬 수 있습니다. L. monocytogenes 모든 커뮤니티의 적어도 10%를 차지 하는 미국⁷에 수 막 염 인수 전망 이다.

두뇌와 meninges 세균성 보급을 위한 주요 경로 혈 류를 통해 이다. 뇌의 혈관에 순환 하는 박테리아 뇌 감염을 BBB를 교차 수 있습니다. BBB는 혈액에서 회람 하는 외국 입자에서 뇌를 보호 하는 매우 vascularized 배리어 시스템. 내 피 세포는 혈관^8,9의 내부 표면 라인 레이어를 구성 합니다. L. monocytogenes, 뿐만 아니라 Neisseria meningitidis, 구 균, 대장균및 Haemophilus 함께 b 형 (Hib) 등 여러 세균 병원 균은 정착 할 수 BBB^3,4,,56을 횡단 하 여 두뇌. 그러나, 조사 하면 감염 된 쥐의 뇌에 부담을 세균, 박테리아는 BBB 넘어, 여부 그렇지 않으면 두뇌에 있는 세균성 짐을 아직도 뇌의 혈관에 있는 박테리아를 나타내는 수 있습니다 중요 하다. 따라서, 그것은 두뇌 homogenates의 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 결정 하기 전에 모든 혈액의 쥐 perfuse 필요가 있다.

이 연구에서 우리 두뇌의 L. monocytogenes 감염 검사 vivo에서 방법을 설명 합니다. 여기 설명 하는 방법, L. monocytogenes 스트레인 10403S 사용 했습니다. L. monocytogenes 10403S 감염¹⁰의 마우스 모델에서 조직의 listeriosis 공부를 가장 널리 사용 되는 실험실 변종 중 하나입니다. 이 프로토콜은 L. monocytogenes 뒤 쥐의 관류의 표준 정 맥 주입을 기반으로 합니다. 마우스에서 감염 프로토콜의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. L. monocytogenes-감염 된 두뇌 및 다른 기관 끼얹는다 비 또는 끼얹는다 쥐에서 수집 하 고 세균성 기관 부담 결정. 이러한 메서드는 뿐만 아니라 감염 된 동물에서 뇌의 총 세균성 식민지를 결정 하는 데 유용 하지만 BBB에는 vivo에서 두뇌의 침공을 중재 박테리아가 침투 여부를 결정 하는 데 도움이 있습니다. 그것은이 실험실 프로토콜 관련 기관 biosafety 위원회 및 동물 시설 관리 협의 따라 실시 해야 하는 것을 강조 하는 것이 중요.

모든 동물은 유지 하는 절차의 과정에서 불편을 최소화 하기 위해 최대한 신중 하 게 처리입니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 모든 연방, 주 및 지방 법에 따라 실시 하는 절차. 또한 유의 하십시오 실험실 실험 Biosafety 수준 2 지침에 따라 실시 하는.

