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Biochemistry

Proteolytic गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए एक Fluorogenic पेप्टाइड दरार परख: कोरोनावायरस कील प्रोटीन सक्रियण के लिए आवेदन

Published: January 9, 2019 doi: 10.3791/58892
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 3Virologie et Immunologie Moléculaires, Domaine de Vilvert, INRA, 4Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland
* These authors contributed equally

Summary

हम एक fluorogenic पेप्टाइड दरार परख कि वायरल संलयन पेप्टाइड्स के क्लीवेज साइट का प्रतिनिधित्व पेप्टाइड्स पर proteolytic की गतिविधि की एक तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देता है वर्तमान । इस विधि भी एक प्रोटीन अनुक्रम के भीतर किसी भी अंय एमिनो एसिड मूल भाव पर इस्तेमाल किया जा सकता है को छेड़ने गतिविधि के लिए परीक्षण ।

Abstract

ऐसे coronaviruses या इंफ्लूएंजा वायरस के रूप में ढंक वायरस उनके फ्यूजन प्रोटीन के proteolytic दरार की आवश्यकता को मेजबान सेल संक्रमित कर सकता है । अक्सर वायरस सेल और ऊतक tropism प्रदर्शन और विशिष्ट कोशिका या ऊतक के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । इसके अलावा, इन वायरस उत्परिवर्तनों या अपने जीनोम में पुनरावृत्ति कि दरार को प्रभावित कर सकते है के दौरान सम्मिलन परिचय कर सकते हैं, और इस तरह एक नए मेजबान के लिए अनुकूलन के लिए योगदान कर सकते हैं । यहां, हम एक fluorogenic पेप्टाइड दरार परख कि वायरल संलयन प्रोटीन के क्लीवेज साइट नकल उतार पेप्टाइड्स की एक तेजी से जांच की अनुमति देता है वर्तमान । तकनीक बहुत लचीला है और कई विभिंन सब्सट्रेट्स पर एक एकल छेड़ने की proteolytic गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इसके अलावा, यह भी एक या एक से अधिक पेप्टाइड सब्सट्रेट पर कई की गतिविधियों की खोज की अनुमति देता है । इस अध्ययन में, हम कोरोनावायरस कील प्रोटीन की दरार साइट रूपांकनों नकल उतार पेप्टाइड का इस्तेमाल किया । हम परीक्षण मानव और ऊंट व्युत्पंन मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम coronaviruses (MERS-CoV) का प्रदर्शन करने के लिए है कि एक और दरार साइट में डबल प्रतिस्थापन furin की गतिविधि में परिवर्तन और नाटकीय रूप से दरार दक्षता बदल सकते हैं । हम भी अलग serotypes और उपभेदों से डियर कोरोनावायरस स्पाइक प्रोटीन के furin दरार गतिविधि परीक्षण करने के लिए bioinformatics के साथ संयोजन में इस विधि का इस्तेमाल किया. इस पेप्टाइड-आधारित विधि कम परिश्रम है और समय परंपरागत तरीकों वायरस के लिए proteolytic गतिविधि के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की तुलना में गहन, और परिणाम एक ही दिन के भीतर प्राप्त किया जा सकता है ।

Introduction

मेजबान सेल झिल्ली के साथ वायरल फ्यूजन लिफाफा वायरस के जीवन चक्र में एक महत्वपूर्ण कदम है और कोशिका और वायरस की प्रतिकृति में प्रवेश की सुविधा । आमतौर पर, वायरस एक विशेष प्रोटीन (या प्रोटीन) है कि मेजबान सेल झिल्ली पर रिसेप्टर्स को बांधता है और वायरस कोशिका झिल्ली संलयन1ट्रिगर । वायरल फ्यूजन प्रोटीन तीन मुख्य वर्गों (I-III)1में वर्गीकृत किया गया है । वायरस की एक संख्या है कि वर्तमान में सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय हैं, ऐसे इंफ्लूएंजा वायरस के रूप में (एक लंबी पक्षियों से खड़े पशुजन्य उद्भव का प्रतिनिधित्व) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम-कोरोनावायरस (MERS-CoV) (एक हाल ही में पशुजन्य का प्रतिनिधित्व ऊंट से उद्भव), तथाकथित वर्ग मैं फ्यूजन प्रोटीन है, जो मेजबान के लिए proteolytic प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है का उपयोग करने के लिए, उनके fusogenic गतिविधि लागू करने के लिए2। इसी तरह, डियर कोरोनावायरस (FCoV), जो जंगली और घरेलू बिल्लियों के लिए एक प्रमुख बीमारी खतरे का प्रतिनिधित्व करता है, यह भी एक वर्ग मैं फ्यूजन प्रोटीन के अधिकारी । वर्ग मैं वायरल फ्यूजन प्रोटीन आमतौर पर एक uncleav अग्रदूत के रूप में संश्लेषित कर रहे हैं, और आमतौर पर दो डोमेन है कि रिसेप्टर बाइंडिंग के लिए जिंमेदार है और फ्यूजन घटना क्रमशः ट्रिगर से मिलकर बनता है । तारीख करने के लिए, इंफ्लूएंजा hemagglutinin (हा) सबसे अच्छा समझा फ्यूजन प्रोटीन और कई अध्ययनों से मेजबान सेल प्रविष्टि और3संलयन में अपनी यंत्रवत भूमिका का वर्णन किया है । इस मामले में फ्यूजन प्रोटीन की दरार हा के भीतर एक विशिष्ट अनुक्रम या दरार साइट पर होता है, और पीएच के साथ संयोजन में निर्भर संरचना परिवर्तन, वायरल संलयन पेप्टाइड1,2के जोखिम में परिणाम.

