Summary
Wir präsentieren einen Fluorogenic Peptid Spaltung-Assay, der eine schnelle Screening der proteolytischen Aktivität der Proteasen auf Peptide repräsentieren die Spaltstelle virale Fusion Peptide ermöglicht. Diese Methode kann auch auf andere Aminosäure-Motiv in eine Proteinsequenz verwendet werden, für die Protease-Aktivität zu testen.
Abstract
Behüllte Viren wie z. B. Coronaviren oder Influenza Virus erfordern proteolytische Spaltung von ihrer Schmelzverfahren Protein zu die Wirtszelle infizieren können. Oft Viren aufweisen Zell- und Tropismus und bestimmten Zelle oder eines Gewebes Proteasen angepasst sind. Darüber hinaus können diese Viren Mutationen oder Einfügungen in ihr Genom während der Replikation einzuführen, die beeinträchtigen die Spaltung, und somit können zur Anpassung an einen neuen Host. Hier präsentieren wir Ihnen einen Fluorogenic Peptid Spaltung Assay, der eine schnelle Screening von Peptiden imitiert die Spaltstelle von viralen Fusionsproteine ermöglicht. Die Technik ist sehr flexibel und kann verwendet werden, um die proteolytische Aktivität der einzelnen Protease auf vielen verschiedenen Untergründen zu untersuchen, und darüber hinaus ermöglicht es auch Exploration der Aktivität von mehreren Proteasen auf einem oder mehreren Peptid-Substraten. In dieser Studie verwendeten wir Peptide imitiert die Spaltung Website Motive des Coronavirus Spike-Proteins. Wir testeten menschlichen und Kamel abgeleitet Nahen Osten respiratorisches Syndrom Coronaviren (MERS-CoV) zeigen, dass ein- und Auswechslungen in der Spaltstelle die Aktivität der Furin verändern und Spaltung Effizienz drastisch ändern können. Wir nutzten diese Methode in Kombination mit Bioinformatik, Furin Spaltung Aktivität der feline Coronavirus Spike Proteine aus verschiedenen Serotypen und Stämme zu testen. Dieses Peptid-basierte Methode ist weniger Arbeits- und zeitintensiv als herkömmliche Methoden für die Analyse der proteolytischen Aktivität auf Viren, und Ergebnisse können innerhalb eines einzigen Tages.
Introduction
Virale Fusion mit der Host-Zellmembran ist ein entscheidender Schritt im Lebenszyklus von behüllten Viren und erleichtert die Aufnahme in die Zelle und die Replikation des Virus. In der Regel besitzen Viren eine spezielle Protein (oder Proteine), die an Rezeptoren auf der Zellmembran Host bindet und löst die Virus-Zelle Membrane Fusion1. Viralen Fusionsproteine wurden in drei Hauptklassen (I-III)1gruppiert. Eine Reihe von Viren, die derzeit ein wichtiges Anliegen für die öffentliche Gesundheit, wie z. B. Influenza-Virus (für eine langjährige zoonotische Entstehung von Vögel) und Nahen Osten respiratorische Syndrom-Coronavirus (MERS-CoV) sind (repräsentieren eine neue Zoonose Entstehung von Kamelen), nutzen die sogenannte Klasse I Fusionsproteine, die proteolytische Verarbeitung von Host Proteasen, ausüben, ihre Fusogenic Aktivität2erfordern. In ähnlicher Weise feline Coronavirus (FCoV), die eine schwere Erkrankung Bedrohung für Wild- und Katzen darstellt, verfügen auch über eine Klasse ich Fusionsproteins. Klasse I virale Fusion Proteine sind in der Regel als ein uncleaved Vorläufer synthetisiert und in der Regel bestehen aus zwei Domänen, die für Rezeptor binden und das Fusion-Ereignis auslöst bzw. verantwortlich sind. Bis heute ist die Influenza Hämagglutinin (HA) die am besten verstanden Schmelzverfahren Protein und zahlreiche Studien haben seine mechanistische Rolle Host Zelle Eintritt und Fusion3beschrieben. In diesem Fall tritt Spaltung des Fusionsproteins in einer bestimmten Reihenfolge oder Spaltstelle in HA und in Kombination mit pH-abhängigen Konformationsänderungen, Ergebnisse in der Ausstellung des viralen Fusion Peptid1,2.
