Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الميكانيكية ميكرونيزيشن من ليبواسبيراتيس للعلاج بالتجدد

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58765
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على كسر الأوعية الدموية stromal من الأنسجة الدهنية من خلال سلسلة من العمليات الميكانيكية، والتي تشمل استحلاب وسينتريفوجيشنز متعددة.

Abstract

كسر الأوعية الدموية stromal (SVF) أصبحت أداة التجدد للأمراض المختلفة؛ ومع ذلك، تنظم التشريعات صرامة التطبيق السريري لمنتجات الخلية باستخدام كولاجيناز. نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء أن خليط حقن الخلايا صندوق التبرعات الخاص والمصفوفة خارج الخلية الأصلية من الأنسجة الدهنية بعملية ميكانيكية بحتة. ليبواسبيراتيس موضع الطرد مركزي ونسج في س 1,200 ز لمدة 3 دقائق. الطبقة الوسطى التي جمعت وفصلها إلى طبقتين (الدهون عالية الكثافة في الجزء السفلي) والدهون منخفضة الكثافة في الجزء العلوي. هو مستحلب الطبقة العليا مباشرة بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، والمادة لزجة تحت طبقة النفط التي يتم جمعها ويعرف بأنه المصفوفة خارج الخلية (ECM)/صندوق التبرعات الخاص-جيل. يتم تجميع النفط في الطبقة العليا. إضافة إلى 15 مل الدهون عالية الكثافة حوالي 5 مل من زيت ومستحلب بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، وأيضا المادة لزجة ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل. بعد زرع الأعضاء من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل في الفئران عارية، تحصد الاختلاس وتقييمها بدراسة نسيجية. وتبين النتيجة أن هذا المنتج لديه القدرة على التجدد في الأنسجة الدهنية العادية. هذا الإجراء إجراء الانفصال ميكانيكية بسيطة وفعالة لاختصار الخلايا صندوق التبرعات الخاص جزءا لا يتجزأ من بهم ECM داعمة الطبيعية لأغراض التجدد.

Introduction

تقدم علاجات الخلايا الجذعية تحولاً نموذجياً لإصلاح الأنسجة وتجديدها حتى أنها قد توفر نظام علاجية بديلة لمختلف الأمراض1. الخلايا الجذعية (مثلاً، المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية الجنينية) إمكانيات علاجية كبيرة ولكن محدودة بسبب تنظيم الخلية والاعتبارات الأخلاقية. المستمدة من الدهنية الوسيطة stromal/الخلايا الجذعية (الخزفية) من السهل الحصول على من ليبواسبيراتيس ولا تخضع لنفس القيود؛ وهكذا، فقد أصبح على نوع خلية مثالية للطب التجديدي العملية2. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي نونيمونوجينيك، ولديها موارد وفيرة من الدهون الذاتي3.

حاليا، يتم الحصول على الخزفية أساسا بوساطة كولاجيناز الهضم من الأنسجة الدهنية. ويتضمن الكسر الأوعية الدموية stromal (SVF) من الأنسجة الدهنية الخزفية والسلف غشائي الخلايا وبيريسيتيس والخلايا المناعية. على الرغم من أن الحصول على كثافة عالية من صندوق التبرعات الخاص/الخزفية انزيماتيكالي تبين أن تكون لها آثار مفيدة، ينظم التشريع في عدة بلدان دقة التطبيق السريري للمنتجات المستندة إلى الخلية باستخدام كولاجيناز4. هضم الأنسجة الدهنية مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة إلى ح 1 للحصول على خلايا صندوق التبرعات الخاص يزيد من خطر كل المواد الخارجية في إعداد والتلوث البيولوجي. ثقافة ملتصقة وتنقية الخزفية، التي تستغرق أيام لأسابيع، تتطلب معدات مختبرية محددة. وعلاوة على ذلك، وفي معظم الدراسات، تستخدم الخلايا صندوق التبرعات الخاص والخزفية في تعليق. دون الحماية من المصفوفة خارج الخلية (ECM) أو ناقل آخر، معرضة بالخلايا الحرة ويسبب احتفاظ بخلية فقراء بعد الحقن، وخرق النتيجة العلاجية5. كل هذه الأسباب الحد من تطبيق مزيد من العلاج بالخلايا الجذعية.

