Summary
여기, 우리는 일련의 유화 및 여러 centrifugations를 포함 하는 기계적인 프로세스를 통해 지방 조직에서 stromal 혈관 분수를 얻기 위해 프로토콜 제시.
Abstract
Stromal 혈관 분수 (SVF); 다양 한 질병에 대 한 재생 도구가 되고있다 그러나, 입법 콜라를 사용 하 여 셀 제품의 임상 적용을 엄격 하 게 통제 한다. 여기, 우리는 순전히 기계적 과정에 의해 지방 조직에서 SVF 셀 및 기본 세포 외 매트릭스의 주사 혼합물을 생성 하는 프로토콜을 제시. Lipoaspirates는 원심 분리기에 투입 되며 1200 x g 3 분에 합니다. 중간 계층은 수집 하 고 (고밀도 하단) 지방과 저밀도 지방 상단에 2 개의 층으로 분리. 상위 계층은 직접 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화 됩니다. 유화 지방 2000 x g 3 분,에서 centrifuged 그리고 기름 층 아래 끈적끈적한 물질을 수집 하 고는 세포 외 기질 (ECM)으로 정의 / SVF 젤. 꼭대기 층에 오일 수집 됩니다. 오일의 약 5 mL는 고밀도 지방 15 mL에 추가 하 고 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화. 유화 지방 2000 x g 3 분에 centrifuged 그리고 끈적끈적한 물질은 또한 ECM/SVF-젤. 누드 마우스에 ECM/SVF-젤의 이식 후에 이식 수확 이며 더 시험에 의해 평가. 결과이 제품에는 정상적인 지방 조직으로 재생성을 보여줍니다. 이 절차는 간단 하 고 효과적인 기계적 분리 절차 SVF 세포 재생 목적을 위해 그들의 자연적인 지원 ECM에 포함 된 응축입니다.
Introduction
그들은 다양 한 질병1에 대 한 대체 치료 처방을 제공할 수 있도록 줄기 세포 치료 조직 수리 및 재생에 대 한 패러다임의 변화를 제공 합니다. 줄기 세포 (예를 들면, 유도 만능 줄기 세포와 배아 줄기 세포) 큰 치료 잠재력을가지고 하지만 셀 레 귤 레이 션 및 윤리적인 고려 사항으로 인해 제한 됩니다. 지방 유래 중간 엽 기질/줄기 세포 (ASCs)는 쉽게 lipoaspirates에서와 같은 제한; 적용 되지 않습니다 얻을 따라서, 그것은 실용적인 재생 의학2에 대 한 이상적인 셀 유형이 되고있다. 또한, 그들은 nonimmunogenic 이며 헌 지방3에서 풍부한 자원을.
현재, ASCs 주로 지방이 많은 직물의 콜라 중재 소화에 의해 얻을 수 있습니다. 지방이 많은 직물의 실질 혈관 분수 (SVF) ASCs, 내 피 뿌리 세포, pericytes, 및 면역 세포에 포함 되어 있습니다. 효소 고밀도 SVF/ASCs를 얻는 유익한 효과를 표시 했다, 비록 여러 국가에서 입법은 엄격 하 게 콜라4를 사용 하 여 셀 기반 제품의 임상 적용을 규제 합니다. SVF 세포를 얻기 위해 1 시간 30 분 콜라와 함께 지방 조직 소화 준비와 생물 학적 오염 두 외 인 물질의 위험을 증가. 부착 문화와 일 주 소요, ASCs, 정화 특정 실험실 장비가 필요 합니다. 또한, 대부분의 연구에서 SVF 전지와 ASCs 서 스 펜 션에 사용 됩니다. 세포 외 기질 (ECM) 또는 다른 항공사의 보호 없이 프리셀은 취약 하 고 주입 후 가난한 셀 유지가 발생할 손상 치료 결과5. 이러한 이유로 모두 줄기 세포 치료의 추가 응용 프로그램을 제한합니다.
콜라-중재 소화 하지 않고 지방 조직에서 ASCs를, 원심 분리, 자르고, 분쇄, pureeing, 고 닦지, 기계 등 여러 기계적 처리 절차, 개발된6,7 되었습니다. , 8 , 9. 이러한 방법은 기계적으로 성숙한 adipocytes 및 그들의 석유를 포함 하는 소포를 방해 하 여 조직과 ASCs를 응축 하 생각 된다. 또한, ASCs의 높은 농도 포함 하는 이러한 준비 동물에서 재생 의학 모델8,,910로 상당한 치료 잠재력을 보여주었다.