Das Fusion-Peptid und seine vorhergehenden Protease Erkennungssequenz sind entscheidend für die Pathogenität und der Host-Anpassung des Virus. Änderungen in der Protease Erkennungssequenz können Spaltung mit möglicherweise dramatischen Folgen für das Virus und die Host-4erheblich verändern. Auf der einen Seite kann es Spaltung aufzuheben und so den Lebenszyklus des Virus beseitigen. Aber auf der anderen Seite eine Mutation kann die Substratspezifität für einen bestimmten Protease zu erhöhen und/oder ermöglichen eine "neue" Protease, die Schmelzverfahren Protein zu Spalten. Danach können auch die Zell- und Tropismus wie beobachtet, z. B. mit Influenza-Virus-Subtypen5,6erweitern. In der Regel niedrige Pathogenität Influenzaviren (LPAI) und die meisten menschliche Influenza-Viren sind beschränkt auf die Atemwege oder Magen-Darm-Trakt aufgrund der begrenzten Lokalisierung von Proteasen, die sie aktivieren. In der Regel ist das Fusion-Peptid solcher HA Proteine eine vier-amino Acid Sequenz, die besteht aus 1-2 nichtkonsekutiver basischen Aminosäuren, voraus, die von Trypsin-ähnlichen Serin Proteasen wie Trypsin, Matriptase oder TMPRSS27, erkannt wird 8. wenn das Virus erwirbt Insertionen oder Mutationen, die die Spaltstelle auf eine polybasic Website zu ändern, es ermöglicht Furin, HA zu aktivieren und zu führen, eine viel mehr schwere systemische Infektion6,9. Diese Viren werden als hohe Pathogenität Vogelgrippe-Virus (HPAI), beispielsweise im Zusammenhang mit H5N1-Stämme bezeichnet.
Im Gegensatz zur Grippe HA haben viele Coronaviren wie MERS-CoV, zwei unterschiedliche Spaltstellen innerhalb ihrer Spike-Proteins. S1/S2-Website der C-terminalen Fusion Domäne (S2), trennt die N-terminale Rezeptor bindende Domäne (S1) mit einer zweiten Spaltstelle, genannt S2 ", unterhalb des Standortes S1/S2, in der Nähe der Fusion-Peptid-10. Es wurde vorgeschlagen, dass die Seiten nacheinander, bei S1/S2 gefolgt von S2 gespalten sind ". Im Gegensatz zu den HA von den meisten Influenza-Virus-Stämme, die MERS-CoV S-Protein S1/S2 und S2' Websites durch Proteasen der proprotein Konvertase (PC)-Familie, wie Furin erkannt werden. Mitglieder dieser Familie cleave bei gekoppelten grundlegende Rückstände mit dem Motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Im Allgemeinen werden die Aminosäuren stromaufwärts der Spaltstelle bezeichnet als P1, P2, P3. beginnend mit der Spaltstelle und flussabwärts der Aminosäuren werden als P1 bezeichnet ", P2', P3", etc.. 11. FCoV-Stämme besitzen entweder ein einzelnes oder eine dual Spaltstelle. Wie MERS-CoV, einige Stämme FCoV besitzen auch zwei Spaltstellen (S1/S2 und S2 ") in ihren S-Protein. Allerdings ist dieses Merkmal exklusive Serotyp I FCoVs (Stamm A). Im Gegensatz dazu haben Mitglieder der Vereinigung Serotyp II (Clade B) nur einen einzigen Spaltstelle (S2 ")2,12. Mehreren Proteasen sind vorgeschlagen worden, um die FCoV Spaltstellen, einschließlich Furin, Trypsin-ähnlichen Proteasen und Cathepsin Spalten. Es wurde vorgeschlagen, dass das S-Protein des enterischen FCoV (auch bekannt als feline enterale Coronavirus oder FECV) Furin im Ortsbild S1/S2 und Mutationen in diesem Aufstellungsort gespalten werden dürfte (wie auch bei S2 ") führt zu Änderungen der Protease-Anforderungen. Diese Mutationen wurden Änderungen in den Tropismus und Pathogenität dieser Viren, so dass der Virus zu systemischen und Makrophagen-Wendekreis (auch bekannt als feline infektiöse Peritonitis-Virus oder FIPV)13zugeordnet.
Viren stellen natürlich Mutationen in ihre Genome während jedem Replikationszyklus und häufig neue Subtypen und Grippeviren, MERS-CoV und FCoV sind beschrieben14,15,16. Als Teil eine rasche Auswertung der Bedrohung der öffentlichen Gesundheit von neuen Viren zu beurteilen ist es wichtig, Veränderungen in der Spaltstelle und wie wirkt sich das Spektrum der Proteasen aktivieren diese Viren zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Peptid-basierte Test, das ermöglicht eine sehr schnelle Beurteilung der Auswirkungen der Spaltung Website Änderungen in MERS-CoV S-Protein die Substratspezifität von einem bestimmten Protease und verschiedenen Proteasen für ihre Fähigkeit, Spalten schnell auf den Bildschirm eines gegebenen oder mehrere Sequenzen4. In einer zweiten Reihe von Experimenten verwendet wir die Technik die Furin Spaltung Aktivität über verschiedene FCoV-Serotypen und Stämme zu bestimmen.
