Summary
Vi præsenterer en fluorogenic peptid kavalergang assay, der giver mulighed for en hurtig screening af proteaser proteolytiske aktivitet på peptider der repræsenterer webstedet spaltning af viral fusion peptider. Denne metode kan også bruges på andre aminosyre motiv i en protein sekvens til at teste for protease aktivitet.
Abstract
Kappebærende virus som coronavirus eller influenza virus kræver proteolytiske kløvningen af deres fusion protein til at være i stand til at inficere cellen vært. Viruser udstille celle og væv tropisme og er tilpasset til bestemte celler eller væv proteaser. Disse vira kan desuden indføre mutationer eller indrykninger i deres genom under replikering, der kan påvirke kavalergang, og dermed kan bidrage til tilpasninger til en ny vært. Vi præsenterer her, et fluorogenic peptid kavalergang assay, der giver mulighed for en hurtig screening af peptider efterligne webstedet spaltning af viral fusion proteiner. Teknikken er meget fleksibel og kan bruges til at undersøge de proteolytiske aktivitet af en enkelt protease på mange forskellige underlag, og derudover giver det også udforskning af aktiviteten af flere proteaser på én eller flere peptid substrater. I denne undersøgelse brugte vi peptider efterligne kavalergang site motiver af coronavirus spike protein. Vi har testet menneskelige og camel afledt Mellemøsten luftvejssyndrom coronavirus (MERS-CoV) påvise, enkelt og dobbelt udskiftninger på webstedet til spaltning kan ændre aktiviteten af furin og dramatisk ændre kavalergang effektivitet. Vi brugte også denne metode i kombination med Bioinformatik at teste furin kavalergang aktivitet af feline coronavirus spike proteiner fra forskellige serotyper og stammer. Dette peptid-baseret metode er mindre arbejdskraft- og tiden intensivt end konventionelle metoder til analyse af proteolytiske aktivitet for vira, og resultater kan opnås inden for en enkelt dag.
Introduction
Viral fusion med værten cellemembranen er et afgørende skridt i livscyklus af kappebærende virus og letter indtastning ind i cellen og replikering af virus. Typisk besidder virus en specialiseret protein (eller proteiner), der binder sig til receptorer på cellemembranen vært og udløser virus-celle membran fusion1. Viral fusion proteiner har været inddelt i tre vigtigste klasser (I-III)1. En række af vira, der er i øjeblikket et stort problem for folkesundheden, såsom influenzavirus (der repræsenterer en mangeårig zoonotiske fremkomst fra fugle) og Mellemøsten respiratorisk syndrom-coronavirus (MERS-CoV) (der repræsenterer en nylig zoonotiske udmeldelse af kameler), udnytte den såkaldte klasse i fusion proteiner, som kræver proteolytiske behandling af vært proteaser, at udøve deres fusogenic aktivitet2. På samme måde, feline coronavirus (FCoV), som repræsenterer en større sygdomme trussel for vilde og indenlandske katte, også besidder en klasse jeg fusion protein. Klasse I viral fusion proteiner er typisk syntetiseres som en uncleaved forløber, og består som regel af to domæner, der er ansvarlige for receptor binding og udløser hændelsen fusion henholdsvis. Til dato, er influenza hemagglutinin (HA) bedst forstået fusion protein og talrige undersøgelser har beskrevet sit mekanistiske rolle i vært celle løsning og fusion3. I dette tilfælde opstår kavalergang fusion protein på en bestemt sekvens eller kavalergang websted inden for HA, og i kombination med pH-afhængige konformationelle ændringer, resulterer i eksponeringen af viral fusion peptid1,2.