1. L. monocytogenes 마우스 감염 연구의 성장

1. 단단한 미디어 접시를 준비 하는 1 L 삼각 플라스 크에 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 한 천 매체의 500 mL 압력솥. 56 ° C 물 욕조에 냉각 한 후 100 µ g/mL의 최종 농도에 스를 추가 미디어 하실 수 있습니다.
   1. 페 트리 접시 접시에 미디어/페 트리 접시의 25 mL를 붓으십시오. 실 온 (22 ^oC-25 ° C)에서 건조 격판덮개를 허용 한다. 필요한 경우, 판 37 ° C까지 완전히 건조에서 건조 수 있습니다.
2. 살 균 접종 루프 및 무 균 기술을 사용 하 여 얻을 전체 루프 냉동된 L. monocytogenes 의 변형 10403S^11,BHI 미디어 플러스 30% 글리세롤에 냉동 주식 문화에서¹² -80 ° C 냉장고에서 유지.
   1. 행진 BHI 천/스에 L. monocytogenes 접시는 단일 세균성 식민지 고립 될 수 있다. L. monocytogenes 식민지 성장 하는 37 ° C 배양 기 하룻밤 (18 h 24 h)에 접시를 놓습니다.
   2. 살 균 inoculating 루프를 사용 하 여 단일 선택 BHI agar에서 L. monocytogenes 식민지 접시와 100 µ g/mL 스 포함 된 BHI 국물의 5 mL를 포함 하는 살 균 테스트 튜브에 식민지를 예방.
3. 약간 정적 인큐베이터에서 하룻밤 30 ° 기울어져 L. monocytogenes 문화 관을 품 어.
   1. 다음 날, 시각적으로 성장 (BHI 미디어 혼 탁 한 것) 및 문화의 균일 한 현 탁 액을 되도록 짧게 소용돌이 L. monocytogenes 문화를 검사 합니다.
   2. Aseptically의 세균성 문화 약 1 mL 수를 제거 하 고 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD₆₀₀)는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
      참고: 살 균 BHI 국물 L. monocytogenes 문화의 광학 밀도 측정 하기 전에 독서 분 광 광도 계에 대 한 빈으로 사용 됩니다. L. monocytogenes 문화 또한 묽 게 될 수 있습니다 (2에 5 배) 광학 밀도 읽기 전에 BHI에.
   3. 문화의 10 직렬 희석을 도금 하 여 BHI 문화의 mL 당 L. monocytogenes 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 수를 결정 합니다. L. monocytogenes 문화의 광학 밀도 문화의 mL 당 박테리아 수 사이의 관계를 설정 하려면 유용 합니다. 일반적으로, L. monocytogenes 문화에 대 한 1.0의 OD₆₀₀ 약 1 x 10⁹ mL 당 박테리아의 CFU 같습니다.

2. L. monocytogenes 감염의 쥐에 대 한 준비

1. 24 시간 동물 감염, 전 18 BHI 국물 포함 하는 100 µ g/mL 스 L. monocytogenes 문화를 성장 하 고 OD₆₀₀결정 / ~ 1 단계에서 표시 된 mL 당 CFU.
   참고: 마우스 감염 사전 1 주 주문 일반적으로 하 고 감염 연구 수행 전에 동물 시설에 acclimated 됩니다. 이 연구에서는 6-8 주 오래 된 여성 BALB/c 마우스 (그룹 당 5 쥐) 하버드의과 대학 BSL2-레벨 동물 제약 시설에서 배리어 환경에서 지 내게 했다 고 음식과 물 광고 libitum제공.
2. L. monocytogenes 문화에 따라 각 마우스를 감염 하는 데 필요한 양을 결정 합니다 ~ 세균성 문화의 mL 당 CFU. 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.2에에서는 L. monocytogenes 문화 (PBS)의 희석 박테리아의 적절 한 농도를 확인 합니다. 마우스는 일반적으로 정 맥 200 µ L 1-2 × 10⁴ 박테리아/동물의 CFU를 포함 하는 PBS의 감염.
3. BHI 한 천 배지 100 µ g/mL 스 포함에 10 직렬 희석 도금으로 inoculum L. monocytogenes 수를 확인 합니다. L. monocytogenes 다음과 같이 마우스 당 주사의 수를 결정 하는 37 ° C 인큐베이터 하룻밤에 접시를 품 어.
   Inoculum (CFU) = (희석 요인 x 식민지의 수) / mL 도금 볼륨 (mL) 주입 x