Die Peptide, die in diesem Test verwendet werden mit dem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) paar, 7-Methoxycoumarin-4-Yl Acetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-Dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus geändert. Während der Test MCA ist aufgeregt und emittiert Licht-Energie, die von DNP gestillt ist, solange das Paar in unmittelbarer Nähe zueinander ist. Tritt Spaltung jedoch DNP ist nicht in der Lage, die Emission nicht mehr zu stillen und es kann von der Fluoreszenz-Platte-Reader gelesen werden. Die Veränderungen in der Fluoreszenz wird gemessen, während das Experiment zur Bestimmung der Peptid Spaltung und zur Berechnung der Geschwindigkeit, bei der die Protease die spezifischen Peptid (auch bekannt als Vmax)17 spaltet.
Um die Peptide zu entwerfen, muss das gen des jeweiligen Fusionsproteins wurden sequenziert und/oder in einer Datenbank zur Verfügung gestellt. Die Methode ist jedoch weniger Arbeit intensiv und kostspieliger als herkömmliche Methoden, die in der Regel das Klonen des Fusion-Gens in Expressionsvektoren in Säugetierzellen erfordern zu analysieren, die Spaltung zu fassen. Von Anfang bis Ende kann dies mehrere Tage bis wenige Wochen dauern, während die hier präsentierten Peptid-Assays, innerhalb eines Tages erfolgen können als Peptide und Proteasen zur Verfügung stehen. Die Einrichtung des Tests dauert zwischen 5 und 30 min, je nach der Anzahl der Stichproben und die Laufzeit in der Fluoreszenz-Platte-Leser ist, 1 h. Analyse der Daten kann dauern, bis zu 2 h wieder abhängig von der Größe der Stichprobe.
Hier haben wir zwei unterschiedliche Beispiele auf die Probe zu stellen. Im ersten Beispiel präsentieren wir Daten, die die Furin-vermittelte Spaltung der menschlichen und Kamel-abgeleitete MERS-CoV, bewerten das Potenzial der Kamel-abgeleitete Stämme der Menschen aktiviert wird, wenn sie die Artengrenze übereinander vergleicht. Im zweiten Beispiel wir zum einen Fluorogenic Peptid-Assay Furin-vermittelte Spaltung der S1/S2 und S2 bestimmen "Websites oder S2' Sitz von zwei Serotyp ich und zwei Serotyp II FCoV Stämme, beziehungsweise. Für diese Experimente haben wir Trypsin Spaltung als Positivkontrolle verwendet.
Protocol
1. Planung und Vorbereitung der Peptide
- Die Reihenfolge des Fusionsproteins von Zinsen aus einer öffentlichen Datenbank z. B. NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder der Virus-Erreger-Datenbank (https://www.viprbrc.org) zu erwerben. Wählen Sie die Protease-Anerkennung-Website vor der Fusion-Peptid und enthalten Sie 2-3 Aminosäuren vor- und nachgelagerten dieser Sequenz.
- Bei der Bestellung die Peptide zu verändern mit dem Bund paar 7-Methoxycoumarin-4-Yl Acetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-Dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus.
Hinweis: Einige Lieferanten bieten diese Änderungen. Preis und Lieferzeit abhängig von der bevorzugte Lieferant. Gibt es jedoch alternative Modifikationen, die variieren in ihrer Empfindlichkeit und verlangen eine Anpassung der Platte Leser in Bezug auf die Wellenlängen. - Aufzuwirbeln Sie das Peptid gemäß den Empfehlungen des Herstellers von sanft auf und ab pipettieren. Z. B. Aufschwemmen Sie Peptide in 70 % igem Ethanol auf die Endkonzentration von 1 mM.
- Optional fügen Sie die Röhrchen mit das Peptid und das Lösungsmittel in einer Beschallung Bad, bis es vollständig Nukleinsäuretablette ist, wenn das Peptid ist nicht sehr gut durch Pipettieren aufzuwirbeln hinzu.
- Aliquoten Röhren das Peptid in leichte Dämpfung oder beständig um das Peptid aus bleichen zu schützen. Halten Sie Aliquote Größen klein, mehrere Frost/Tau-Zyklen (z. B. 100 µL) zu vermeiden. Speichern Sie Aliquote bei-20 ° C.