फ्यूजन पेप्टाइड और अपने पूर्ववर्ती पहचान अनुक्रम pathogenicity और वायरस के मेजबान अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं । में परिवर्तन को छेड़ो मांयता अनुक्रम वायरस और मेजबान4के लिए संभावित नाटकीय परिणाम के साथ काफी दरार बदल सकते हैं । एक तरफ तो यह क्लीवेज को निराकृत कर सकता है और इस तरह वायरस के जीवन चक्र को खत्म कर देता है । लेकिन दूसरी ओर, एक उत्परिवर्तन दिया चिढ़ाने के लिए और/या एक "नया" को फ्यूजन प्रोटीन सट करने की अनुमति के लिए सब्सट्रेट विशिष्टता बढ़ा सकते हैं । बाद में, यह भी सेल और ऊतक tropism के रूप में मनाया, उदाहरण के लिए, इंफ्लूएंजा वायरस उपप्रकार5,6के साथ विस्तार कर सकते हैं । आमतौर पर कम pathogenicity एवियन इंफ्लूएंजा (LPAI) वायरस और सबसे मानव इंफ्लूएंजा वायरस है कि उंहें सक्रिय करने की वजह से सीमित स्थानीयकरण की वजह से जठरांत्र या श्वसन तंत्र तक सीमित हैं । आमतौर पर, इस तरह के हा प्रोटीन का फ्यूजन पेप्टाइड एक चार एमिनो एसिड अनुक्रम है कि 1-2 गैर लगातार बुनियादी अमीनो एसिड, जो trypsin द्वारा मांयता प्राप्त है के होते है से पहले है-जैसे serine trypsin, matriptase या TMPRSS27की तरह, 8. जब वायरस आवेषण या उत्परिवर्तनों है कि एक polybasic साइट के लिए दरार साइट बदल प्राप्त है, यह furin को सक्रिय करने की अनुमति देता है और संभावित एक बहुत अधिक गंभीर प्रणालीगत संक्रमण6,9कारण । इन वायरस के रूप में उच्च pathogenicity एवियन इंफ्लूएंजा वायरस (HPAI), typified H5N1 उपभेदों द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं ।

इंफ्लूएंजा हा के विपरीत, ऐसे MERS के रूप में कई coronaviruses, CoV, उनके कील प्रोटीन के भीतर दो अलग दरार साइटों है । s/s2 साइट सी-टर्मिनल फ्यूजन डोमेन (s2) से एन टर्मिनल रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन (एस 8) अलग, एक दूसरे दरार साइट के साथ, S2 कहा जाता है ', एस सी/s2 साइट के बहाव, निकटता में फ्यूजन पेप्टाइड10। यह सुझाव दिया गया था कि साइटों क्रमिक रूप से सट रहे हैं, पर एस-s2/ सबसे इंफ्लूएंजा वायरस उपभेदों के हा करने के लिए इसके विपरीत, MERS-CoV S/s2 और s2 ' साइटों प्रोटीन convertase (पीसी) इस तरह के furin के रूप में परिवार, की teases द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है । इस परिवार के सदस्य आकृति आर/k-(x)0, 2, 4, 6-r/k (x, किसी भी एमिनो एसिड)2के साथ युग्मित मूल अवशेषों पर सट । आम तौर पर, क्लीवेज साइट के ऊपर अमीनो एसिड P1, P2, पी इ पी, आदिके रूप में भेजा जाता है । दरार साइट और अमीनो एसिड बहाव से गिनती ' P1, P2 ', पी ' पी, आदिके रूप में नामित कर रहे है 11. FCoV उपभेदों या तो एक एकल या एक दोहरी दरार साइट हो सकता है । MERS की तरह-CoV, कुछ FCoV उपभेदों भी उनके एस प्रोटीन में दो दरार साइटों (s/s2 और s2 ') के अधिकारी । हालांकि, इस विशेषता सीरोटाइप मैं FCoVs (पहने एक) के अनंय है । इसके विपरीत, सीरोटाइप द्वितीय के सदस्यों (पहने ख) समूह केवल एक ही दरार साइट (S2 ')2,12है । FCoV क्लीवेज साइट्स को सट करने के लिए कई टीज़्स सुझाए गए हैं, जिनमें furin, trypsin जैसे टीज़ और cathepsin हैं. यह प्रस्ताव किया गया है कि प्रवेश FCoV के एस प्रोटीन (भी बिल्ली के समान दर्जी कोरोनावायरस या FECV के रूप में जाना जाता है) को s/और इस साइट में उत्परिवर्तनों (के रूप में अच्छी तरह से के रूप में S2 ') को छेड़ने की आवश्यकताओं में परिवर्तन की ओर जाता है । इन उत्परिवर्तनों tropism और इन वायरस के pathogenicity में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है, वायरस प्रणालीगत और मैक्रोफेज-रेखा बनने के लिए अनुमति (भी बिल्ली के समान संक्रामक पेरिटोनिटिस वायरस या FIPV के रूप में जाना)13.