Fusion peptid og dens foregående protease anerkendelse sekvens er kritisk for patogenicitet og vært tilpasning af virus. Ændringer i protease anerkendelse sekvens kan ændre kavalergang betydeligt med potentielt dramatiske konsekvenser for virus og vært4. På den ene side kan ophæve kavalergang og dermed fjerne virus livscyklus. Men på den anden side en mutation kan øge substrat specificitet for en given protease og/eller give mulighed for en "ny" protease at kløve fusion protein. Efterfølgende, kan dette også udvide den celle og væv tropisme som observeret, fx med influenza-virus subtype5,6. Lav normalt sygdomsfremkaldende evne aviær influenza (LPAI) virus og mest humane influenzavirus er begrænset til mave-tarm- eller luftvejsinfektioner tarmkanalen på grund af den begrænsede lokalisering af proteaser, der aktiverer dem. Typisk, fusion peptid af sådanne HA proteiner er efterfulgt af en fire-amino syre sekvens, der består af 1-2 ikke-fortløbende grundlæggende aminosyrer, som er anerkendt af trypsin-lignende Serin proteaser som trypsin, matriptase eller TMPRSS27, 8. Når virussen erhverver indrykninger eller mutationer, der ændrer kavalergang websted til en flerbasiske websted, det tillader furin at aktivere HA og potentielt forårsage en langt mere alvorlig systemisk infektion6,9. Disse vira er benævnt høj sygdomsfremkaldende evne aviær influenzavirus (HPAI), karakteriseret ved H5N1 stammer.
I modsætning til influenza HA har mange coronavirus, såsom MERS-CoV, to særskilte kavalergang websteder inden for deres spike protein. Webstedet S1/S2 adskiller den N-terminale receptor bindende domæne (S1) fra C-terminal fusion domæne (S2), med en anden kavalergang site, kaldet S2', neden for webstedet S1/S2 i nærhed til fusion peptid10. Det blev foreslået, at steder er kløvet sekventielt, på S1/S2 efterfulgt af S2'. I modsætning til de fleste influenza-virusstammer, MERS-CoV S protein S1/S2 og S2 HA' websteder kan blive genkendt af proteaser af familien proprotein convertase (PC), som furin. Medlemmer af denne familie kløver på parret grundlæggende rester med motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Generelt, aminosyrer opstrøms af webstedet kavalergang omtales som P1, P2 og P3. optælling fra webstedet kavalergang og aminosyrer nedstrøms er udpeget som P1', P2', P3', osv. 11. FCoV stammer kan enten have en enkelt eller dobbelt kavalergang-websted. Ligesom MERS-CoV, nogle FCoV stammer også besidder to kavalergang websteder (S1/S2 og S2') i deres S protein. Men denne egenskab er serotype jeg FCoVs (clade A). Derimod medlemmer af serotype II (clade B) gruppering kun har en enkelt kavalergang websted (S2')2,12. Flere proteaser er blevet foreslået for at kløve FCoV kavalergang websteder, herunder furin, trypsin-lignende proteaser og cathepsin. Det er blevet foreslået, at S-protein på enteriske FCoV (også kendt som felin enterisk coronavirus eller FECV) er tilbøjelige til at være kløvet af furin på webstedet til S1/S2 og mutationer i dette websted (såvel som på S2') fører til ændringer i protease krav. Disse mutationer har været forbundet med ændringer i tropisme og sygdomsfremkaldende egenskaber af disse vira, så virus bliver systemisk og makrofag-tropic (også kendt som felin infektiøs peritonitis virus eller FIPV)13.
Virus naturligvis indføre mutationer i deres genomer under hver replikering cyklus og ofte nye undertyper og stammer af influenza, MERS-CoV og FCoV er beskrevet14,15,16. Som en del af en hurtig evaluering for at vurdere trussel mod folkesundheden af nye virus, er det kritisk at undersøge ændringer i webstedet kavalergang og hvordan det påvirker vifte af proteaser aktivering disse vira. Her, vi beskriver et peptid-baseret analyse, der giver mulighed for en meget hurtig vurdering af, hvordan kavalergang site ændringer i MERS-CoV S protein påvirke substrat specificitet af en given protease og hurtigt skærm forskellige proteaser for deres evne til at kløve en given eller flere sekvenser4. I et andet sæt af forsøg brugte vi teknikken til at bestemme furin kavalergang aktivitet over forskellige FCoV serotyper og stammer.
Peptider bruges i denne analyse er ændret med fluorescens resonans energi overførsel (FRET) par, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus. Under analysen, MCA er ophidset og udsender lys energi, som er slukket af DNP, som parret er i tæt nærhed til hinanden. Hvis spaltning opstår, men DNP er ikke i stand til at slukke emission længere og den kan læses af fluorescens-Pladelæser. Ændringer i Fluorescens er målt under forsøget at bestemme peptid kavalergang sats, og til at beregne den hastighed, hvormed protease kløver specifikke peptid (også kendt som Vmax)17.