2. Vorbereitung des Fluoreszenz-Platte-Lesers
- Schalten Sie den Teller-Leser und warten Sie, bis der Selbsttest abgeschlossen ist.
- Öffnen Sie die Betriebs-Software auf dem angeschlossenen Computer und stellen Sie sicher, dass es mit der Platte-Leser angeschlossen ist.
- Öffnen Sie die Temperatureinstellung und auf 30 ° C (oder die gewünschte Temperatur für eine optimale Leistung für die Protease) festgelegt.
- Klicken Sie auf -Steuerelement | Instrument-Setup , um das Experiment einzurichten.
- Wählen Sie kinetische.
- Wählen Sie Fluoreszenz.
- Geben Sie Anregung und Emission Wellenlängen: 330 nm und 390 nm bzw..
- Deaktivieren Sie automatische Abschaltung.
- Wählen Sie Mittel, normale Empfindlichkeit.
- Wählen Sie eine Laufzeit von 1 h für den Test und wählen Sie eine Messung alle 60 s.
- Satz 5 s mischen vor der ersten Messung und 3 s vor jeder Messung
- Wählen Sie Brunnen zu lesen und den Test zu starten.
3. Vorbereitung der Probe
- Bereiten Sie die Testpuffer durch Berechnung der entsprechenden Mengen für jeden Inhaltsstoff und hinzufügen. Dafür Furin, Puffer, bestehend aus 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 5 % Triton x-100. Verwenden Sie für Trypsin standard Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
Hinweis: Volumes von bis zu 10 mL reichen. Je nach der Protease(s) in der Probe verwendet der Puffer. - Kühlen Sie den Puffer auf Eis.
- Legen Sie die Assay-Platte mit einer dünnen Metallplatte unter Kühlung Unterstützung und Stabilität auf Eis. Nutzen Sie eine solide schwarz Polystyrol 96-Well-Platte mit flachem Boden und unbehandelten.
Hinweis: Es ist wichtig, um schwarze Platten verwenden fluoreszierende "auslaufen" aus benachbarten Brunnen zu verhindern. - Berechnen Sie die entsprechende Menge an Protease für jede Reaktion, basierend auf früheren Veröffentlichungen oder experimentelle Daten hinzufügen. Verwenden Sie für Furin 1 Einheit pro Reaktion entspricht 0,5 µL. Verwenden Sie für Trypsin 0,5 µL von 160 nM TPCK Trypsin.
- Pro Probe bereiten Sie 3 Technische Wiederholungen pro Probe in einem Gesamtvolumen von 100 µL pro Probe vor.
Hinweis: Es wurde experimentell bewertet, dass es keinen Unterschied macht, ob der Pipettierung unter normalen Lichtverhältnissen erfolgt oder Licht gedimmt. Die Peptide sollte jedoch nicht für längere Zeit ans Licht ausgesetzt werden. - Pipette die entsprechende Menge an Testpuffer (94,5 µL wie unter Schritt 3.1) in jede Vertiefung.
- Fügen Sie die Protease, in jede Vertiefung. Verwenden Sie für beide, Furin und TPCK Trypsin 0,5 µL pro Probe. 6 Brunnen (3 Brunnen für ein leeres Steuerelement) und 3 Brunnen für ein Peptid-Steuerelement fügen Sie 0,5 µL Puffer anstelle der jeweiligen Protease hinzu.
- Hinzu kommt das Peptid eine Endkonzentration von 50 µM in jede Vertiefung mit Ausnahme der Blindkontrolle. In diesem Fall pipette 5 µL Peptid wie unter Schritt 1.3 beschrieben. Die leere Steuerelement anstelle von Peptid 5 µL Puffer hinzufügen.
Hinweis: Mehrere Konzentrationen des Peptids wurden zunächst mit der beschriebenen Enzymkonzentrationen um sicherzustellen, dass die Enzyme gesättigt wurden getestet. - Legen Sie die Platte in den Fluoreszenz-Platte-Leser und klicken Sie auf Start.
(4) Datenanalyse
- Speichern Sie die Experiment-Datei.
- Klicken Sie auf exportieren , und exportieren Sie die Datei als eine txt.
- Importieren Sie die txt-Datei in eine Tabelle.
- Erstellen Sie für jede technische replizieren pro Probe ein Graphen Plotten der relativen fluoreszierenden Einheiten (RFU) auf der y-Achse gegen die Zeit auf der x-Achse (ergänzende Abbildung1).
- Wählen Sie den Datenbereich, wo das Diagramm in einem linearen Bereich und das nähste zu Beginn der Fluoreszenz-Erhöhung ist.