वायरस स्वाभाविक रूप से प्रत्येक प्रतिकृति चक्र के दौरान अपने जीनोम में उत्परिवर्तनों परिचय और अक्सर नए उपप्रकार और इंफ्लूएंजा के उपभेदों, MERS-CoV और FCoV14,15,16वर्णित हैं । उभरते वायरस के सार्वजनिक स्वास्थ्य के खतरे का आकलन करने के लिए एक तेजी से मूल्यांकन के एक भाग के रूप में, यह दरार साइट में परिवर्तन की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और कैसे यह इन वायरस को सक्रिय करने की सीमा को प्रभावित करता है । यहां, हम एक पेप्टाइड का वर्णन-परख है कि कैसे MERS में दरार साइट परिवर्तन-CoV एस प्रोटीन की एक बहुत जल्दी आकलन की अनुमति देता है एक दिया चिढ़ाने के सब्सट्रेट विशिष्टता को प्रभावित करने के लिए और तेजी से अपनी क्षमता के लिए विभिंन teases स्क्रीन को एक दिया या सट एकाधिक अनुक्रम4. प्रयोगों के एक दूसरे सेट में, हम अलग FCoV serotypes और उपभेदों पर furin दरार गतिविधि निर्धारित करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया.

इस परख में प्रयुक्त पेप्टाइड्स प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) जोड़ी के साथ संशोधित कर रहे हैं, 7-methoxycoumarin-4-yl एसिटाइल (एमसीए) में एन-टर्मिनस और एन-2, 4-dinitrophenyl (DNP) पर सी-टर्मिनस । परख के दौरान, एमसीए उत्साहित है और प्रकाश ऊर्जा है कि DNP द्वारा बुझती है के रूप में लंबे समय के रूप में जोड़ी एक दूसरे के पास आसपास के क्षेत्र में है उत्सर्जन करता है । दरार होती है, हालांकि, DNP उत्सर्जन अब बुझाने में सक्षम नहीं है और यह प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर द्वारा पढ़ा जा सकता है । प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पेप्टाइड क्लीवेज दर का निर्धारण करने के लिए प्रयोग के दौरान मापा जाता है, और जिस पर चिढ़ाना विशिष्ट पेप्टाइड (भी जाना जाता Vmax के रूप में जाना जाता है)17की गणना करने के लिए ।

आदेश में पेप्टाइड्स डिजाइन करने के लिए, संबंधित फ्यूजन प्रोटीन का जीन अनुक्रम किया गया होगा और/या एक डेटाबेस में उपलब्ध कराया । हालांकि, विधि कम श्रम है-तीव्र और पारंपरिक तरीकों से महंगा है कि आम तौर पर अभिव्यक्ति वैक्टर में फ्यूजन प्रोटीन जीन की क्लोनिंग की आवश्यकता है यह स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए दरार का विश्लेषण । शुरू से अंत तक, यह कई दिनों के लिए कुछ हफ्तों लग सकते हैं, जबकि यहां प्रस्तुत पेप्टाइड परख एक दिन के भीतर किया जा सकता है जैसे ही पेप्टाइड्स और चिढ़ाने के रूप में उपलब्ध हैं । परख के सेटअप के बीच लेता है 5 और 30 मिनट के आधार पर नमूनों की संख्या और प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में रनटाइम 1 h. data के विश्लेषण के नमूने के आकार के आधार पर फिर से 2 घंटे लग सकते हैं ।

यहां, हम दो अलग उदाहरण चुना परख प्रस्तुत करते हैं । पहले उदाहरण में, हम डेटा है कि मानव और ऊंट व्युत्पंन MERS-CoV के furin-मध्यस्थता दरार की तुलना में मौजूद है, ऊंट की क्षमता का आकलन करने के लिए मानव में सक्रिय किया जा रहा उपभेदों अगर वे प्रजातियों बाधा पार । दूसरे उदाहरण में, हम एक fluorogenic पेप्टाइड परख का उपयोग करने के लिए furin-s/s2 और s2 ' साइटों या दो सीरोटाइप मैं और दो सीरोटाइप द्वितीय FCoV उपभेदों, क्रमशः के ' s2 साइट की मध्यस्थता दरार निर्धारित करते हैं । इन प्रयोगों के लिए, हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में trypsin क्लीवेज का इस्तेमाल किया ।

Protocol

1. डिजाइन और पेप्टाइड्स की तैयारी

  1. ऐसे NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) या वायरस रोगज़नक़ डाटाबेस (https://www.viprbrc.org) के रूप में एक सार्वजनिक डेटाबेस से ब्याज की फ्यूजन प्रोटीन के अनुक्रम मोल । को छेड़ो मांयता संलयन पेप्टाइड के पूर्ववर्ती साइट चुनें और 2-3 अमीनो एसिड ऊपर और इस अनुक्रम के बहाव में शामिल हैं ।
  2. जब पेप्टाइड्स आदेश, उन्हें झल्लाहट जोड़ी के साथ संशोधित करें 7-methoxycoumarin-4-yl एसिटाइल (एमसीए) पर एन टर्मिनस और एन-2, 4-dinitrophenyl (DNP) पर सी-टर्मिनस.
    नोट: कई आपूर्तिकर्ताओं इन संशोधनों प्रदान करते हैं । मूल्य और वितरण समय पसंद के आपूर्तिकर्ता पर निर्भर करते हैं । हालांकि, वैकल्पिक संशोधनों मौजूद है जो संवेदनशीलता में भिंनता है और तरंग दैर्ध्य के संदर्भ में प्लेट रीडर के समायोजन की आवश्यकता होती है ।
  3. धीरे pipetting ऊपर और नीचे से निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार पेप्टाइड resuspend । उदाहरण के लिए, 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए ७०% इथेनॉल में पेप्टाइड्स resuspend ।
  4. वैकल्पिक रूप से, एक sonication स्नान में पेप्टाइड और विलायक युक्त ट्यूब जोड़ने जब तक यह पूरी तरह से resuspend है अगर पेप्टाइड बहुत अच्छी तरह से pipetting द्वारा resuspend नहीं है ।
  5. Aliquot से पेप्टाइड की रक्षा करने के लिए हल्के गीला या प्रतिरोधी ट्यूबों में पेप्टाइड का है । aliquot आकार छोटे रखने के लिए कई फ्रीज/गल चक्र से बचने के लिए (जैसे, १०० µ एल) । स्टोर aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर ।