For at udforme peptider, gen respektive fusion protein skal har blevet sekventeret og/eller stilles til rådighed i en database. Metoden er imidlertid mindre arbejdskraft-intens og dyre end konventionelle metoder, der normalt kræver kloning af fusion protein genet til udtryk vektorer til at udtrykke det i pattedyrceller til at analysere kavalergang. Fra start til slut, kan dette tage flere dage op til et par uger, mens peptid assays præsenteres her kan ske inden for en dag så snart peptider og proteaser er tilgængelige. Opsætning af analysen tager mellem 5 og 30 min afhængig af antallet af prøver og runtime i pladelæseren Fluorescens er 1 h. analyse af dataene, der kan tage op til 2 h igen afhængigt af prøvestørrelse.
Her, vi har valgt to forskellige eksempler præsentere analysen. I det første eksempel præsenterer vi data, der sammenligner en furin-medieret kløvningen af menneskelige og camel-afledte MERS-CoV, til at vurdere de kamel-afledte stammer af bliver aktiveret i mennesker, hvis de krydser artsbarrieren. I det andet eksempel, vi anvendte et fluorogenic peptid assay til at bestemme furin-medieret kløvningen af S1/S2 og S2' websteder eller S2' site af to serotype jeg og to serotype II FCoV stammer, henholdsvis. For disse eksperimenter brugte vi trypsin kavalergang som positiv kontrol.
Protocol
1. design og forberede peptider
- Erhverve sekvensen af fusion protein af interesse fra en offentlig database som NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller virus patogen database (https://www.viprbrc.org). Vælg webstedet protease anerkendelse forud fusion peptid og omfatter 2-3 aminosyrer opstrøms og nedstrøms for denne sekvens.
- Når du bestiller peptider, ændre dem med FRET par 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) på N-terminus og N-2,4-dinitrophenyl (DNP) på C-terminus.
Bemærk: Flere leverandører giver disse ændringer. Pris og leveringstid afhænger af leverandøren af valg. Dog findes alternative ændringer som varierer i følsomhed og justeringer af Pladelæser i form af bølgelængder. - Resuspend peptid ifølge producenter anbefalinger af pipettering forsigtigt op og ned. For eksempel resuspend peptider i 70% ethanol til en endelig koncentration på 1 mM.
- Du kan eventuelt tilføje røret indeholdende peptid og opløsningsmidlet i et sonikering bad, indtil det er fuldt genopslemmes hvis peptid ikke resuspend meget godt af pipettering.
- Alikvot peptid i lys dæmpning eller resistente rør for at beskytte peptid fra blegning. Holde alikvot størrelser lille at undgå flere fryse/tø cykler (f.eks. 100 µL). Butik alikvoter ved-20 ° C.
2. udarbejdelsen af fluorescens-Pladelæser
- Tænd i pladelæseren og vent indtil selvtesten er færdig.
- Åbn den driver software på den tilsluttede computer og sørg for det er forbundet med i pladelæseren.
- Åbn temperaturindstilling og indstillet til 30 ° C (eller den krævede temperatur for optimal ydeevne for protease).
- Klik på kontrol | Instrument Setup til opsætning af eksperimentet.
- Vælg Kinetic.
- Vælg fluorescens.
- Angiv excitations- og bølgelængder: 330 nm og 390 nm henholdsvis.
- Uegennyttig Auto Cut-off.
- Vælg Medium, normal følsomhed.
- Vælg en længde på 1 h for analysen og vælge én måling hver 60 s.
- Sæt 5 s blanding før første måling og 3 s før hver måling
- Vælg wells til læst og begynde analysen.
3. forberedelse analysen
- Forberede analysebuffer ved beregningen af de passende mængder for hver ingrediens og tilføje det. For furin, gøre buffer bestående af 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 5% Triton X-100. Trypsin, bruge standard fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
Bemærk: Diskenheder på 10 mL eller derunder er tilstrækkelig. Bufferen varierer afhængigt af protease(s) anvendes i analysen. - Chill buffer på is.
- Assay-pladen anbringes på is med en tynd metalplade nedenunder at støtte køling og stabilitet. Brug en solid sort polystyren 96-brønd plade med en flad bund og ubehandlede.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge sorte plader til at forhindre fluorescerende "lækage" fra tilstødende brønde. - Beregne den passende mængde af protease at tilføje for hver reaktion baseret på tidligere publikationer eller eksperimentelle data. Furin, bruge 1 enhed pr. reaktion, hvilket svarer til 0,5 µL. Trypsin, anvendes 0,5 µL af 160 nM TPCK trypsin.