- Die ausgewählten Daten auf ein zweites Diagramm des Grundstückes und eine lineare Trendlinie hinzufügen.
- Wählen Sie in der Trendlinie Optionen Anzeige Gleichung im Diagramm. Die Gleichung zeigt die Vmax.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Vmax für jede Probe aus den 3 Technische repliziert.
- Wiederhole das Experiment noch zweimal um 3 biologische Wiederholungen zu erhalten.
- Berechnen Sie die Standardabweichung basierend auf den Daten von 3 unabhängigen biologischen repliziert.
Representative Results
Im ersten Teil dieser Studie verwendeten wir Peptide, die die S2 darstellen "Spaltstelle von drei unterschiedlichen MERS-CoV S-Proteine: aus den prototypischen EMC/2012 menschliche Sorte (Genbank AFS88936.1) abgeleitet und von zwei ausgewählten Kamel-MERS-FOV, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) und Mor215 (Genbank AVN89324.1) Stämme, isoliert in Ägypten und Marokko, bzw. (Tabelle 1)16,18.
Im Vergleich zu EMC/2012-Stamm, der HKU205 S2' Spaltstelle hat zwei Mutationen im P1 und P2 "Positionen, die möglicherweise Auswirkungen auf seine Anerkennung durch Furin und verändern die Spaltung Effizienz (Tabelle 1). Darüber hinaus wir waren daran interessiert zu untersuchen, ob und wie jede einzelne Mutation gefunden in der HKU205 Belastung betrifft Furin Spaltung. Wir, daher enthalten zwei Peptide, wo die einzelnen Ersetzungen in der Peptidsequenz EMC/2012 eingeführt wurden (EMC/2012 MutA-S S2' und EMC/2012 MutS-ich S2 ") (Tabelle 1). Furin konnte EMC/2012 Peptid effizient mit einer Vmax von 6,3 ± 1,2 cleave RFU/min, während wir fast keine Spaltung erkannt, wenn das S2 mit "Peptid des HKU205-Stammes (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Abbildung 1a). Bei der Untersuchung von EMC/2012 MutA-S S2 "Peptid, wir fanden, dass die Spaltung war stark reduziert im Vergleich zu Wildtyp-Sequenz (Vmax 3,6 ± 1 RFU/min). Es gab fast keine Spaltung beim Testen von EMC/2012 MutS-ich S2 "Peptid (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (Abbildung 1a).
Vor kurzem wurden MERS-CoV-Isolate aus Westafrika berichtet, dass in der arabischen Halbinsel16phylogenetisch unterscheidet sich von MERS-CoV gefunden werden. Eine der kürzlich beschriebene Isolate ist der Mor213 Stamm, der trägt eine Leucin anstelle von einer Arginin in der P4-Position des S2' Website (Tabelle 1) und die potentiell seine Anerkennung durch Furin beeinflussen und verändern die Spaltung Effizienz könnten. Unsere Peptid-Test zeigte, dass es nur minimale Spaltung des Mor213 S2' Seite im Vergleich zu den EMC/2012-Seite (Abbildung 1 b). Die Vmax für das Mor213 Peptid ist 1,0 ± 0,1.
Für den zweiten Teil dieser Studie haben wir die gleichen Peptid-Assay Furin-vermittelte Spaltung der FCoV S Protein Spaltstellen bewerten. Wir verwendeten Peptide imitiert die S1/S2-Spaltstelle von zwei FCoV Serotyp ich Viren: FECV I und-4 (von Whittaker Lab) und FIPV ich schwarz (Genbank AB088223.1). Wir verwendet auch Peptide imitiert die S2 "Website von diesen Viren sowie zwei FCoV Serotyp II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) und FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) Stämme (Tabelle 1). Furin Spaltung tritt normalerweise auf, wenn grundlegende Rückstände (Arginin und Lysin) in der P1 und P4 Positionen der Spaltstelle vorhanden sind. Mutationen im P1, P4 und P1 "Positionen werden vorgeschlagen, um Furin Cleavability, daher ändern die Protease-Anforderungen des Proteins stören. (Tabelle 1). Furin Spaltung wurde für das prototypische S1/S2-Peptid FECV I und 4 S1/S2 beobachtet (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min), aber nicht in das mutierte S1/S2-Peptid FIPV ich schwarz S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/min) (Abbildung 2A). Ebenso Furin war in der Lage, die prototypische S2 cleave' Peptid FECV II 1683 S2 "(Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), aber nicht das mutierte S2" Peptide FECV I und 4 S2 "(Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV ich schwarz S2" (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) und FIPV II 1146 S2 "(Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / min) (Abbildung 2 b). Peptid-Spaltung Trypsin als Positivkontrolle dienen und wir beobachteten Trypsin Spaltung in alle Peptide verwendet (ergänzende Abbildung2).