2. प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर तैयार करना

  1. प्लेट रीडर पर बारी और आत्म परीक्षण समाप्त हो गया है जब तक इंतजार ।
  2. संलग्न कंप्यूटर पर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सुनिश्चित करें कि यह प्लेट रीडर के साथ जुड़ा हुआ है ।
  3. तापमान सेटिंग खोलें और 30 ° c (या छेड़ने के लिए इष्टतम प्रदर्शन के लिए आवश्यक तापमान) के लिए सेट करें ।
  4. नियंत्रण पर क्लिक करें | साधन सेटअप प्रयोग स्थापित करने के लिए ।
  5. काइनेटिक चुनें ।
  6. प्रतिदीप्ति चयन करें ।
  7. उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य दर्ज करें: ३३० एनएम और ३९० एनएम क्रमशः ।
  8. अचयनित ऑटो कट-ऑफ ।
  9. मध्यम, सामांय संवेदनशीलता का चयन करें ।
  10. परख के लिए 1 एच के एक रनटाइम चुनें और एक माप हर ६० एस का चयन करें ।
  11. सेट 5 एस पहले माप और 3 एस प्रत्येक माप से पहले मिश्रण
  12. चुनें कुओं को पढ़ने और परख शुरू करते हैं ।

3. परख की तैयारी

  1. प्रत्येक घटक के लिए उपयुक्त मात्रा की गणना और इसे जोड़ने के द्वारा परख बफर तैयार करते हैं । furin के लिए, १०० mm HEPES, 1 mm CaCl2, 1 mm 2-mercaptoethanol, 5% ट्राइटन X-१०० से मिलकर बफर बनाएं । trypsin के लिए, मानक फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) समाधान का उपयोग करें ।
    नोट: 10 मिलीलीटर या उससे कम के खंड पर्याप्त हैं । पर निर्भर करता है (एस) परख बफर में इस्तेमाल किया बदलता है ।
  2. बर्फ पर बफर ठंडा ।
  3. ठंडा और स्थिरता का समर्थन करने के लिए नीचे एक पतली धातु की थाली के साथ बर्फ पर परख थाली प्लेस । एक सपाट नीचे और गैर इलाज के साथ एक ठोस काले polystyrene ९६-अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें ।
    नोट: यह काले प्लेट का उपयोग करने के लिए आसंन कुओं से फ्लोरोसेंट "रिसाव" को रोकने के लिए आवश्यक है ।
  4. पिछले प्रकाशनों या प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए जोड़ने के लिए की उचित राशि की गणना । furin के लिए, प्रति प्रतिक्रिया 1 इकाई का उपयोग करें जो ०.५ µ के लिए संगत है l trypsin के लिए, १६० एनएम TPCK trypsin के ०.५ µ l का उपयोग करें ।
  5. नमूने प्रति नमूना तैयार 3 १०० µ की कुल मात्रा में परख प्रति तकनीकी प्रतिकृति ।
    नोट: यह प्रयोग किया गया है कि यह एक फर्क नहीं पड़ता कि pipetting सामांय प्रकाश शर्तों या मंद प्रकाश के तहत किए गए है मूल्यांकन । हालांकि, पेप्टाइड्स प्रकाश करने के लिए समय की एक विस्तारित अवधि के लिए उजागर नहीं किया जाना चाहिए ।
  6. परख बफर की उचित मात्रा पिपेट (९४.५ µ एल के रूप में ३.१ कदम के तहत वर्णित) में एक अच्छी तरह से ।
  7. एक अच्छी तरह से करने के लिए चिढ़ाने जोड़ें । दोनों के लिए, furin और TPCK trypsin, प्रति नमूना ०.५ µ l का उपयोग करें । 6 कुओं के लिए (एक खाली नियंत्रण के लिए 3 कुओं और एक पेप्टाइड नियंत्रण के लिए 3 कुओं), जोड़ें ०.५ µ एल के बजाय संबंधित चिढ़ाने के बफर ।
  8. एक अंतिम एकाग्रता के लिए पेप्टाइड जोड़ें ५० µ एम के एक अच्छी तरह से खाली नियंत्रण को छोड़कर । इस स्थिति में, पिपेट 5 µ l पेप्टाइड चरण १.३ के अंतर्गत वर्णित के रूप में तैयार किया गया है । 5 µ l बफ़र के बजाय पेप्टाइड के रिक्त नियंत्रण करने के लिए जोड़ें ।
    नोट: पेप्टाइड के कई सांद्रता शुरू में वर्णित एंजाइम सांद्रता के साथ परीक्षण किया गया सुनिश्चित करने के लिए कि एंजाइमों संतृप्त थे.
  9. प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में प्लेट डालें और स्टार्ट करें पर क्लिक कीजिये.