- Forbered 3 tekniske replikater pr. assay i en samlet maengde paa 100 µL pr. sample pr. prøve.
Bemærk: Det blev eksperimentelt vurderet at det ikke gør en forskel, om den pipettering udføres under normale lysforhold eller nedtonet lyset. Dog skal peptider ikke udsættes for lys i en længere periode af tid. - Der afpipetteres analysebuffer (94,5 µL som beskrevet under trin 3.1) passende mængde i hver brønd.
- Tilføje protease til hver brønd. For både furin og TPCK trypsin, bruge 0,5 µL pr. prøve. 6 wells (3 brønde for et tomt kontrolelement) og 3 brønde for et peptid kontrol, tilføje 0,5 µL buffer i stedet for de respektive protease.
- Tilføje peptid til en slutkoncentration på 50 µM til hver brønd undtagen blindprøvekontrollen. I dette tilfælde afpipetteres 5 µL peptid forberedt som beskrevet under trin 1.3. Tilføj 5 µL af buffer til kontrolelementet Tom i stedet for peptid.
Bemærk: Flere koncentrationer af peptid blev i første omgang testet med den beskrevne enzym koncentration skal sikre, at enzymer var mættet. - Sæt pladen i pladelæseren fluorescens og klik på start.
4. dataanalyse
- Gem filen eksperiment.
- Klik på Eksporter og eksportere filen som en .txt.
- Importere .txt-filen i et regneark.
- For hver teknisk replikat pr. prøve, skal du oprette en graf plotte de relative fluorescerende enheder (RFU) på y-aksen mod tiden på x-aksen (supplerende figur 1).
- Vælg det dataområde, hvor grafen er i en lineære område og tættest på starten af fluorescens stigning.
- Afbilde de valgte data på en anden figur og tilføje en lineær tendenslinje.
- Vælg i de tendenslinje Vis ligning på diagrammet. Ligningen vil vise Vmax.
- Beregne gennemsnittet Vmax for hver prøve fra 3 tekniske replikater.
- Gentage forsøget to gange mere for at få 3 biologiske replikater.
- Beregn standardafvigelsen baseret på data fra 3 uafhængige biologiske replikater.
Representative Results
I den første del af denne undersøgelse, brugte vi peptider, der repræsenterer S2' kavalergang site af tre særskilte MERS-CoV S proteiner: fra den prototypiske EMC/2012 menneskelige stamme (Genbank AFS88936.1) og to valgt kamel-afledt MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) og Mor215 (Genbank AVN89324.1) stammer, isoleret i Egypten og Marokko, henholdsvis (tabel 1)16,18.
I forhold til EMC/2012 stamme, HKU205 S2' kavalergang websted har to mutationer i P2 og P1' holdninger, der potentielt kan påvirke sin anerkendelse af furin og ændre kavalergang effektivitet (tabel 1). Desuden vi var interesseret i at undersøge, om og hvordan hver enkelt mutation findes i HKU205 stammen påvirker furin kavalergang. Vi, derfor inkluderet to peptider, hvor de individuelle erstatninger blev indført i EMC/2012 peptid sekvens (EMC/2012 mutA-S S2' og EMC/2012 mutS-jeg S2') (tabel 1). Furin var i stand til at kløve EMC/2012 peptid effektivt med en Vmax på 6,3 ± 1,2 RFU/min, mens vi opdaget næsten ingen kavalergang, når du bruger S2' peptid af HKU205 stamme (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (figur 1a). Når undersøger EMC/2012 mutA-S S2' peptid, vi fandt, at kløvningen blev stærkt reduceret i forhold til den vilde skrive sekvens (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). Der var næsten ingen kavalergang, når du tester EMC/2012 mutS-jeg S2' peptid (Vmax 1.1 ± 0,9 RFU/min) (figur 1a).
For nylig, MERS-CoV isolater fra Vestafrika blev rapporteret at Fylogenetisk adskiller sig fra MERS-CoV findes i den arabiske halvø16. En af de seneste beskrevet isolater er den Mor213 stamme, som bærer en leucin i stedet for en arginin i positionen P4 af S2' websted (tabel 1), og som kunne potentielt påvirke sin anerkendelse af furin og ændre kavalergang effektivitet. Vores peptid-Analysen viste, at der kun er minimal spaltning af Mor213 S2' websted i forhold til EMC/2012 websted (figur 1b). Vmax for Mor213 peptid er 1,0 ± 0,1.
For den anden del af denne undersøgelse brugte vi den samme peptid-analysen for at evaluere furin-medieret kløvningen af FCoV S protein kavalergang websteder. Vi brugte peptider efterligne S1/S2 kavalergang site af to FCoV serotype jeg vira: FECV I og-4 (fra Whittaker lab) og FIPV jeg sort (Genbank AB088223.1). Vi brugte også peptider efterligne S2' site af disse vira, samt to FCoV serotype II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) og FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) stammer (tabel 1). Furin spaltning opstår typisk, når grundlæggende restkoncentrationer (arginin og lysin) er til stede i P1 og P4 positioner af webstedet kavalergang. Mutationer i P1, P4 og P1' holdninger er foreslået til at blande sig med furin cleavability, derfor ændre kravene protease af proteinet. (Tabel 1). Furin spaltning blev observeret for den prototypiske S1/S2 peptid FECV jeg og-4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min), men ikke i den muterede S1/S2 peptid FIPV jeg sort S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/min) (figur 2A). Ligeledes, furin var i stand til at kløve den prototypiske S2' peptid FECV II 1683 S2' (Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), men ikke de muterede S2' peptider FECV jeg og-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV jeg sort S2' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) og FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / min) (figur 2B). Vi brugte trypsin som positiv kontrol for peptid kavalergang og vi observerede trypsin kavalergang i alle peptider anvendes (supplerende figur 2).
Tabel 1. Peptider anvendte og tilsvarende aminosyresekvenser. Peptider bruges i assays indeholder (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl/2,4-dinitrophenyl (MCA/DNP) FRET par. P4 og P1 kavalergang site placeret arginin (R) restkoncentrationer, som er anerkendt af furin, er i fed skrift. Restkoncentrationer i rød svarer til mutationer i forhold til reference sekvenser.
Figur 1 . Furin-medieret proteolytiske kløvningen af menneskelige og camel-afledte MERS-CoV S2' sites fluorogenic peptider. A. Furin kavalergang analysen af menneskelige MERS-CoV EMC/2012 S2' websted og camel-afledte stamme HKU205 (dobbelt mutant), sammen med enkelt mutant varianter af EMC/2012 (mutA-S og mutS-jeg). B. Furin kavalergang analysen af menneskelige MERS-CoV EMC/2012 S2' websted og camel-afledte stamme Mor213. For paneler A og B, peptider blev inkuberet med rekombinante furin og stigningen i fluorescens på grund af proteolytiske forarbejdning blev målt ved hjælp af en fluorometer. Assays blev udført i tre med resultater der repræsenterer gennemsnittet af Vmax fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Fejllinjer angive SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Furin-medieret proteolytiske kavalergang FCoV S1/S2 og S2' sites fluorogenic peptider. A. Furin kavalergang analysen af FECV I og-4 og FIPV jeg sort S1/S2 websteder. Peptider blev inkuberet med rekombinante furin. B. Furin kavalergang analyse af FECV I og-4, FIPV jeg sort, FECV II 1683 og FIPV II 1146 S2' sites. Stigningen i fluorescens på grund af proteolytiske forarbejdning blev målt ved hjælp af en fluorometer. Assays blev udført i tre med resultater der repræsenterer gennemsnittet af Vmax fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Fejllinjer angive SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: Vmax værdier anvendes til figur 1 og figur 2. Vmax værdier blev beregnet fra grafer som illustreret i supplerende figur 1 og som beskrevet i protokollen afsnit 4. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fig. 1: Illustration af rå data stammer fra plade-læsningssoftwaren. Forøgelse af fluorescens over tid grafer, der blev anvendt til bestemmelse af Vmax. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 2: Trypsin-medieret proteolytiske kavalergang FCoV S1/S2 og S2' sites fluorogenic peptider. Trypsin kavalergang analyse af FECV I og-4 og FIPV sort S1/S2 websteder og FECV I og-4, FIPV jeg sort, FECV II 1683 og FIPV II 1146 S2' sites. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Discussion
Vi præsenterer her et fluorogenic peptid assay, der giver mulighed for en hurtig screening af protein-sekvenser for deres proteolytiske spaltning af proteaser. I vores første eksempel valgte vi forskellige kavalergang site motiver af MERS-CoV spike (S) protein til at illustrere en ansøgning til dette assay. Flere kappeklædte vira, der besidder klasse jeg fusion proteiner som MERS-CoV, SARS-CoV (alvorlig akut luftvejssyndrom) og influenza er store bekymringer for den offentlige sundhed og nye undertyper under konstant udvikling, har et potentiale til at krydse arter barrierer fra deres naturlige værter at mennesker1,15,16. Isolere virus og dyrke dem i laboratoriet kan ikke altid være muligt eller kræver særlige laboratorier, der ikke er tilgængelige i alle forskningsfacilitet. Der er derfor behov for metoder til at vurdere den potentielle trussel mod folkesundheden i emerging vira, der kan udføres under regelmæssig laboratorieforhold. Ud over virus rettet mod mennesker, nogle dyr virus ligesom FCoV også besidder den samme klasse i fusion proteiner, derfor, med lignende egenskaber end deres menneskelige modstykker. Isolere disse vira kan også være en udfordring, at gøre brug af innovative værktøjer til at studere dem nødvendige.