Tabelle 1. Peptide benutzt und entsprechende Aminosäuresequenzen. Die Peptide in der Assays verwendet enthalten (7-Methoxycoumarin-4-Yl) Acetyl/2,4-Dinitrophenyl (MCA/DNP) Bund paar. Die P4 und P1 Spaltung Website positioniert Arginin (R) Rückstände, die von Furin anerkannt werden, sind fett gedruckt. Mutationen im Vergleich zum Referenz-Sequenzen entsprechen Rückstände in rot.
Abbildung 1 . Furin-vermittelten proteolytische Spaltung des menschlichen und Kamel-abgeleitete MERS-CoV S2' Websites Fluorogenic Peptide. A. Furin Spaltung Assay des menschlichen MERS-CoV EMC/2012 S2' Website und Kamel-abgeleitete Sorte HKU205 (doppelte Mutante), zusammen mit der einzigen mutierten Varianten von EMC/2012 (MutA-S und MutS-ich). B. Furin Spaltung Assay des menschlichen MERS-CoV EMC/2012 S2' Website und Kamel-abgeleitete Sorte Mor213. Für Platten A und B, Peptide mit rekombinanten Furin inkubiert und die Zunahme der Fluoreszenz durch proteolytische Verarbeitung wurde mit einem Fluorometer gemessen. Die Tests wurden in Triplicates mit Ergebnissen, die Durchschnitte der Vmax aus drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n = 3). Fehlerbalken zeigen SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Furin-vermittelten proteolytische Spaltung des FCoV S1/S2 und S2' Websites Fluorogenic Peptide. A. Furin Spaltung assay FECV I und-4 und FIPV ich schwarz S1/S2-Websites. Peptide mit rekombinanten Furin inkubiert. B. Furin Spaltung Assay der FECV I und-4, I schwarz, FIPV FECV II 1683 und FIPV II 1146 S2 "Websites. Die Zunahme der Fluoreszenz durch proteolytische Verarbeitung wurde mit einem Fluorometer gemessen. Die Tests wurden in Triplicates mit Ergebnissen, die Durchschnitte der Vmax aus drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n = 3). Fehlerbalken zeigen SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Tabelle 1: Vmax Werte für Abbildung 1 und Abbildung 2. Die Vmax Werte berechnet wurden, aus Graphen wie in zusätzliche Abbildung 1 illustriert und wie im Protokoll Abschnitt 4 beschrieben. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Darstellung der Rohdaten abgeleitet aus der Platte-Reader-Software. Anstieg der Fluoreszenz über Zeit-Diagramme, die für die Bestimmung der Vmax verwendet wurden. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 2: Trypsin-vermittelten proteolytische Spaltung des FCoV S1/S2 und S2' Websites Fluorogenic Peptide. Trypsin Spaltung assay FECV I und-4 und FIPV schwarz S1/S2 Websites und der FECV I und-4, I schwarz, FIPV FECV II 1683 und FIPV II 1146 S2 "Websites. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Discussion
Wir stellen Ihnen hier einen Fluorogenic Peptid-Assay, der eine schnelle Screening von Proteinsequenzen für ihre proteolytische Spaltung durch Proteasen ermöglicht. In unserem ersten Beispiel wählten wir verschiedene Spaltung Website Motive des MERS-CoV Spike (S) Proteins eine Anwendung für diese Probe veranschaulichen. Einige umhüllte Viren, die besitzen Klasse habe ich Fusion Proteine wie MERS-CoV, SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome) und Grippe sind Hauptanliegen für die öffentliche Gesundheit und neue Subtypen sind ständig in Bewegung, die ein Potenzial zur Spezies zu überqueren Barrieren aus ihrer natürlichen Wirte Menschen1,15,16. Die Viren zu isolieren und kultivieren sie im Labor möglicherweise nicht immer machbar oder erfordert spezielle Labors, die nicht in jede Forschungseinrichtung zur Verfügung stehen. Daher gibt es einen Bedarf an Methoden, um die potenzielle Bedrohung der öffentlichen Gesundheit von neuen Viren zu ermitteln, die unter normalen Laborbedingungen durchgeführt werden können. Neben Viren gezielt Menschen, einige tierische Viren wie FCoV auch besitzen die gleiche Klasse I Fusionsproteine, daher, der ähnlichen Eigenschaften als ihre menschlichen Kollegen zu teilen. Diese Viren zu isolieren, kann auch eine Herausforderung, die Nutzung innovativer Werkzeuge, sie zu studieren notwendig sein.