2013 년에 Tonnard 외. 유화 lipoaspirates intersyringe11처리 하 여 생산 관련 기술을 접목 하는 nanofat를 소개 했다. 이동 하는 intersyringe에 의해 만들어진 전단 힘 선택적으로 성숙한 adipocytes를 끊을 수 있다. 우리 SVF 세포와 ECM/SVF-젤12분류 한 ECM 떠나 lipoaspirates에서 대부분의 지질 및 액체를 제거 하는 순전히 기계적 처리 방법 개발 그들의 결과에 따라. 여기, 우리 인간 파생 된 지방 조직 ECM/SVF-젤 생산의 기계적 프로세스의 세부 사항을 설명 합니다.
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Protocol
이 연구 윤리 검토 보드 Nanfang 병원, 광저우, 중국에에서 의해 승인 되었다. 지방 조직 건강 한 기증자 했다 서 면 통지 해준 동의 연구에 참여 하에서 수집 되었다. 모든 동물 실험 Nanfang 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하 고 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (중국)의 지침에 따라 수행 했다.
1. ECM/SVF-젤 준비
- 베스트 지방입니다.
- 정 맥과 3 mm 멀티 포트-0.75에 직경에서 1 m m의 여러 날카로운 측면 구멍을 포함 하는 인간에서 지방 흡입을 수행 흡입 압력의 atm.
- 멸 균 가방에 lipoaspirates의 200 mL를 수집 합니다.
- 콜맨 지방 준비.
- 4 50 mL 튜브에는 lipoaspirates를 전송 하 고 여전히 10 분 동안 서 서가 걷이 지방 수 있도록.
- 전송, 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 두 50 mL 튜브에 꼭대기 층에 지방을 수집 하 고 하단 계층에서 액체 부분 삭제.
- 사용 하 여 50 mL 튜브, centrifugate 뚱뚱한 층 1200 x g 실 온 (RT)에서 3 분.
- 콜맨 지방으로 상위 레이어 (약 80 mL)를 정의 합니다.
- 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 20 mL 튜브에 콜맨 지방의 상단 2/3를 전송 하 고 저밀도 지방으로이 부분을 정의 합니다.
- 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 다른 20 mL 튜브에 콜맨 지방의 더 낮은 1/3를 전송 하 고 고밀도 지방으로이 부분을 정의 합니다.
- 저밀도 지방에서 ECM/SVF-젤을 생성 합니다.
- 저밀도 지방 20 mL intershift에 여성에 게 여성 Luer 잠금 커넥터 (2.4 m m의 내부 직경)에 의해 연결 된 2 개의 20 mL 주사기를 사용 하 여.
- (20 mL/s)에서 안정적인 변화 속도 유지 하 고 8 x 6 x 반복.
- Centrifugate 2000 x g RT에서 3 분 대에서 혼합물.
- 추가 사용에 대 한 실시간에 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 10 mL 튜브에서 위에 기름 부분을 수집 합니다.
- ECM/SVF-젤 (그림 1A), 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여, 중간 계층에서 끈적끈적한 물질을 수집 하 고 아래 계층에 액체를 폐기.
- 고밀도 지방에서 ECM/SVF-젤을 생성 합니다.
- 고밀도 지방 15 ml (단계 1.3.4에서에서 수집) 오일의 5 mL를 추가 합니다.
- 주사기 6 사이 혼합된 지방 intershift x 8 x는 있어 유제 내에서 관찰 될 때까지.
- Centrifugate 2000 x g RT에서 3 분 대에서 혼합물.
- 위에 기름 부분을 삭제 합니다.
- 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 중간 계층 (ECM/SVF-젤)에 끈적끈적한 물질을 수집 하 고 아래 계층에 액체를 폐기.
- 1.3.5-1.4.5 단계에서 ECM/SVF 젤을 믹스.
2. 누드 마우스 ECM/SVF-젤 이식 모델
- 누드 마우스 anesthetize (8 주 오래 된, 여성)와 isoflurane (1%-3%) 흡입 마 취는 동물 작업 룸입니다.