للحصول على الخزفية من الأنسجة الدهنية دون وساطة كولاجيناز الهضم، كانت عدة إجراءات التجهيز الميكانيكية، بما في ذلك الطرد المركزي، الميكانيكية تقطيع وتمزيق ونتائج وتنميق، نمواً6،7 , 8 , 9-ويعتقد أن هذه الطرق لاختصار الخزفية والأنسجة بتعطيل ميكانيكيا adipocytes ناضجة وهذه الحويصلات الحاوية للنفط. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الاستعدادات، التي تحتوي على تركيزات عالية من الخزفية، إمكانات علاجية كبيرة كنماذج الطب التجديدي في الحيوان8،،من910.

في عام 2013، قدم تونارد et al. نانوفات تطعيم التقنية، الذي ينطوي على إنتاج مستحلب ليبواسبيراتيس بتجهيز11إينتيرسيرينجي. يمكن كسر قوة القص تم إنشاؤها بواسطة إينتيرسيرينجي تحول بشكل انتقائي adipocytes ناضجة. استناداً إلى النتائج التي تتوصل إليها، قمنا بتطوير أسلوب معالجة ميكانيكية بحتة أن يزيل معظم الدهون والسوائل في ليبواسبيراتيس، ترك ECM هورمونات، وهو ECM/صندوق التبرعات الخاص-جيل12وخلايا التبرعات فقط. هنا، نحن تصف تفاصيل عملية ميكانيكية للأنسجة الدهنية المستمدة من الإنسان لإنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر هذا البحث "مجلس المراجعة الأخلاقية" في مستشفى نانفانغ، مدينة قوانغتشو، الصين. وجمعت الأنسجة الدهنية من صحية المانحين الذين قدموا كتب الموافقة المستنيرة للمشاركة في الدراسة. وافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية مستشفى نانفانغ جميع التجارب على الحيوانات وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية "الوطنية للصحة" و "مجلس البحوث الطبية" (الصين).

1-ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل إعداد

  1. الدهون الحصاد.
    1. إجراء شفط الدهون على إنسان مع قنية متعددة المنافذ 3 مم، التي تحتوي على عدة ثقوب جانبية حادة من 1 مم في القطر، وفي-0.75 الصراف الآلي للضغط شفط.
    2. جمع 200 مل ليبواسبيراتيس في كيس معقم.
  2. تعد الدهون كولمان.
    1. نقل ليبواسبيراتيس إلى أربعة أنابيب 50 مل والسماح للدهون المقطوع الترشح لا يزال 10 دقيقة.
    2. جمع الدهون في الطبقة العليا إلى أنبوبين 50 مل باستخدام ماصة واسعة-نصيحة نقل، وتجاهل الجزء السائل في الطبقة السفلي.
    3. استخدام أنابيب 50 مل، سينتريفوجاتي طبقة الدهون في س 1,200 ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    4. تعريف الطبقة العليا (حوالي 80 مل) الدهون كولمان.
    5. نقل الأعلى 2/3 من الدهون كولمان إلى أنبوب 20 مل باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، وتعريف هذا الجزء الدهون منخفضة الكثافة.
    6. نقل 1/3 أقل من الدهون كولمان إلى آخر 20 مل الأنبوبة باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، ويحدد هذا الجزء الدهون عالية الكثافة.
  3. إنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل من الدهون منخفضة الكثافة.
    1. استخدام المحاقن 20 مل اثنين متصلة بواسطة موصل أنثى والإناث اللوير لوك (مع قطرها داخلي 2.4 مم) إينتيرشيفت 20 مل الدهون منخفضة الكثافة.
    2. تبقى على سرعة تحول مستقر (في 20 مل/s) وكرر 6 x 8 x.
    3. سينتريفوجاتي الخليط في 2,000 س ز على RT لمدة 3 دقائق.
    4. جمع الجزء النفط على رأس في أنبوب 10 مل باستخدام ماصة واسعة-تلميح في RT لاستخدامها مرة أخرى.
    5. جمع المادة لزجة في الطبقة الوسطى، وهو ECM/صندوق التبرعات الخاص-هلام (الشكل 1أ)، باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، وتجاهل السائل في الطبقة السفلي.
  4. إنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل من الدهون عالية الكثافة.
    1. إضافة 5 مل نفط (التي تم جمعها من الخطوة 1.3.4) إلى 15 مل الدهون عالية الكثافة.
    2. إينتيرشيفت الدهون مختلطة بين الحقن 6 x 8 x حتى يلاحظ فلوككولاتي داخل المستحلب.
    3. سينتريفوجاتي الخليط في 2,000 س ز على RT لمدة 3 دقائق.
    4. تجاهل الجزء النفط في الجزء العلوي.
    5. جمع المادة لزجة في الطبقة الوسطى (ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل) باستخدام ماصة واسعة-تلميح وتجاهل السائل في الطبقة السفلي.
    6. مزيج ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل من الخطوات 1.3.5 و 1.4.5.