Ein entscheidender Schritt im Lebenszyklus des oben genannten Viren ist Host Zelleintrag und Fusion vermittelt durch proteolytische Verarbeitung des jeweiligen Fusionsproteins Host Proteasen1,2. Eine Standardmethode für diesen Teil des viralen Lebenszyklus untersuchen soll Klonen die Fusionsgen Protein in Säugetieren Expressionsvektor, transfizieren Säugerzellen, die Proteinexpression ermöglichen, brüten oder Co transfizieren mit Protease von Interesse, isolieren die Protein und ein western-Blot-Analysen durchführen. Diese Methode kommt mit mehreren Einschränkungen: Verfügbarkeit der viralen DNA/RNA für das Klonen, Kosten für die Synthese des Gens, wenn keine DNA oder RNA vorliegt, Verfügbarkeit eines Antikörpers zur Erkennung von Fusionsproteins und seiner Spaltung Produkt (e) und es kann dauern, bis zu mehreren Wochen, bis die gesamte Studie durchgeführt wird. Es wird sogar mehr zeitaufwendig, Geld und arbeitsintensiv, wenn das Interesse der Studie ist es, mehrere Mutationen in der Spaltstelle untersuchen, denn dazu ist die Site-verwiesene Mutagenese. Der Fluorogenic-Peptid-Test, die, den wir hier beschreiben, muss diese Einschränkungen nicht. Die Peptide von Interesse basiert auf öffentlich zugänglichen Sequenzen gestaltet werden können, gibt es mehrere Anbieter, die eine Vielzahl von rekombinanten Proteasen bereitstellen, die für diese Art von Studien relevant sind und der Assay, einschließlich der Analyse durchgeführt werden kann, innerhalb einer einzigen Tag.
In unserem Beispiel untersuchten wir Furin-vermittelte Spaltung des S2 "Protease Anerkennung Website des MERS-CoV S Proteins abgeleitet von Menschen und Kamelen aus Ägypten und Marokko. Die menschlichen EMC/2012 und das Kamel HKU205 S2'-Seiten enthalten auch ein typisches RXXR Furin Spaltung Motiv. Jedoch nach der PiTou 2.0 Spaltung scoring-Algorithmus der HKU205 S2' Website voraussichtlich nicht durch Furin, welche wir experimentell bestätigten19gespalten werden. Der Grund warum HKU5 S2 "wird nicht durch verarbeitet Furin möglicherweise aufgrund der Isoleucin in der P1" Position. Wenn wir testeten zwei Peptide, die die einzelnen Mutationen in der EMC/2012 S2 durchgeführt "Sequenz, konnten wir bestätigen, dass die Isoleucin in der P1" weitgehend hebt Spaltung, Alanin, Serin Substitution reduzierte Spaltung geführt. Die Mor213 S2' Website enthält keine Furin Spaltung Motiv und es war nicht überraschend, fast keine Spaltung zu erkennen. Wir auch untersucht, wie Furin S1/S2 und S2 spaltet "Protease Anerkennung Stätten der FCoV S-Protein. Wir konnten beobachten Furin Spaltung der beiden FECV Peptide (FECV I und 4 S1/S2 und FECV II 1683 S2 "), während mutierte Sequenzen von FIPV Viren nicht durch Furin gespalten wurden.
Beim Vergleich von Furin-vermittelte Spaltung des EMC/2012 S2 "Peptid (Abbildung 1A) mit der FECV I und 4 S1/2 Peptide (Abbildung 2A), wir fanden, dass es ein ungefähre 26-fold Unterschied in der Vmax. Dies lässt sich durch das Furin Spaltung Motiv in beiden Sequenzen (Tabelle 1). Während die Mindestanforderung für Furin Dekolleté ein RXXR Motiv ist, ist eine RXRR Sequenz deutlich günstigeren2. Daher die EMC/2012 S2 "Peptid, die ein RSAR Motiv hat, ist mit weniger Genauigkeit im Vergleich zu der FECV I und 4 S1/2-Peptid, das enthält eine RSRR Furin Spaltstelle (Tabelle 1) gespalten.