- 전송 ECM/SVF-젤 1 mL 주사기.
- 무딘 침투 정으로 1 mL 주사기를 연결 합니다.
- 마우스의 각 측면에 피하는 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
- ECM/SVF-젤의 0.3 mL를 주사.
3. 조직 ECM/SVF-젤 주입 후 3, 15, 및 90 일에 수확
- Anesthetize isoflurane (1%-3%)와 쥐 흡입 마 취입니다.
- 자 궁 경부 전위 방법으로 쥐를 희생.
- 수술가 위로 중간 마우스의 등 쪽 피부에 절 개를 확인 합니다.
- 부 고는 마우스의 양쪽에 지방 이식 수확. 밤새 RT에서 4 %paraformaldehyde 지방 이식 포함 합니다.
- 에탄올의 농도 증가에 직물을 탈수: 70% 에탄올, 변화 2, 1 시간 각각; 80% 에탄올, 하나의 변경, 1 h; 95% 에탄올, 하나의 변경, 1 h; 100% 에탄올, 3 변화, 1.5 h 각; 크 실 렌, 3 변화, 1.5 h
- 파라핀 왁 스 (58-60 ° C), 변화, 2 h 2로 조직 침투
- 파라핀 블록으로 조직을 포함 합니다. 약 4 µ m의 두께에서 섹션을 잘라내어 슬라이드에 넣어.
4. hematoxylin와 오신 얼룩
- I, II, 및 III (각 10 분) 크 실 렌에서 그들을 몸을 담글 하 여 파라핀 블록 슬라이드를 deparaffinize.
- 감소 하는 농도 (100%, 100%, 95%, 80%, 70%)을 통해 전달 하 여 조직 단면도 rehydrate 3 분의 에탄올 목욕.
- 증류수 (5 분)에서 조직 섹션 린스.
- 되며 5 분 동안에 직물 단면도 착 색.
- 1% 산 알코올에 20 분 Decolorize의 수돗물을 실행 조직 섹션 린스 (1% 70% 알코올에 HCl) 5 미 린스 섹션은 다시 파란색까지 수돗물을 실행에 대 한.
- 피 펫, 하 여 슬라이드에 직접 오신 Y 염료의 2 ~ 3 방울을 추가 하 고 10 분 동안 설정 하는 염료.
- 슬라이드 1-5 분 동안 수돗물에 씻어.
- 증가 농도 (70%, 80%, 95%, 100%, 100%)에서 슬라이드를 탈수 3 분의 에탄올의
- 5 분 동안 크 실 렌에서 슬라이드 I 및 II를 선택을 취소 합니다.
- 설치 미디어에서 슬라이드 탑재 합니다.
5. immunofluorescent 얼룩
- Deparaffinize 크 실 렌의 조직 단면도 I, II, 및 III (각 5 분).
- 다양 한 농도 (100%, 100%, 95%, 95%, 70%)을 통해 전달 하 여 조직 단면도 rehydrate 3 분에 대 한 알코올 목욕.
- 10 분에 대 한 실시간에 메탄올에 3% H2O2 솔루션에서 섹션을 품 어.
- 슬라이드 2 린스 증류수, 5 분 x.
- 슬라이드 슬라이드 바구니에 드롭. 10 m m 구 연산 염 버퍼 (pH 6.0)의 300 mL를 추가 하 고 10 분 동안 95-100 ° C에서 슬라이드를 품 어.
- 멋진 20 분에 대 한 실시간에 슬라이드.
- 슬라이드 2 린스 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 5 분 x.
- 슬라이드에 10% 태아 둔감 한 혈 청의 100 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 실시간에 습도 챔버에 품 어.
- 4 ° C에서 1 차적인 항 체 용액 (기니 피그 반대로 마우스 Perilipin, 1:400)와 섹션을 밤새 품 어.
- PBS 3 가진 슬라이드 린스 x, 5 분.
- 이차 항 체 솔루션 섹션을 품 어 (염소 항 기니 돼지-488 IgG) 실시간에서 2 h
- PBS 3 가진 슬라이드 린스 x, 5 분.
- 깨끗 한 티슈로 섹션 주위 물 닦으.
- 슬라이드에 대 한 섹션을 충당 하기 위해 원에 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 isolectin를 드롭.
- coverslips를 탑재 하 고 어둠 속에서 말리.
- 형광 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.
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Representative Results
ECM/SVF-젤 콜맨 지방을 처리 한 후 폐기 기름의 볼륨 최종 볼륨의 80%를 차지 하 고 지방 조직 기름 층 아래 보존의 20%만 ECM/SVF-젤 (그림 1A)로 간주 됩니다. ECM/SVF-젤은 27 G 정밀한 바늘;을 통해 갈 수 있도록 하는 부드러운 액체 같은 질감 그러나, 콜맨 지방 그리고 큰 섬유와 필수 지방 구조의 구성 18 G 정 (그림 1B)를 통해 갈 수 있습니다.
이식 후 3 일에 다 수 소형 preadipocytes 여러 세포내 지질 작은 물방울, 광범위 한 잘 vascularized 결합 조직, 및 선 동적인 세포 침투의 등장. 하루에 15에 시작, 염증 세포의 수 점차적으로, 감소를 시작 하 고 adipocytes 성숙 하기 시작 했다. 하루 90, vascularized 결합 조직에는 이식의 대부분 성숙한 adipocytes (그림 2, 상단 패널)로 대체 했다.
ECM/SVF-젤 이식에서 이식 후 3 일 몇 perilipin 긍정적인 adipocytes를 포함. 소형 preadipocytes 여러 세포내 지질 방울으로 하루 15에 게재 하기 시작 했다. ECM/SVF-젤의 각 필드는 하루 90 수많은 perilipin 긍정적인 adipocytes와 새로 형성된 된 혈관 (그림 2, 낮은 패널)에 섹션을 이식.
그림 1 : 이미지의 ECM/SVF-젤. Centrifuged 콜맨 지방 그리고 ECM/SVF-젤 (A)를 처리 한 후. ECM/SVF-젤 쉽게; 27 G 바늘을 통해 주입 할 수 있습니다. 그러나, 콜맨 지방만 18 G 정 (B)를 통해 전달할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 이식 후 ECM/SVF 겔에서 조직학 변화. ECM/SVF-젤 광범위 한 잘 vascularized 결합 조직 하 고 3 일에 염증 세포를 침투 했다. 그 후, 대부분 vascularized 결합 조직 성숙 adipocytes (위 패널)를 포함 하는 구조에 의해 대체 되었다. Immunofluorescent 쇼를 얼룩이 지는 조직의 대부분 3 일에 perilipin 음수가 영역의 구성 됩니다. 15 일 perilipin + adipocytes의 큰 부분이 나타났다. 수많은 perilipin 긍정적인 adipocytes 90 일 (하단 패널) 후 발견 되었다. 스케일 바 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
줄기 세포 기반 재생 치료는 다른 질병에서 큰 잠재적인 혜택을 보이고 있다. ASCs는 뛰어난 치료 후보 조직 복구 및 소설 조직15의 재생 능력을가지고 하 쉽기 때문에. 그러나, 그것의 임상 응용 프로그램을 확장 하는 셀과 콜라6처리에 대 한 격리를 복잡 한 절차 때문에 한계가 있다. 따라서, 콜라의 사용 없이 줄기 세포를 얻기 위해 간단한 기술을 개발 하기 위해 필수적 이다.
이 연구에서 우리는 네이티브 지방 ECM에 의해 보호 되는 SVF 세포를 지방 조직의 순전히 기계적 과정을 제시. 또한,이 과정은 콜라 무료. 이전 비교 연구 다른 intersyringe 처리 시간 및 10 mL/s 흐름 속도에서 1 분은 ECM/SVF-젤12생산을 위한 최적의 프로토콜 표준 콜맨 지방의 intersyringe 처리를 보여주었다. 이동 하는 intersyringe를 사용 하 여는 lipoaspirates에 대부분 adipocytes SVF 세포와 ECM 보존의 대부분과 함께, 파괴 된다. 따라서, intersyringe 이동은 전체 과정의 주요 단계입니다. Intersyringe 이동 속도 이동 실시에 소요 하는 시간 intersyringe 프로세스에 의해 만들어진 sheering 힘은 이동 속도와 관련 있기 때문에 지방이 많은 조직의 파괴 수준을 결정 합니다. 이동 속도 20 mL에서 안정 되어야/overdestruction SVF 세포 손상 귀착되는 동안 미 부족 파괴 나머지 원치 않는 adipocytes, 리드는 것이 좋습니다. 다음과 같은 기준에 도달 하는 경우에이 프로토콜의 제품 ECM/SVF-젤으로 정의할 수 있습니다: 1)의 최종 볼륨은 ~ 20%의 초기 볼륨; 2) 그것 쉽게 27g 바늘을 통해 주입 됩니다. 이전 연구 시연 ECM/SVF-젤 높은 밀도의 두 CD45-포함 / CD31-/ CD34 + ASCs SVF 셀 밀도 > 4.0 × 105 셀/mL12.
ECM/SVF-젤을 만드는 과정 동안 원심 분리 실시 2 배, 전에 intersyringe 이동 후 했다. 이동 intersyringe 전에 "등급 밀도" 지방의 만들려고 원심 분리를 사용 합니다. 이것은 또 다른 주요 단계 이다. 그것은 원심, 후 하단에 고밀도 지방 레이어 압축 된 ECM 풍부 하지만 상단에 저밀도 지방 층은 더 많은 석유 하지만 ECM 섬유16,17덜 적은 기름은 입증 되었다. 따라서, 두 가지 방법으로이 두 레이어를 처리 한다. 저밀도 지방을 직접 파괴는 adipocytes intersyringe 처리를 받을 수 있습니다. 그러나, 하단 계층에서 고밀도 지방 추가 오일 adipocytes의 파괴를 촉진 하기 위하여 필요 합니다. 추가 오일 고밀도 지방, 훨씬 쉽게 이동 하의 밀도 줄일 수 있습니다. 또한, 기름 수 있습니다 깨진된 adipocytes;에서 더 많은 석유를 추출 그러나, 수성 액체 수 없습니다. 따라서, 우리는 고밀도 지방에 여분의 기름을 추가. Intersyringe 이동 후 원심 SVF 세포와 ECM에서 기름 부분을 분리 하는 것입니다. 기름은 최종 제품에 피해 야 한다.
ECM/SVF-젤 이식 좋은 유지 율 귀착되는. 우리가 위에서 언급 한, ECM/SVF-젤의 처리의 핵심 단계 이동, intersyringe는 adipocytes의 대부분을 파괴 하는. 따라서, 작은 adipocytes ECM/SVF-젤에 남아 있었다. 그림 2에서 같이, 작은 perilipin 긍정적인 영역 하루 3에 이식된 ECM/SVF-젤에 나타났다. 그러나, 15 일 후 perilipin 긍정적인 adipocytes의 많은 등장 하 고 90 일 후에 성숙 되었다. 이전 연구는 ECM/SVF-젤 이식 호스트 셀 중재 지방 조직 재생14유도 보이고 있다. 새로 형성된 된 adipocytes의 출처를 식별 하기 위해 안티 인간 백혈구 항 원을 사용 하 여, 우리 발견 했다, 비록 대부분은 SVF 셀의 이식 파생 했다, 새로 형성된 된 지방이 많은 직물의 대부분 호스트 파생. ECM/SVF-젤은 우리가 이전에 보고 된 훌륭한 재생 기능이 있다. 이 제품은12치유 하는 상처에 좋은 치료 효과 했다. 또한, 그것은 신생10가속 하 여 마우스 모델에 무료 플랩의 생존 율을 개선 하기 위해 도움이.
SVF 젤 헌 주 사용 네이티브 ECM 기능 세포 구성 요소를 포함 하는. 제품 규제 문제에 관한 어떤 문제 없이 쉽게 실행 될 수 있는 간단한 기계적인 프로세스에 의해 lipoaspirate에서 생성 됩니다. 그러나, ECM/SVF-젤의 재생 효과 불분명 남아 있습니다. ECM/SVF-젤의 유익한 효과 더 나은 특성화, 주문 추가 조사 ECM/SVF-젤의 재생 효과의 기본 분자 메커니즘을 특성화 하는 방식에 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 (81471881, 81601702, 81671931)의 국립 자연 과학 재단, 중국의 광 동 지방 (2014A030310155), 및 (2014B009, Nanfang 병원의 관리자 재단의 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다 2015Z002, 2016Z010, 2016B001)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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