3. 통해 L. monocytogenes 꼬리 정 맥 주사와 쥐의 감염

1. 쥐를 포함 하는 새 장에서 뚜껑 및 음식 쓰레기통을 제거 하 고 5 분 동안 250 W 적외선 열 램프 아래에서 케이지를 놓습니다.
   참고:이 방법은 수 팽창를 꼬리 정 맥 주사 쉽게 수행 하는 확인.
   1. 신중 하 게 안전 하 게 꼬리 정 맥 주사 하는 동안 동물을 제 지 하는 장치를 억제 하는 적절 한 크기의 마우스에서 동물을 배치 합니다.
2. L. monocytogenes inoculum (단계 2.2)를 혼합 하 고 1 mL 주사기 26 G 바늘으로 장착에 inoculum을 로드.
3. 마우스의 측면 꼬리 정 맥을 찾아서 주사 사이트를 알코올 패드 또는 75% 에탄올 스프레이 사용 하 여 청소.
4. 부드럽게 26 G 바늘과 주사기를 사용 하 여 측면 꼬리 정 맥에 L. monocytogenes 정지의 200 µ L로 마우스를 삽입할.
   1. 면 거 즈를 사용 하 여 간단히 어떤 출혈을 멈추게 하는 사출 사이트에 압력을 적용 하 고 새 장에 동물을 배치.
      참고: 모든 주입 하 고 적절 한 레이블 케이지 표시를 마우스에 대 한이 프로세스를 수행 합니다. L. monocytogenes inoculum의 포스트 주입 농도 확인 하려면 2.3 inoculum의 나머지 금액을 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 정 L. monocytogenes 감염 inoculum 마우스 당 평균 CFU 측정에서 사전 및 사후 주입 inoculum 샘플으로 보고.
5. 감염 된 동물을 매일 모니터링 하 고 질병의 어떤 명백한 표시 (예, 모피, 돌출된 자세, 느린 운동, 체중 감량 쓸). 표시 하는 이전 연구에서 72 h 후 감염 (예를 들어, 24, 48 h 후 감염) 크게 죽어가는 고통 없이 희생 동물을 제거 합니다. 매일 모니터링 모든 나머지 동물은 감염 된 후 72 h에 희생 될 때까지 계속 합니다.
   참고: L. monocytogenes 변형 10403S BALB/c 마우스에 대 한 50% 치 사 량 (LD₅₀) ~ 1-2 × 10⁴ CFU/동물 이다. 위에 표시 된 대로 L. monocytogenes 이 프로토콜을 사용 하 여의 LD₅₀ 복용량으로 감염 된 쥐 질병의 증상을 보이기 있습니다 그리고 조사 시작 72 h 후 감염 다음 감염에 굴복 하는 쥐를 기대할 수 있습니다.

4. 절 개 및 심장 관류의 마우스에 감염 된 L. monocytogenes

1. 감염 된 후 72 h (또는 이전 시간에서), CO₂ 질 식 자 궁 경관 탈 구 뒤 등 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 감염 된 쥐를 안락사.
   참고: 혈액 컬렉션 수행 될 경우, 자 궁 경부 전위를 수행 하는 동안 혈관의 찢기 최소화 합니다.
   1. 쥐 발 트 위치 응답의 부재에 의해 안락사 되는 확인 합니다.
      참고: 심장 관류 수행 하는 것입니다, 4 mL 볼륨/min 흐름 속도로 자동된 펌프/관류 시스템을 설정 합니다.
2. 해 부 팬에서 그것의 뒤에 동물을 놓고 복 모피/피부 표면에 75% 에탄올을 적용 합니다.
3. 가 위를 사용 하 여 복 부 벽에 절 개를 확인 하 고 바로 흉 곽 아래를 절 개를 확장.
4. 다이어 프 램 및 내장 장기를 노출 합니다.
   참고: 있을 어떤 내장 장기를 괴롭히다 하지 않도록 주의 하십시오.
5. 횡 경 막을 절단 하 여 흉 강을 열고 양측 노출은 심장의 좌 심 실에 흉 곽을 잘라.
6. 삽입 21 G 나비 바늘 왼쪽된 심 실에 관류 시스템에 연결 하 고 다음 신중 하 게 잘라 혈 (~0.2 mL) 오른쪽 아 트리 움 2 mL 튜브 10mm ethylenediaminetetraacetic를 포함 하 고 마음 잡고 부드럽게 무딘 집게를 사용 하 여, 산 (EDTA) 응고를 방지 하기 위해입니다. 마우스에 심장 관류의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.
   참고: 관류 수행을 하지 않으면 혈액 수 있습니다 심장 찔린 1 mL 주사기를 사용 하 여 수집 되며 신속 하 게 포함 하는 10 mM EDTA 응고를 방지 하기 위해 2 mL 튜브로 전송. L. monocytogenes-감염 된 장기는 다음 단계로 설명 (5.1) 수확.
7. 관류를 시작 하 고 10 mM EDTA를 포함 하는 PBS의 15-20 mL와 4 분에 대 한 동물을 perfuse.
   참고: PBS-EDTA 솔루션 통해 오른쪽 아 트리 움 및 해 부 팬으로 흐르는 혈액을 관찰 하 여 재 관류를 평가 합니다. 두뇌와 간 완전 한 관류 수확된 장기 및 하지 순환 혈액에서 잔여 박테리아는 확인 후 blanched 나타납니다 합니다.