2-نموذج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل الاختلاس الماوس عارية

  1. تخدير الفئران عارية (8 أسابيع القديمة، والنساء) مع إيسوفلوراني (1%-3%) استنشاق التخدير في غرفة عمليات حيوانية.
  2. نقل ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل لحقنه 1 مل.
  3. قم بتوصيل حقنه 1 مل مع قنية تسلل كليلة.
  4. إدراج القنية تحت الجلد في الجناح كل من الماوس.
  5. حقن 0.3 مل من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل.

3-الأنسجة الحصاد على 3، 15، و 90 يوما بعد حقن ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل

  1. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني (1%-3%) التخدير استنشاق.
  2. التضحية الفئران بواسطة الأسلوب التفكك عنق الرحم.
  3. جعل شق في خط الوسط للجلد الظهرية للماوس مع المقص الجراحي.
  4. تشريح والحصاد ترقيع الدهون على كلا الجانبين من الماوس. تضمين ترقيع الدهون في بارافورمالدهيد 4 ٪ في الرايت بين عشية وضحاها.
  5. يذوي الأنسجة في زيادة تركيزات إيثانول: إيثانول 70%، اثنين من التغييرات، ح 1 وكل؛ الإيثانول 80%، وتغيير واحد، ح 1؛ الإيثانول 95%، وتغيير واحد، ح 1؛ 100 ٪ الإيثانول، ثلاثة تغييرات، 1.5 ح كل؛ زيلين نفط، ثلاثة تغييرات، كل 1.5 ح.
  6. اختراق الأنسجة مع شمع البارافين (58-60 درجة مئوية) واثنين من التغييرات، 2 حاء.
  7. تضمين الأنسجة إلى كتل البارافين. قطع المقاطع في سمك من حوالي 4 ميكرومتر ووضعها على الشرائح.

4-توضع وتلطيخ ويوزين

  1. ديبارافينيزي الشرائح كتلة البارافين التي نقع عليها في زيلين نفط الأول، والثاني، والثالث (10 دقيقة في كل).
  2. ترطيب أقسام الأنسجة بتمريرها من خلال خفض تركيزات (100%، 100%، 95%، 80%، 70%) حمامات الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  3. شطف مقاطع الأنسجة في الماء المقطر (5 دقائق).
  4. وصمة عار مقاطع الأنسجة في توضع لمدة 5 دقائق.
  5. أشطف أقسام الأنسجة في إدارة مياه الحنفية عن 20 دقيقة ديكولوريزي في الكحول حمض 1% (1% HCl في الكحول 70%) شطف س. 5 في تشغيل ماء الصنبور حتى المقاطع الأزرق مرة أخرى.
  6. إضافة ثلاث قطرات صبغ ويوزين Y مباشرة على الشرائح واسطة ماصة، والسماح لصبغ تعيين لمدة 10 دقائق.
  7. يغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة 1-5 دقائق.
  8. يذوي الشرائح في زيادة تركيزات (70%، 80%، 95%، 100%، 100%) من الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  9. مسح الشرائح في زيلين نفط الأول والثاني لمدة 5 دقائق.
  10. تحميل الشرائح في تركيب وسائط.