Et afgørende skridt i de ovennævnte virus livscyklus er vært celleindtastning og fusion medieret af proteolytiske behandling af de respektive fusion protein af vært proteaser1,2. En standard måde at undersøge denne del af viral livscyklus er at klone fusion protein gen i et pattedyr udtryk vektor, transfect pattedyrceller, der giver mulighed for protein udtryk, inkuberes eller co transfect med protease af interesse, isoleres de protein og udføre en western blot analyse. Denne metode kommer med flere begrænsninger: tilgængeligheden af viralt DNA/RNA for kloning, omkostninger til syntese af genet, hvis ingen DNA eller RNA er tilgængelig, tilgængelighed af et antistof til påvisning fusion protein og dens kavalergang produkt(er), og det kan tage til flere uger indtil hele undersøgelsen er udført. Det bliver endnu mere tidskrævende, penge og arbejdsintensive hvis interesse af studiet er at undersøge flere mutationer i webstedet kavalergang, fordi det kræver site-directed mutagenese. Fluorogenic peptid analysen beskriver vi her har ikke disse begrænsninger. Peptider af interesse kan være designet baseret på offentligt tilgængelige sekvenser, der er flere leverandører, der leverer en bred vifte af rekombinant proteaser, der er relevante for disse former for undersøgelser og analysen herunder analyse kan udføres inden for en enkelt dag.
I vores eksempel, undersøgte vi furin-medieret spaltning af S2' protease genkendelsessekvens MERS-CoV S protein afledt af mennesker og kameler fra Egypten og Marokko. Både den menneskelige EMC/2012 og kamelen HKU205 S2' websteder indeholder en typisk RXXR furin kavalergang motiv. Men ifølge PiTou 2.0 kavalergang scoring algoritme HKU205 S2' websted forventes ikke at være kløvet af furin, som vi eksperimentelt bekræftet19. Grunden hvorfor HKU5 S2' behandles ikke af furin muligvis på grund af isoleucin i P1' holdning. Hvor vi testede to peptider, som de enkelte mutationer i EMC/2012 S2' sekvens, vi var i stand til at bekræfte, at isoleucin i P1' stort set ophæver kavalergang, hvorimod alanin Serin substitution resulterede i nedsat kavalergang. Mor213 S2' websted indeholder ikke en furin kavalergang motiv og det var ikke overraskende at opdage næsten ingen kavalergang. Vi undersøgte også, hvordan furin kløver S1/S2 og S2' protease genkendelsessekvenser FCoV S protein. Vi var i stand til at overholde furin spaltning af begge FECV peptider (FECV I og-4 S1/S2 og FECV II 1683 S2'), mens muterede sekvenser fra FIPV virus ikke var kløvet af furin.
Når man sammenligner furin-medieret kløvningen af EMC/2012 S2' peptid (figur 1A) med FECV I og-4 S1/2 peptider (figur 2A), vi fandt, at der var en omtrentlig 26-fold forskel i Vmax. Dette kan forklares ved furin kavalergang motiv i begge sekvenser (tabel 1). Mens minimumskravet til furin kavalergang er et RXXR motiv, er en RXRR sekvens langt mere favorable2. Derfor, EMC/2012 S2' peptid, som har en RSAR motiv, er kløvet med mindre specificitet i forhold til FECV I og-4 S1/2 peptid, der indeholder en RSRR furin kavalergang websted (tabel 1).
En stor begrænsning af analysen er imidlertid peptider ikke afspejler den tertiære struktur af det protein, de er som regel indlejret i. Spaltning af fuld længde fusion protein udsætter fusion peptid og udløser vært celle løsning1. Samspillet mellem protease og fusion protein er også påvirket af den tertiære struktur af fusion protein, mens vi går ud fra at peptider er mere eller mindre lineære. Dermed kavalergang opdaget i peptid-analysen kan være kunstig og kan ikke afspejle i vivo situation. Dette blev rapporteret til spaltning af influenza H3N2 HA undertype af matriptase. Mens flere grupper beskrevet spaltning af den H3N2 HA af matriptase i peptid assays, blev det også vist, at inkubering af fuld længde H3N2 HA protein og matriptase i cellekultur ikke resulterede i en fusogenic HA protein4,20, 21. Der er andre eksempler, der viser, at biologisk vigtige regulering af proteolytiske kløvningen er på niveauet af protein kropsbygning. Det er blevet beskrevet, at fusion proteiner undertiden har brug for en række pre fusion begivenheder at udsætte kavalergang websteder ved fusion. Semliki skov virus fusion protein, for eksempel kræver strukturelle rearrangementer under en række af prefusion arrangementer for at udsætte sin fusion protein og gøre den tilgængelig for proteolytisk aktivering22. Resultaterne fra et fluorogenic peptid assay skal derfor være valideret celle fusion assays eller lignende eksperimenter. Men peptid-analysen stadig tillader en hurtig screening af flere protease/peptid kombinationer og reducere arbejdskraft og tid af opfølgning eksperimenter da kombinationer, der ikke viser kavalergang er meget tilbøjelige til at udstille den samme resultat i vivo.
Den anden store begrænsning af analysen vedrører proteaser. Hidtil er det kun muligt at teste opløselige proteaser men ikke transmembrane proteaser. Afhængigt af formålet med forsøget, kan dette være et problem. For eksempel, aktiveres influenza har ved en række transmembrane proteaser placeret i cellemembraner8. Til en vis grad, dette problem kan omgås ved hjælp af de opløselige proteolytiske aktive domæner, men resultaterne skal fortolkes med forsigtighed og skal valideres med konventionelle metoder. Vi vil henvise til det ovennaevnte eksempel med matriptase og sin aktivitet mod H3N2 HA. In vivo matriptase ligger i cellemembranen men de kommercielt tilgængelige enzym er den opløselige katalytiske domæne. Som drøftet med hensyn til fusion proteiner, kan det være muligt, at det også kræver det fuld længde protease at interagere med fuld længde protein substrat at opnå kavalergang og at teste kun enkelt domæner kan resultere i falske positiver.
Denne metode har vist sig for at være effektiv til at studere kløvningen af specifikke aminosyre-sekvenser ved furin. Imidlertid programmer af teknik udvidelser til enhver tilgængelig protease (f.eks., cathepsins, proprotein convertase), hvilket gør det en nyttig metode til skærmen peptid kandidater til protease kavalergang. Desuden, det har vist sig at denne analyse kan også bruges til at teste effekten for proteasehæmmere og derfor giver en hurtig og nem at værktøj til skærmen protein hæmmere23.
Fluorogenic peptid kavalergang analysen beskrives her repræsenterer en tilføjelse til bioinformatic kavalergang scoring algoritmer, som forudsiger peptid spaltning af en beslutsom protease, baseret på aminosyre egenskaber og sekvens. Disse to teknikker, i kombination med tradition western blotting teknikker kan bruges som en effektiv metode til at studere protease kavalergang in vitro.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskningsmidler til MERS projektet præsenteret i dette manuskript blev leveret af NIH give R21 AI111085. Feline coronavirus undersøgelse blev støttet af forskningstilskud fra Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation og Cornell Feline Health Center. Vi vil også gerne takke Malik Peiris for at give os med Mor213 sekvens, før det var offentligt tilgængeligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
References
- Harrison, S. C.
- Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
- Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
- Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827 (2017).
- Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
- Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
- Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
- Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
- Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
- Polgar, L.
- Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
- Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
- Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R.
- Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
- Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
- Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
- Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
- Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
- Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
- Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
- Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
- Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).