5. 장기 수확 및 세균성 짐의 결심

1. 다음 관류, 신중 하 게 모든 맥 관 구조와 인 대를 제거 하 여 수확 장기 (예: 간, 비장) 연결 된 고 장기 별도로 살 균 냉 (4 ° C) PBS의 5 mL를 포함 하는 살 균 15 mL 원뿔 튜브 합니다. 추가 처리가 발생할 때까지 얼음에 샘플을 저장 합니다.
2. 두뇌를 수확, 목을 벨가 위를 사용 하 여 귀 뒤에 머리 하 고 잘라 두 피 피부 중간 중간 선 아래로 동물의 눈. 필요한 경우 트림 초과 조직 유지가 위의 두개골에 대 한 누르면.
   1. 부드럽게 구멍 매그넘 (척수를 통해 전달 하는 두개골의 기지에서 구멍)에 위의 한 끝을 삽입 하 고 양쪽에 두개골 옆으로 잘라.
   2. 부드럽게 잘라 두개골 사이 측면 압력을 적용 해야 되 고, 중간 선 아래 설치류의 눈. 두뇌의 섭 동을 방지 하 고 뇌 조직과 위 사이 최소 접촉을 유지.
   3. 좋은 팁 집게를 사용 하 여 두개골 두뇌를 노출 하 고 뇌의 뇌 제거를 두개골의 기지 사이 주걱 장소을 엽니다.
      참고:이 두뇌 신경 섬유의 찢 어에 발생 합니다.
   4. 조심 스럽게 메 마른 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 전송 합니다.
   5. 마우스 시체를 버리고 고 나머지 동물에 대 한 이러한 단계를 반복 합니다.
      참고: 모든 장기 수확 되어, 일단 프로시저 영역을 청소 하 고 세균성 부담을 결정 하는 기관 균질에 대 한 준비.
3. 깨끗 하 고 조직 균질 화기 팁 삽입 10 s에 순차적으로 5% 표 백제, 살 균 물, 75% 에탄올, 살 균 물 각 별도 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된에 균질 화기를 실행 하 여 캐비닛에 biosafety 배치의 끝을 소독.
4. 감염 된 뇌를 균질 (~ 20 설정에 s 6, 최대 rpm) 15 mL 원뿔 튜브 아니 보이는 조직 파편 남아 때까지.
   1. 깨끗 한 세균을 방지 하기 위해 균질 화기 단계 5.3에에서 설명 된 대로 다음 기관 샘플 오염 월.
   2. 다른 기관 (예를 들어, 간, 비장)에 대 한 균질 화 과정을 수행 합니다.
   3. 균질 프로세스가 완료 되 면 청소는 균질 화기 추가 사용까지 단계 5.3 및 저장소에 설명 된 대로.
5. 살 균 PBS에 기관 homogenates의 10 연속 희석을 준비 하 고 결정 기관 당 CFU BHI 천/스 판에 희석 접시.
   참고: 유사한 방법은 혈액의 mL 당 CFU를 결정 하기 위해 수행 됩니다.
   1. 모든 희석은 도금 후 하룻밤 37 ° C 배양 기 격판덮개 전송.
   2. 다음 날, 기관 당 박테리아의 총 수 또는 혈액의 mL 다음과 같이 결정 각 접시에 식민지의 수를 계산:
      CFU/기관 (x 희석 요소 식민지의 수) = homogenate의 mL 도금 x 5 /
      CFU/mL의 혈액 (x 희석 요소 식민지의 수) = / mL 혈액의 도금

두뇌는 매우 나가도록 하 고 L. monocytogenes 세포 유형 혈액3,13에 있는 감염으로 알려져 있다. 설명된 프로토콜 L. monocytogenes 의 능력을 감염 쥐에 있는 두뇌의로 이어지는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과 하는 데 사용 됩니다. 박테리아 vivo에서BBB 교차 하는 경우를 확인 하려면 마우스에서 혈액의 재 관류는 두뇌에 있는 세균성 짐을 결정 전에 수행 됩니다. 그렇지 않으면, 얻은 CFU는 뇌의 혈관에 존재 하는 박테리아를 포함할 수 있습니다. L. monocytogenes 감염 두뇌 (그림 3A)와 (그림 3B) 간 전이나 후 관류 72 h 감염 된 후에 표시 됩니다. 그림 4 에서는 세균 부담 L. monocytogenes-감염 된 마우스 장기 및 뇌, 혈액, 간, 그리고 각 마우스의 비장에 박테리아의 수를 보여줍니다. 이러한 데이터는 관류의 제안 동물 크게 미치지 않았다 마우스 장기 연구 (그림 4) 검사에서 세균 부담.

그림 1 :의 도식 개요는 L. monocytogenes vivo에서 감염 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 심장 관류 절차의 회로도. 관류 좌 심 실 (단계 4.6)에 관류 바늘의 삽입을 보여주는 마우스 마음 통해. 바늘 삽입, 다음 즉시 절 개가 이루어집니다 오른쪽 아 트리 움으로 관류 절차를 시작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 마우스 장기 감염 다음 수확 L. monocytogenes. BALB/c 마우스 정 맥 감염 된 야생-타입 L. monocytogenes 10403S, (1-2x 104 박테리아/동물)와 측면 꼬리 정 맥 주입을 통해 . 72 시간 후 감염, 마우스 했다 안락사와 마우스 장기 수집 된 또는 안락사 마우스 했다 수확 하는 기관의 이전 10 mM EDTA를 포함 하는 PBS의 15-20 mL로 심장을 통해 끼얹는다. 대표적인 두뇌 (A)과 간 (B) 비 끼얹는다 또는 끼얹는다 쥐에서 표시 됩니다. Note 관류는 세균성 CFU 확보에서 수확된 장기 조직과 조직 내의 순환 혈액 하지 후 마우스 장기 화이트/창백 (blanched) 나타납니다. 이 그림은 Ghosh 외., 201814에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 감염 된 마우스 장기에 세균성 부담. BALB/c 마우스는 그림 3에 설명 된 대로 야생-타입 L. monocytogenes 10403S와 정 맥 감염 되었다. 72 h 후 감염, 뇌, 혈액, 간, 그리고 각 마우스의 비장에 수집 되었고 세균 부담 결정. 별도 실험에서 쥐의 전신 관류 수행 하 고 각 기관 내에서 세균 부담 결정. 수평 라인 중간 값을 나타냅니다. * 이 그룹에 대 한 혈액 심장 관류의 시작 직전 수집 되었다. 이 그림은 Ghosh 외., 201814에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.