4. डेटा विश्लेषण

  1. प्रयोग फ़ाइल को सहेजें ।
  2. निर्यात पर क्लिक करें और एक. txt के रूप में फ़ाइल निर्यात ।
  3. txt फ़ाइल को स्प्रेडशीट में आयात करें ।
  4. प्रति नमूना प्रत्येक तकनीकी दोहराने के लिए, एक एक्स-अक्ष पर समय के खिलाफ y-अक्ष पर रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) की साजिश रचने ग्राफ बनाने (पूरक चित्रा 1) ।
  5. डेटा श्रेणी का चयन करें जहां ग्राफ़ एक रेखीय श्रेणी में है और प्रतिदीप्ति वृद्धि के प्रारंभ के निकटतम ।
  6. चयनित डेटा को एक दूसरे ग्राफ़ पर प्लॉट करें और रेखीय ट्रेंडलाइन जोड़ें ।
  7. चार्ट पर ट्रेंडलाइन विकल्प प्रदर्शन समीकरणमें चयन करें । समीकरण Vmax दिखाएगा ।
  8. 3 तकनीकी प्रतिकृति से प्रत्येक नमूने के लिए औसत Vmax परिकलित करें ।
  9. 3 जैविक प्रतिकृतियां प्राप्त करने के लिए प्रयोग को दो बार दोहराएं ।
  10. 3 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति से डेटा के आधार पर मानक विचलन की गणना ।

Representative Results

इस अध्ययन के पहले भाग में, हम पेप्टाइड्स कि तीन विशिष्ट MERS-CoV एस प्रोटीन की S2 ' दरार साइट का प्रतिनिधित्व करते थे: prototypical EMC/2012 मानव तनाव से (Genbank एएफएस 88936.1) और दो चयनित ऊंट से व्युत्पंन MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank ahl 18090.1) और Mor215 (Genbank award 89324.1) उपभेदों, मिस्र और मोरक्को में अलग-थलग क्रमशः (तालिका 1)16,18।

EMC/2012 तनाव की तुलना में, HKU205 ' S2 दरार साइट P2 और P1 ' स्थिति है कि संभवतः furin द्वारा अपनी मांयता को प्रभावित कर सकता है और दरार क्षमता (तालिका 1) में परिवर्तन दो उत्परिवर्तनों है । इसके अलावा, हम अगर और कैसे प्रत्येक व्यक्ति HKU205 तनाव में पाया उत्परिवर्तन furin दरार को प्रभावित करता है की जांच करने के लिए रुचि रखते थे । हम, इसलिए, जहां व्यक्तिगत प्रतिस्थापन emc/2012 पेप्टाइड अनुक्रम में प्रस्तुत किए गए थे दो पेप्टाइड्स शामिल (emc/2012 mutA-S s2 ' और emc/2012 mutS-I s2 ') (तालिका 1) । Furin EMC/2012 पेप्टाइड के एक Vmax के साथ कुशलतापूर्वक सट करने में सक्षम था ६.३ ± १.२ RFU/मिनट, जब हम लगभग कोई दरार का पता चला जब ' s HKU205 तनाव (Vmax ०.५ ± ०.१ RFU/मिनट) (1) (आंकड़ा 1a) के पेप्टाइड का उपयोग कर । जब EMC/2012 mutA-S S2 ' पेप्टाइड की जांच, हमने पाया है कि दरार दृढ़ता से जंगली प्रकार अनुक्रम की तुलना में कम हो गया था (Vmax ३.६ ± 1 RFU/ वहां लगभग कोई दरार जब EMC परीक्षण/2012 mutS-I ' s पेप्टाइड (Vmax १.१ ± ०.९ RFU/मिनट) (आंकड़ा 1a) था ।

हाल ही में, MERS-CoV पश्चिमी अफ्रीका से अलग है कि MERS-CoV अरब प्रायद्वीप में पाया16से phylogenetically अलग है सूचित किया गया । हाल ही में एक अलग वर्णित Mor213 तनाव है, जो ' S2 साइट (तालिका 1) के पी 4 स्थिति में एक arginine के बजाय एक leucine वहन करती है, और जो संभवतः furin द्वारा अपनी मांयता को प्रभावित कर सकता है और दरार क्षमता में परिवर्तन । हमारे पेप्टाइड परख से पता चला है कि वहां केवल Mor213 ' S2 साइट के ंयूनतम दरार के रूप में EMC की तुलना में/ Mor213 पेप्टाइड के लिए Vmax १.० ± ०.१ है ।

इस अध्ययन के दूसरे भाग के लिए, हम FCoV एस प्रोटीन दरार साइटों की furin-मध्यस्थता दरार का मूल्यांकन करने के लिए एक ही पेप्टाइड परख करते थे । हम दो FCoV सीरोटाइप मैं वायरस: FECV मैं और-4 (Whittaker लैब से) और FIPV मैं काला (Genbank ab 088223.1) के एस 1/S2 दरार साइट नकल उतार पेप्टाइड का इस्तेमाल किया । हम भी इन वायरस के S2 ' साइट नकल उतार पेप्टाइड्स का इस्तेमाल किया, साथ ही दो FCoV सीरोटाइप द्वितीय: FECV द्वितीय १६८३ (Genbank afh 58021.1) और FIPV द्वितीय ११४६ (Genbank अाए 32596.1) उपभेदों (तालिका 1) । सामान्यतया, furin क्लीवेज तब होता है जब मूल अवशेषों (arginine और lysine) दरार साइट के P1 और पी 4 पदों में मौजूद हैं । p1, पी 4 और ' p1 पदों में उत्परिवर्तनों furin सट के साथ हस्तक्षेप करने के लिए सुझाव दिया है, इसलिए प्रोटीन की आवश्यकताओं को छेड़ो फेरबदल । (तालिका 1) । Furin दरार prototypical एस 1/s2 पेप्टाइड FECV मैं और-4 s/s2 के लिए मनाया गया था (Vmax १००.३६ ± ७.६१ RFU/) लेकिन नहीं के रूप में रूपांतरित होना एस 1/s2 (FIPV-१.३७ ± १.२९ Vmax/मिनट) (चित्रा 2a) । इसी प्रकार, furin को prototypical s2 ' पेप्टाइड FECV द्वितीय १६८३ s2 ' (Vmax ५.४६ ± ०.९७ RFU/लेकिन नहीं रूपांतरित S2 ' पेप्टाइड्स FECV मैं और-4 s2 ' (Vmax ०.२६ ± ०.११ RFU/मिन), FIPV मैं काले S2 ' (Vmax ०.३० ± ०.१४ RFU/मिनट) और FIPV द्वितीय ११४६ S2 ' (Vmax-०.३६ ± ०.११ RFU लैंडलाइंस) (figure b). हम पेप्टाइड दरार के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में trypsin इस्तेमाल किया और हम सभी उपयोग पेप्टाइड्स में trypsin दरार मनाया (पूरक चित्रा 2).

Table 1

तालिका 1. पेप्टाइड्स का इस्तेमाल किया और इसी अमीनो एसिड अनुक्रम । परख में प्रयुक्त पेप्टाइड्स (7-methoxycoumarin-4-yl) एसिटाइल/2, 4-dinitrophenyl (एमसीए/DNP) झल्लाहट जोड़ी शामिल हैं । पी 4 और P1 दरार साइट तैनात arginine (आर) अवशेषों, जो furin द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है बोल्ड में हैं । लाल रंग में अवशेषों संदर्भ दृश्यों की तुलना में उत्परिवर्तनों के अनुरूप है ।

Figure 1
चित्रा 1 . Furin-मानव और ऊंट की मध्यस्थता proteolytic दरार व्युत्पंन MERS-CoV S2 ' साइटों fluorogenic पेप्टाइड्स । ए मानव MERS की Furin दरार परख-CoV emc/2012 ' S2 साइट और ऊंट व्युत्पंन तनाव HKU205 (डबल उत्परिवर्ती), EMC के एकल उत्परिवर्ती वेरिएंट के साथ-साथ (mutA-एस और mutS-I) । B. मानव MERS की Furin क्लीवेज परख-CoV EMC/2012 S2 ' साइट और ऊंट व्युत्पंन तनाव Mor213 । पैनलों के लिए एक और बी, पेप्टाइड्स रिकॉमबिनेंट furin और proteolytic प्रसंस्करण के कारण प्रतिदीप्ति में वृद्धि के साथ मशीन एक fluorometer का उपयोग कर मापा गया था । परख तीन स्वतंत्र प्रयोग (n = 3) से Vmax के औसत का प्रतिनिधित्व परिणामों के साथ triplicates में प्रदर्शन किया गया । त्रुटि पट्टियां इंगित SD. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . Furin-fluorogenic पेप्टाइड्स के FCoV s/s2 और s2 के proteolytic दरार की मध्यस्थता ' साइटों । ए Furin दरार परख के FECV मैं और-4 और FIPV मैं काले s/ पेप्टाइड्स रिकॉमबिनेंट furin के साथ मशीन थे । B. FECV i और-4, FIPV i ब्लैक, FECV ii १६८३ और FIPV ii ११४६ S2 ' Furin की क्लीवेज परख । proteolytic प्रोसेसिंग के कारण प्रतिदीप्ति में वृद्धि एक fluorometer का उपयोग कर मापा गया था । परख तीन स्वतंत्र प्रयोग (n = 3) से Vmax के औसत का प्रतिनिधित्व परिणामों के साथ triplicates में प्रदर्शन किया गया । त्रुटि पट्टियां इंगित SD. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

पूरक तालिका 1: Vmax मान 1 और आरेख 2के लिए उपयोग किया जाता है । Vmax मान ग्राफ़ से पूरक आरेख 1 में illustrated के रूप में और प्रोटोकॉल खंड 4 में वर्णित के रूप में परिकलित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: रॉ प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से व्युत्पंन डेटा का चित्रण । समय रेखांकन है कि Vmax के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया पर प्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई है । कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: FCoV एस 1/s2 और s2 ' साइटों fluorogenic पेप्टाइड्स के Trypsin मध्यस्थता proteolytic दरार । FECV की Trypsin दरार परख मैं और-4 और FIPV मैं काले एस 1/s2 साइटों और FECV मैं और-4, FIPV मैं काला, FECV द्वितीय १६८३ और FIPV द्वितीय ११४६ ' S2 साइटों । कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हम यहां एक fluorogenic पेप्टाइड परख कि उनके proteolytic दरार के लिए प्रोटीन दृश्यों की एक तेजी से स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है द्वारा प्रस्तुत करता है । हमारे पहले उदाहरण में हम MERS-CoV स्पाइक (एस) प्रोटीन के विभिंन दरार साइट रूपांकनों चुना इस परख के लिए एक आवेदन वर्णन । कई लिफाफे वायरस है कि वर्ग के पास मैं फ्यूजन प्रोटीन जैसे MERS-CoV, सार्स-CoV (गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम) और इंफ्लूएंजा सार्वजनिक स्वास्थ्य और नए उपप्रकार के लिए प्रमुख चिंता कर रहे है लगातार विकसित कर रहे है कि एक के लिए प्रजातियों को पार करने की क्षमता है बाधाओं को अपने प्राकृतिक मेजबान से मनुष्य1,15,16। वायरस अलग और उंहें प्रयोगशाला में खेती हमेशा संभव नहीं हो सकता है या विशेष प्रयोगशालाओं कि हर अनुसंधान सुविधा में उपलब्ध नहीं है की आवश्यकता है । इसलिए, वहां तरीकों के लिए एक की जरूरत है उभरते वायरस है कि नियमित रूप से प्रयोगशाला की स्थिति के तहत आयोजित किया जा सकता है की क्षमता सार्वजनिक स्वास्थ्य के खतरे का आकलन है । मनुष्यों लक्ष्यीकरण वायरस के अलावा, FCoV जैसे कुछ जानवर वायरस भी एक ही वर्ग मैं फ्यूजन प्रोटीन के अधिकारी, इसलिए, अपने मानव समकक्षों की तुलना में इसी तरह की विशेषताओं के बंटवारे. इन विषाणुओं को अलग करना भी एक चुनौती हो सकता है, नवीन उपकरणों का उपयोग कर उन्हें अध्ययन करना आवश्यक है.

उपर्युक्त वायरस के जीवन चक्र में एक महत्वपूर्ण कदम मेजबान सेल प्रविष्टि और फ्यूजन मेजबान द्वारा संबंधित फ्यूजन प्रोटीन के प्रसंस्करण proteolytic द्वारा मध्यस्थता1,2है । एक मानक तरीका वायरल जीवन चक्र के इस भाग की जांच करने के लिए एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में फ्यूजन प्रोटीन जीन क्लोन है, transfect स्तनधारी कोशिकाओं है कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं, मशीन या सह ब्याज की छेड़ने के साथ transfect, को अलग प्रोटीन और एक पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं । इस विधि कई सीमाओं के साथ आता है: क्लोनिंग के लिए वायरल डीएनए/आरएनए की उपलब्धता, synthesizing के लिए लागत जीन यदि कोई डीएनए या आरएनए उपलब्ध है, एक एंटीबॉडी की उपलब्धता फ्यूजन प्रोटीन और उसके क्लीवेज उत्पाद (ओं) का पता लगाने के लिए, और यह करने के लिए कई ले जा सकते हैं सप्ताह तक पूरा अध्ययन किया जाता है । यह भी अधिक समय लेने वाली हो जाता है, पैसा और गहन श्रम अगर अध्ययन के हित के लिए दरार साइट में कई उत्परिवर्तनों की जांच है क्योंकि यह साइट की आवश्यकता है-mutagenesis निर्देश दिया । fluorogenic पेप्टाइड परख हम यहां वर्णन इन सीमाओं नहीं है । ब्याज की पेप्टाइड्स सार्वजनिक रूप से उपलब्ध दृश्यों के आधार पर डिजाइन किया जा सकता है, वहां कई आपूर्तिकर्ताओं कि रिकॉमबिनेंट की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान कर रहे है कि इस प्रकार के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है और विश्लेषण सहित परख एक के भीतर किया जा सकता है एक दिन ।

हमारे उदाहरण में, हम furin की जांच की मध्यस्थता दरार के ' S2 MERS-CoV एस प्रोटीन मनुष्यों और मिस्र और मोरक्को से ऊंटों से व्युत्पंन की चिढ़ाना मांयता साइट । दोनों मानव EMC/2012 और ऊंट HKU205 ' S2 साइटों एक ठेठ RXXR furin दरार आकृति होते हैं । हालांकि, PiTou २.० दरार स्कोरिंग एल्गोरिथ्म HKU205 S2 ' साइट के अनुसार furin, जो हम प्रयोग19की पुष्टि से सट जाने की भविष्यवाणी नहीं है । कारण HKU5 S2 ' furin द्वारा संसाधित नहीं है ' P1 स्थिति में isoleucine के कारण हो सकता है । जब हम दो पेप्टाइड्स कि EMC/2012 S2 के अनुक्रम में व्यक्तिगत उत्परिवर्तनों का परीक्षण किया, हम पुष्टि करते है कि isoleucine ' P1 में मोटे तौर पर abrogates दरार जबकि alanine serine प्रतिस्थापन के लिए कम दरार में परिणाम में सक्षम थे । Mor213 S2 ' साइट एक furin दरार आकृति शामिल नहीं है और यह लगभग कोई दरार का पता लगाने के लिए आश्चर्य की बात नहीं थी । हम यह भी जांच कैसे furin s/s2 और s2 के FCoV एस प्रोटीन की मांयता साइटों को छेड़ो सट । हम दोनों FECV पेप्टाइड्स के furin दरार का निरीक्षण करने में सक्षम थे (FECV मैं और-4 एस 1/s2 और FECV द्वितीय १६८३ s2 '), जबकि FIPV वायरस से रूपांतरित अनुक्रम furin द्वारा सट नहीं थे ।

जब EMC के furin-मध्यस्थता दरार की तुलना करें ' s पेप्टाइड (चित्रा 1a) के साथ FECV मैं और-4 s/2 पेप्टाइड्स (चित्रा 2a), हमने पाया कि वहाँ एक अनुमानित 26-गुना अंतर Vmax में था. यह दोनों दृश्यों (तालिका 1) में furin दरार आकृति द्वारा समझाया जा सकता है । जबकि furin क्लीवेज के लिए न्यूनतम आवश्यकता एक RXXR आकृति है, एक RXRR अनुक्रम ज्यादा अनुकूल है2. इसलिए, EMC/2012 S2 के पेप्टाइड, जो एक ्सर आकृति है, कम विशिष्टता के साथ FECV मैं और-4 s/2 पेप्टाइड कि एक RSRR furin दरार साइट (तालिका 1) शामिल है की तुलना में सट गया है ।

हालांकि, परख की एक प्रमुख सीमा है कि पेप्टाइड्स वे आम तौर पर में एंबेडेड है प्रोटीन के तृतीयक संरचना को प्रतिबिंबित नहीं करते । पूर्ण लंबाई फ्यूजन प्रोटीन का दरार फ्यूजन पेप्टाइड को उजागर करता है और मेजबान सेल प्रविष्टि1ट्रिगर । के बीच बातचीत और फ्यूजन प्रोटीन भी फ्यूजन प्रोटीन के तृतीयक संरचना द्वारा प्रभावित हो सकता है, जबकि हम मानते हैं कि पेप्टाइड्स अधिक या कम रैखिक हैं. इसलिए, दरार में पाया पेप्टाइड परख कृत्रिम हो सकता है और vivo स्थिति में प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है । इस इंफ्लूएंजा H3N2 हा matriptase द्वारा प्रकार के दरार के लिए रिपोर्ट किया गया था । जबकि कई समूहों पेप्टाइड परख में matriptase द्वारा H3N2 हा के क्लीवेज वर्णित है, यह भी दिखाया गया है कि पूर्ण लंबाई H3N2 हा प्रोटीन और कोशिका संस्कृति में matriptase की मशीन एक fusogenic हा प्रोटीन में परिणाम नहीं था4,20, 21. शी. वहां अंय उदाहरण है कि पता चलता है कि proteolytic दरार के जैविक रूप से महत्वपूर्ण विनियमन प्रोटीन अनुरूपता के स्तर पर है । यह बताया गया है कि फ्यूजन प्रोटीन कभी-कभार फ्यूजन की घटनाओं की एक श्रृंखला की जरूरत है फ्यूजन पर दरार साइटों को बेनकाब करने में सक्षम होने के लिए. Semliki वन वायरस फ्यूजन प्रोटीन, उदाहरण के लिए, फले की घटनाओं की एक संख्या के दौरान संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था की आवश्यकता है ताकि इसके फ्यूजन प्रोटीन को बेनकाब और proteolytic सक्रियण के लिए यह उपलब्ध बनाने के लिए22। इसलिए, एक fluorogenic पेप्टाइड परख में प्राप्त परिणामों को सेल फ्यूजन परख या इसी तरह के प्रयोगों के द्वारा मांय किया जाना चाहिए । हालांकि, पेप्टाइड परख अभी भी कई के एक तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देता है/पेप्टाइड संयोजन और परिश्रम और संयोजन है कि दरार नहीं दिखा है के बाद से प्रयोगों का समय कम करने के लिए बहुत vivo मेंएक ही परिणाम प्रदर्शित होने की संभावना है ।

परख की दूसरी प्रमुख सीमा की चिंताओं को छेड़ो । अब तक यह केवल घुलनशील को छेड़ने का परीक्षण नहीं बल्कि transmembrane को ही संभव है. प्रयोग की मंशा के आधार पर, यह एक समस्या हो सकती है । उदाहरण के लिए, इंफ्लूएंजा है transmembrane के एक नंबर से सक्रिय कर रहे है कोशिका झिल्ली8पर स्थित चिढ़ाती है । एक निश्चित सीमा तक, इस समस्या को घुलनशील proteolytic सक्रिय डोमेन का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, लेकिन परिणाम के लिए सावधानी के साथ व्याख्या की है और पारंपरिक तरीकों के साथ मांय किया जाना चाहिए । हम matriptase और H3N2 हा के प्रति अपनी गतिविधि के साथ beforementioned उदाहरण का उल्लेख करना चाहते हैं । vivo matriptase में कोशिका झिल्ली में स्थित है, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम घुलनशील उत्प्रेरक डोमेन है । के रूप में फ्यूजन प्रोटीन के संबंध में चर्चा की, यह संभव हो सकता है कि यह भी पूर्ण लंबाई के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन सब्सट्रेट के साथ बातचीत करने के लिए दरार प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है और है कि केवल एक डोमेन परीक्षण झूठी सकारात्मक में परिणाम हो सकता है ।

इस पद्धति को furin द्वारा विशिष्ट अमीनो अम्ल दृश्यों के क्लीवेज का अध्ययन करने में दक्ष दिखाया गया है. हालांकि, किसी भी उपलब्ध छेड़ने के लिए तकनीक सीमा के आवेदन (जैसे, cathepsins, प्रोटीन convertase), यह एक उपयोगी विधि बनाने के लिए स्क्रीन पेप्टाइड उंमीदवारों के लिए दरार । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि इस परख भी छेड़ने अवरोधकों की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है और इसलिए प्रदान करता है एक तेजी से और आसान करने के लिए उपकरण के लिए स्क्रीन प्रोटीन निषेध23।

fluorogenic पेप्टाइड दरार परख यहां वर्णित bioinformatic दरार स्कोरिंग एल्गोरिदम, जो एक निर्धारित छेड़ने से पेप्टाइड दरार की भविष्यवाणी के लिए एक अतिरिक्त का प्रतिनिधित्व करता है, एमिनो एसिड गुण और अनुक्रम पर आधारित है । इन दो तकनीकों, परंपरा पश्चिमी सोख्ता तकनीक के साथ संयोजन में एक कुशल विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए इन विट्रो मेंदरार का अध्ययन ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत MERS परियोजना के लिए अनुसंधान धन NIH अनुदान R21 AI111085 द्वारा प्रदान किया गया था । डियर कोरोनावायरस स्टडी को मॉरिस एनिमल फाउंडेशन, Winn डियर फाउंडेशन और कॉर्नेल डियर हेल्थ सेंटर से रिसर्च ग्रांट्स ने सपोर्ट किया था. हम भी Mor213 अनुक्रम के साथ हमें प्रदान करने के लिए मलिक Peiris शुक्रिया अदा करना चाहूंगा इससे पहले कि यह सार्वजनिक रूप से सुलभ था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

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Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

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