5-إيمونوفلوريسسينت تلطيخ

  1. ديبارافينيزي أقسام الأنسجة زيلين نفط الأول، والثاني، والثالث (5 دقيقة في كل).
  2. ترطيب أقسام الأنسجة التي يمر بها تركيزات مختلفة (100%، 100%، 95%، 95%، 70%) من الكحول وحمامات لكل 3 دقائق.
  3. احتضان المقاطع في حل 3 ٪ ح22 س في الميثانول في RT لمدة 10 دقائق.
  4. شطف الشرائح 2 x مع الماء المقطر، كل 5 دقائق.
  5. إسقاط الشرائح في سلة شريحة. إضافة 300 مل من 10 ملم سترات المخزن المؤقت (pH 6.0) واحتضان الشرائح في 95-100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. بارد شرائح RT لمدة 20 دقيقة.
  7. شطف الشرائح 2 x مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، كل 5 دقائق.
  8. إضافة 100 ميليلتر من 10% مصل بقرى الجنين على الشرائح واحتضان في دائرة هوميديفيد في الرايت ح 1.
  9. احتضان الفروع مع حل جسم الأولية (خنزير غينيا المضادة الماوس بيريليبين، 1: 400) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  10. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 س، 5 دقيقة.
  11. احتضان الفروع مع حل جسم الثانوي (مفتش الماعز خنزير غينيا المضادة-488) عن ح 2 في الرايت
  12. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 س، 5 دقيقة.
  13. تمحو الماء حول المقطع مع نظيفة المناديل الورقية.
  14. قطره 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ومترافق 488 فلور أليكسا إيسوليكتين داخل الدائرة لتغطية القسم على الشريحة.
  15. جبل كوفيرسليبس والسماح لهم الجافة في الظلام.
  16. مراقبة الشرائح مع مجهر فلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد معالجة الدهون كولمان إلى ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل، يأخذ حجم النفط مهملة حتى 80 في المائة الحجم النهائي و 20% فقط من الأنسجة الدهنية للحفاظ عليها تحت طبقة النفط يعتبر ECM/صندوق التبرعات الخاص-هلام (الشكل 1أ). وقد ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل مادة سائل يشبه سلس الذي يمكن أن تذهب من خلال إبرة غرامة ز 27؛ ومع ذلك، الدهون كولمان يتكون هيكل الدهنية لا يتجزأ مع ألياف كبيرة ويمكن أن تمر إلا 18 جرام قنية (الشكل 1ب).

في اليوم الثالث بعد زرع الأعضاء، ظهر عدد كبير من برياديبوسيتيس صغيرة الحجم مع متعددة قطرات داخل الخلايا الدهنية والنسيج الضام جيدا فاسكولاريزيد واسعة النطاق وتسلل الخلايا التحريضية. بداية من يوم 15، بدأ عدد الخلايا التحريضية تحصل على تخفيض تدريجيا، و adipocytes وبدأت تنضج. خلال 90 يوما، قد استعيض معظم النسيج الضام فاسكولاريزيد في الطعوم adipocytes الناضجة (الشكل 2، اللوحة العلوية).

ترقيع ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل الواردة قليلة المناعة بيريليبين adipocytes، 3 أيام بعد زرع الأعضاء. برياديبوسيتيس صغيرة الحجم مع متعددة داخل الخلايا الدهنية قطرات بدأت تظهر في اليوم 15. كل حقل من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل graft المقاطع في اليوم 90 أظهرت العديد من adipocytes بيريليبين-إيجابية وشكلت حديثا الأوعية الدموية (الشكل 2، لوحة أقل).