Eine erhebliche Einschränkung des Tests ist jedoch, dass die Peptide nicht die Tertiärstruktur des Proteins widerspiegeln, die sie in der Regel in eingebettet sind. Spaltung des Fusionsproteins in voller Länge zeigt das Fusion-Peptid und Trigger host Cell Eintrag1. Das Zusammenspiel von Protease und Schmelzverfahren Protein könnte auch durch die tertiäre Struktur des Fusionsproteins beeinflusst werden, während wir annehmen, dass die Peptide mehr oder weniger linear sind. Spaltung in der Peptid-Test erkannt kann daher künstliche und spiegeln nicht die in-Vivo -Situation. Dies war für die Spaltung der Influenza Subtyp H3N2 HA von Matriptase berichtet. Während mehrere Gruppen Spaltung des H3N2 HA von Matriptase in Peptid Tests beschrieben, zeigte sich auch, dass die Inkubation von voller Länge H3N2 HA Protein und Matriptase in der Zellkultur eine Fusogenic HA Protein4,20nicht ergeben hat, 21. Es gibt andere Beispiele, die zeigen, dass die biologisch wichtige Regelung der proteolytischen Spaltung auf der Ebene der Protein-Konformation. Es wurde beschrieben, dass Fusionsproteine manchmal eine Reihe von Pre-fusion Veranstaltungen brauchen, Spaltstellen auf Fusion aussetzen zu können. Der Semliki Forest Virus-Fusionsprotein erfordert beispielsweise strukturelle Umstellungen während eine Anzahl von prefusion Ereignissen um seine Schmelzverfahren Protein zu entlarven und proteolytische Aktivierung22zur Verfügung stellen. Daher müssen die Ergebnisse in einem Fluorogenic Peptid-Assay von Cell Fusion Assays oder ähnlichen Experimenten validiert werden. Allerdings ermöglicht der Peptid-Test noch eine schnelle Screening von mehreren Protease/Peptid-Kombinationen und reduzieren die Arbeit und die Zeit des Follow-up-Experimente, da Kombinationen, die nicht Spaltung zeigen, sehr wahrscheinlich sind, dass das gleiche Ergebnis in Vivoaufweisen.
Die zweite große Einschränkung des Assays betrifft die Proteasen. Bisher ist es nur möglich, lösliche Proteasen aber nicht transmembranen Proteasen zu testen. Abhängig von der Absicht des Experiments kann dies ein Problem sein. Zum Beispiel sind Influenza hat durch eine Reihe von transmembranen Proteasen befindet sich in Zellmembranen8aktiviert. Bis zu einem gewissen Grad dieses Problem umgangen werden kann, mithilfe der löslichen proteolytischen aktive Domains, aber die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden müssen und sollten mit konventionellen Methoden validiert werden. Wir wollen auf dem vorgenannten Beispiel mit Matriptase und seine Tätigkeit in Richtung H3N2 HA verweisen. In Vivo Matriptase befindet sich in der Zellmembran, aber die im Handel erhältliche Enzym ist die löslichen katalytische Domäne. Wie in Bezug auf die Fusionsproteine besprochen, kann es möglich, dass es erfordert auch die Full-length Protease, interagieren mit dem Full-length Protein-Substrat zu Spaltung und, dass nur einzelne Domains testen Fehlalarme führen kann.
Diese Methodik hat gezeigt, effizient, um die Spaltung von spezifischen Aminosäure-Sequenzen von Furin zu studieren. Jedoch die Anwendungen der Technik Grenzen zu jedem verfügbaren Protease (z.B.Cathepsins, proprotein Konvertase), so dass es eine nützliche Methode zum Bildschirm Peptid Kandidaten für Protease Dekolleté. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass dieser Test auch verwendet werden, kann um die Wirksamkeit von Protease-Inhibitoren zu testen und somit eine schnelle und einfach zu Werkzeug, um Bildschirm-Protein-Hemmer23 liefert.
Die Fluorogenic Peptid Spaltung Assay hier beschriebenen stellt eine Ergänzung Bioinformatic Spaltung scoring-Algorithmen, die durch eine entschlossene Protease, basierend auf die Aminosäure Eigenschaften und die Reihenfolge die Peptid-Spaltung voraussagt dar. Diese beiden Techniken in Kombination mit westlichen beflecken Techniken Tradition dient als eine effiziente Methode Protease Spaltung in Vitrozu studieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Forschungsförderung für das MERS-Projekt präsentiert in diesem Manuskript von NIH zur Verfügung gestellt wurde, gewähren R21 AI111085. Die feline Coronavirus-Studie wurde unterstützt durch Forschung Bewilligungen von Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation und der Cornell Feline Health Center. Wir möchten auch Malik Peiris danken, die uns mit Mor213 Sequenz, bevor es öffentlich zugänglich war.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
References
- Harrison, S. C.
- Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
- Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
- Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827 (2017).
- Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
- Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
- Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
- Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
- Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
- Polgar, L.
- Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
- Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
- Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R.
- Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
- Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
- Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
- Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
- Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
- Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
- Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
- Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
- Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).