Figure 1
الشكل 1 : صور من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل. فصل الدهون كولمان وهلام-ECM/صندوق التبرعات الخاص بعد المعالجة (A). يمكن حقن ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل بسهولة عن طريق إبرة ز 27؛ ومع ذلك، يمكن فقط يمر الدهون كولمان قنية ز 18 (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تغير النسيجي في ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام بعد زرع الأعضاء- وأظهرت ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل النسيج الضام جيدا فاسكولاريزيد واسعة النطاق والتسلل إلى الخلايا الملتهبة في يوم 3. وفي وقت لاحق، حلت معظم النسيج الضام vascularized بنية تحتوي على adipocytes ناضجة (اللوحة العلوية). إيمونوفلوريسسينت تلطيخ يظهر أن معظم الأنسجة يتألف من منطقة بيريليبين-السلبية في اليوم 3. يوم 15، ظهر عدد كبير من بيريليبين + adipocytes. تم العثور على adipocytes بيريليبين-إيجابية عديدة بعد 90 يوما (أسفل اللوحة). أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وأظهرت القائمة على الخلايا الجذعية العلاج التجديدي فائدة محتملة كبيرة في أمراض مختلفة. الخزفية هي المرشحين العلاجية المعلقة لأنها سهلة للحصول على ولديهم القدرة على إصلاح الأنسجة وتجديد الأنسجة رواية15. ومع ذلك، هناك قيود على توسيع نطاق التطبيق السريري وأنها تتطلب إجراءات معقدة لعزل الخلايا وكولاجيناز لتجهيز6. ولذلك، من الضروري لتطوير تقنية بسيطة للحصول على خلايا جذعية دون استخدام كولاجيناز.

في هذه الدراسة، وقد عرضنا عملية ميكانيكية بحتة من الأنسجة الدهنية للحصول على خلايا التبرعات، التي تحميها ECM الدهنية أصلي. وعلاوة على ذلك، تعتبر هذه العملية خالية من كولاجيناز. سابقة دراسة مقارنة مختلف إينتيرسيرينجي تجهيز مرات وأظهرت أن المعالجة إينتيرسيرينجي القياسية كولمان الدهون 1 دقيقة بمعدل تدفق 10 مل/s هو البروتوكول الأمثل لإنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل12. باستخدام تحويل إينتيرسيرينجي، تدمر adipocytes معظم في ليبواسبيراتيس، مع معظم الخلايا صندوق التبرعات الخاص وإدارة المحتوى في المؤسسة الاحتفاظ. وهكذا، إينتيرسيرينجي التحول هو خطوة رئيسية للعملية برمتها. سرعة التحول إينتيرسيرينجي، والوقت الذي يقضيه في إجراء تحويل تحديد مستوى الدمار الأنسجة الدهنية نظراً لقوة شيرينج التي تم إنشاؤها بواسطة عملية إينتيرسيرينجي المقترنة مع سرعة التحول. ونحن نقترح أن سرعة التحول ينبغي أن يكون مستقرا في 20 مل/س. التدمير غير كاف يؤدي إلى adipocytes المتبقية غير المرغوب فيها، في حين أوفيرديستروكشن يؤدي إلى إتلاف الخلايا صندوق التبرعات الخاص. ويمكن تعريف المنتج من هذا البروتوكول ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل إلا إذا وصلت إلى المعايير التالية: 1) حجمها النهائي هو ~ 20% حجم الأولية؛ 2) فإنه يتم حقن بسهولة عن طريق إبرة ز 27. أظهرت دراسة سابقة أن ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام يحتوي على كثافة عالية من كلا CD45-/CD31-CD34 + "الخزفية" وكثافة الخلية صندوق التبرعات الخاص هو > 4.0 × 105 خلايا/مل12.

أثناء عملية إنشاء المحتوى/صندوق التبرعات الخاص-جل، كان الطرد المركزي أجرى 2 x، قبل وبعد تحويل إينتيرسيرينجي. قبل إينتيرسيرينجي التحول، نحن استخدام الطرد المركزي لإنشاء "متدرج الكثافة" من الدهون. هذا خطوة رئيسية أخرى. وقد ثبت أن طبقة الدهون عالية الكثافة في الجزء السفلي، وبعد الطرد المركزي، غنية في برنامجي مكثف ولكن لديه أقل النفط، في حين طبقة الدهون منخفضة الكثافة الأعلى المزيد من النفط ولكن أقل ECM الألياف16،17. وهكذا، ينبغي معالجة هذه الطبقات اثنين بطريقتين مختلفتين. يمكن أن يخضع الدهون منخفضة الكثافة مباشرة تجهيز إينتيرسيرينجي لتدمير في adipocytes. ومع ذلك، يتطلب الدهون عالية الكثافة في الطبقة السفلي كميات إضافية من النفط لتسهيل تدمير adipocytes. النفط وأضاف يمكن إنقاص كثافة الدهون عالية الكثافة، مما يجعل تحويل أسهل بكثير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد النفط استخراج النفط أكثر من adipocytes مكسورة؛ ومع ذلك، يتعذر على سائل مائي. وهكذا، أضفنا النفط الإضافية للدهون عالية الكثافة. الطرد المركزي بعد إينتيرسيرينجي التحول فصل النفط جزء من الخلايا صندوق التبرعات الخاص وإدارة المحتوى في المؤسسة. وينبغي تجنب النفط في المنتج النهائي.

زرع ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل أسفر عن معدل استبقاء كبيرة. وكما ذكرنا أعلاه، أن الخطوة الرئيسية لتجهيز ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل هو إينتيرسيرينجي التحول، الذي يدمر معظم adipocytes. وهكذا، ظل adipocytes قليلاً في ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام. منطقة بيريليبين-إيجابية صغيرة كما هو مبين في الشكل 2، ظهرت في زرع ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل في اليوم 3. ومع ذلك، بعد 15 يوما، الكثير من adipocytes بيريليبين-إيجابية ظهرت وأصبحت ناضجة بعد 90 يوما. وقد أظهرت دراسة سابقة أن زرع ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل الناجمين عن المضيف بوساطة خلايا الأنسجة الدهنية التجديد14. استخدام مستضد الكريات البيض البشرية المضادة لتحديد منشأ adipocytes شكلت حديثا، اكتشفنا أنه، على الرغم من أن معظم الخلايا في صندوق التبرعات الخاص المستمدة من الفساد، كان معظم الأنسجة الدهنية المكونة حديثا المستمدة من المضيف. وقد ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل دالة التجدد كبيرة، كما ذكرت سابقا. هذا المنتج قد آثار علاجية كبيرة في الجرح شفاء12. وعلاوة على ذلك، ساعد على تحسين معدل البقاء على قيد الحياة من رفرف مجاناً في طراز ماوس بالتعجيل بالأوعية10.

جل صندوق التبرعات الخاص حقن ذاتي الذي يحتوي على المحتوى الأصلي والمكونات الخلوية الوظيفية. يتم إنشاء المنتج من ليبواسبيراتي بعملية ميكانيكية بسيطة، التي يمكن تنفيذها بسهولة دون أي شواغل فيما يتعلق بالمسائل التنظيمية. ومع ذلك، أثر التجدد ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل ما زال غير واضح. لأفضل وصف الآثار المفيدة لإدارة المحتوى في المؤسسة/صندوق التبرعات الخاص-جل، هناك المزيد من التحقيقات لتوصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التجدد أثر ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل في الطريق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيده عمل هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعة من الصين (81471881, 81601702, 81671931)، ومؤسسة العلوم الطبيعية مقاطعة قوانغدونغ الصينية (2014A030310155)، و "مؤسسة مسؤول من مستشفى نانفانغ" (2014B009، 2015Z002، 2016Z010، 2016B001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 Molecular Probes I21411
guinea pig anti-mouse perilipin Progen GP29
DAPI Thermofisher D1306
wide tip pipet Celltreat 229211B
Confocal microscope  Leica  TCS SP2
nude nice  Southern Mdical University /
light microscope  Olympus /
50 mL tube Cornig 430828
sterile bag Laishi /
microtome Leica  CM1900
centrifuge Heraus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

Tags

عملية ميكانيكية، الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية، ليبواسبيراتيس، الدهون التطعيم، العلاج بالخلايا الجذعية، كسر الأوعية الدموية stromal هلام، الطب، 145 قضية
الميكانيكية ميكرونيزيشن من ليبواسبيراتيس للعلاج بالتجدد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F.,… More

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F., Cai, J. Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (145), e58765, doi:10.3791/58765 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter