Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Summary

Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l'irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.

Abstract

Radiazione è ampiamente usato per applicazioni biologiche e per l'allevamento del fascio di ioni, e tra questi metodi, microbeam irradiazione rappresenta un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti negli organismi viventi. Questo articolo descrive una serie di metodi di immobilizzazione su chip sviluppato per l'irradiazione di microbeam mirata degli individui dal vivo di Caenorhabditis elegans. In particolare, il trattamento dei chip microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) che abbiamo precedentemente sviluppato per immobilizzare gli individui di c. elegans senza la necessità per l'anestesia è spiegato in dettaglio. Questo chip, indicato come un foglio di vite senza fine, è resiliente per consentire i canali microfluidici essere ampliato e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali. Inoltre, il foglio di vite senza fine Mostra la ritenzione idrica e permette agli individui di c. elegans di essere sottoposti ad osservazione microscopica per lunghi periodi in condizioni live. Inoltre, il foglio è solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti ad esempio ioni carbonio di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali, consentendo in tal modo le particelle di ioni essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Perché la selezione dei film di copertura utilizzato per racchiudere gli animali è molto importante per il successo a lungo termine immobilizzazione, abbiamo condotto la selezione dei film copertura adeguata e ha mostrato un consigliato uno tra alcuni film. Come un esempio di applicazione del chip, abbiamo introdotto imaging osservazione delle attività muscolare degli animali che racchiude il canale di microfluidica del foglio di vite senza fine, come pure l'irradiazione microbeam. Questi esempi indicano che i fogli di vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.

Introduction

Radiazioni, tra cui i raggi x, raggi gamma e fascio di ioni pesanti, sono ampiamente usato per applicazioni biologiche come nella diagnosi del cancro e nel trattamento e per l'allevamento del fascio di ioni. Numerosi studi e sviluppi tecnici si stanno attualmente concentrando sugli effetti della radiazione^1,2,3. Microbeam irradiazione è un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti nel vivere organismi⁴. Il Takasaki Advanced radiazione ricerca Istituto di istituti nazionali per Quantum e radiologici Science and Technology (QST-Takasaki) ha sviluppato una tecnologia per irradiare le cellule individuali sotto osservazione microscopica utilizzando ioni pesanti microfasci⁵e ha stabilito i metodi per consentire l'irradiazione di microbeam mirato di diversi modelli animali, quali il nematode Caenorhabditis elegans^4,6, bachi da seta⁷e Oryzias latipes (Japanese medaka)⁸. Microbeam mirati irradiazione della del nematode c. elegans permette l'efficace atterramento di specifiche regioni, come l'anello del nervo nella regione cefalica, contribuendo così a identificare i ruoli di questi sistemi in processi quali la locomozione.

Un metodo per l'immobilizzazione su chip di c. elegans individui senza la necessità di anestesia è stato sviluppato per consentire microbeam irradiazione⁴. Inoltre, per migliorare il chip microfluidici utilizzato nel precedente studio⁴, abbiamo recentemente sviluppato chip microfluidici bagnabile, ione-penetrabile, polidimetilsilossano (PDMS), indicato come fogli di vite senza fine (Vedi Tabella materiali), per immobilizzazione di c. elegans individui⁹. Questi comprendono lenzuola morbide ultra-sottile (spessore = 300 µm; larghezza = 15 mm; lunghezza = 15 mm) con più canali microfluidici dritto (20 o 25) (profondità = 70 µm; larghezza = 60 µm o 50 µm; lunghezza = 8 mm) sulla superficie (Figura 1A-D). I canali microfluidici sono aperti e permettere agli animali di più di essere racchiuso tra loro simultaneamente (Figura 1E). I fogli sono resistenti per permettere i canali microfluidici essere ampliato (da ~ 10%, Figura 1,F), e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali.

I canali non fanno male i vermi quando sono essere racchiusi o quando sono stati raccolti. Inoltre, i fogli sono realizzati da PDMS, che è essenzialmente idrofobico, ma ritenzione idrica può essere raggiunto da impartire idrofilia del materiale. La ritenzione idrica e lo spessore sono caratteristiche favorevoli dei fogli vite senza fine. La capacità di ritenzione idrica previene la disidratazione degli animali dopo immobilizzazione prolungata e consente osservazioni a lungo termine da effettuarsi.

Inoltre, come descritto in precedenza⁹, i fogli sono solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti come gli ioni di carbonio (con un intervallo di circa 1 mm di acqua) di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali. In questo modo le particelle di ioni per essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Inoltre, i fogli della vite senza fine possono essere riutilizzati e sono così economici. Con il metodo di iniezione convenzionali, gli animali racchiusi a volte sono morti e non possono essere prese fuori del canale; le uova possono anche ostruire i canali. Questo rende inutilizzabile il chip. Chip sono, pertanto, fondamentalmente USA e getta e il rapporto costi-benefici rapporto è scarsa.

Nella carta attuale, descriviamo dettagliatamente una serie di metodi per l'immobilizzazione su chip di streaming in c. elegans individui che utilizzano fogli di vite senza fine. Mediante saggi di locomozione degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip, abbiamo valutato il film di copertura adeguata. Inoltre, abbiamo mostrato gli esempi di immobilizzazione su chip per imaging osservazioni sia microbeam irradiazione.

Protocol

1. ceppi e manutenzione

1. Selezionare un ceppo adatto di c. elegans ed Escherichia coli (cibo) a seconda dello scopo dell'esperimento.
   Nota: Nel presente documento, è generalmente utilizzato selvaggio-tipo N2¹⁰c. elegans (Figura 2A) e HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V¹¹ è impiegato esclusivamente per analisi di imaging. E. coli OP50 è stato utilizzato come alimento per c. elegans. Alcuni mutanti con forma anomala del corpo, ad esempio il mutante di unc-119(e2498) III con una forma a spirale (Figura 2B), possono essere racchiuso nei canali microfluidici dritto (Figura 2C).
2. Mantenere la c. elegans a 20 ° C su cm 6 capsule di Petri contenente 10 mL di mezzo di sviluppo del nematode (NGM) sparsa con pernottamento-incubate (37 ° C) e. coli come descritto in precedenza¹⁰. Se possibile, sincronizza le fasi di sviluppo di c. elegans allo stadio embrionale.
3. Utilizzare ben nutriti animali adulti, circa il 3-4 giorni dopo la schiusa con una larghezza di circa 50-60 µm, che sono perfettamente adattati alle dimensioni dei canali microfluidici nei fogli di vite senza fine.

2. selezione di soluzione tampone per immobilizzazione su chip

1. Per i fogli di verme bagnabile, utilizzare qualsiasi soluzione tampone a seconda dello scopo degli esperimenti.
   Nota: Soluzioni tampone adatto per immobilizzazione su chip su PDMS microfluidic chip sono stati definiti in precedenza⁹ e le seguenti soluzioni tampone sono state indicate per non avere alcun effetto sulla motilità degli animali dopo immobilizzazione: buffer basale di S soluzione (5,85 g di NaCl, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 50 mL di fosfato di potassio a pH 6.0 di 1 M, H₂O a 1 L; sterilizzati in autoclave)¹⁰ contenente una grande quantità di NaCl, soluzione tampone fosfato a M9 (5 g di NaCl , 3 g di KH₂PO₄, 6 g di Na₂HPO₄, 1 mL di 1 M MgSO₄, H₂O a 1 L; sterilizzati in autoclave)¹⁰, soluzione tampone di lavaggio (5 mL di fosfato di potassio a pH 6.0 di 1 M, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄, 0,5 g di gelatina di pf, H₂O a 1 L; sterilizzati in autoclave)¹² contenente gelatina e acqua ultrapura⁹. Nel presente documento, soluzione tampone di lavaggio viene in genere utilizzato e soluzione tampone basale S solo è impiegato per la valutazione di immobilizzazione su chip utilizzando film copertina diversa nella sezione 3.
2. Per il chip microfluidici convenzionali senza bagnabilità, utilizzare una soluzione di tampone di lavaggio, che fornisce il mezzo più efficace di mantenere l'umidità nei canali microfluidici del chip e quindi impedisce la secchezza di c. elegans individui ( indipendentemente dal fatto la bagnabilità dei chip microfluidici).

3. selezione di film di copertura adatto per immobilizzazione su chip

1. Preparare il film copertina diversa come segue. Basato sulla facilità di movimentazione, tagliare il seguente trasparente, film di copertura biocompatibile adatto ad una dimensione (cioè, larghezza di 10-15 mm e lunghezza di 30-50 mm): 130-170 µm spessore copertura in vetro e poliestere (PET) 125 µm spessore film ~ 130 µm spessore polistirene (PS) pellicola.
2. Eseguire immobilizzazione su chip 3h con diversa copertina film come segue. Basato su passaggi 4.1-4.6, racchiudere ≥ 10 lavato animali adulti (3,5 giorni dopo la schiusa) nel foglio worm utilizzando ogni film di copertura, rispettivamente e lasciare per 3 h.
3. A fini comparativi, consentire 3h di libera circolazione come segue. ≥ 10 posto lavato animali adulti su una zolla di 3,5 cm contenente 3 mL fresco NGM, coprire con un coperchio e lasciare per 3 h.
4. Raccogliere gli animali immediatamente dopo 3 ore di immobilizzazione su chip secondo passi 5.1-5.3. Rimuovere la pellicola di copertura dal foglio di vite senza fine e aggiungere una goccia di soluzione tampone per ogni animale. Pick up animali nuoto a goccia utilizzando un selettore di platina e trasferirli su un piatto di 3,5 cm contenente 3 mL fresco NGM senza cibo (piastra di dosaggio).
5. Raccogliere gli animali dopo 3 ore di libera circolazione. Aggiungere una goccia di soluzione tampone per ogni animale. Pick up animali nuoto nella goccia sulla piastra NGM e trasferirli su un piatto di analisi utilizzando un selettore di platina.
6. Valutare gli effetti del film di copertura sulla motilità (analisi della locomozione).
   1. Almeno 5 min dopo il trasferimento alla piastra di dosaggio, conteggio ' curve (definito come il numero di piegature nella regione anteriore del corpo a intervalli di 20-s) manualmente sotto un microscopio¹³del corpo.
   2. Svolgere analisi di locomozione cinque volte in modo indipendente per ogni film di copertura.
      Nota: Negli esperimenti mostrati nei risultati rappresentativi, 10 animali sono stati valutati per ogni esperimento in cui più animali venivano chiusi contemporaneamente, rispetto agli animali solo cinque contati nel precedente studio¹³.
   3. Calcolare il numero medio di curve del corpo per i 10 animali in ogni gruppo per ogni esperimento. Quindi media dei valori da cinque esperimenti indipendenti per valutare gli effetti di immobilizzazione su chip. Analizzare i dati statisticamente utilizzando un test di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) in un software di foglio di calcolo a livelli di significato di 0,01 e 0,05.
      Nota: Basato su questi esperimenti, un film di copertura di PS con permeabilità all'ossigeno alta è stato ritenuto idoneo (Vedi i risultati rappresentativi). Questi film di PS sono inclusi con i fogli della vite senza fine. Film PET, che ha permeabilità all'ossigeno basso, non è stato ritenuto adatto, perché gli animali tendevano a soffocare se coperto con esso durante immobilizzazione a lungo termine sui fogli della vite senza fine. È anche importante che il film di copertura non si rompono durante una serie di procedure; vetro copre anche erano pertanto non idonei (Vedi i risultati rappresentativi).

4. on-chip di immobilizzazione

Nota: Indossare guanti monouso, sterile per evitare di contaminare i fogli della vite senza fine.

1. Collocare un foglio trasparente sottile come un film di copertura di PS o vetro che non ha nessun autofluorescence, per uso come una pellicola di copertura inferiore, sulla scrivania sperimentale o la fase microscopica. Mettere un foglio di vite senza fine delicatamente sul film di copertura inferiore usando la pinzetta piatta.
   Nota: Oltre i fogli di vite senza fine con 60 canali microfluidici µm-wide (adatti per gli adulti 3-4 giorni dopo la schiusa), fogli con 50 µm-wide canali (adatti per giovani adulti 3 giorni dopo la schiusa e mutanti con piccolo corpo in fase adulta) possono anche essere impiegati. Selezionare un foglio adatto basato sulla dimensione degli animali per essere utilizzato.
2. Per raccogliere gli animali, raccogliere un singolo adulto c. elegans dalla piastra di coltura sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un selettore di platina. Ripetere il processo se sono necessari più animali.
3. Lavare gli animali per rimuovere cibo (batteri).
   1. Posizionare almeno tre gocce (5 µ l gocce) di soluzione tampone sulla superficie di un piatto di Petri di non trattata 6 cm (idrorepellente).
   2. Trasferire gli animali a una gocciolina di utilizzo di un selettore di platina e consentire loro di rimuovere qualsiasi cibo a nuoto. Li lavi due volte in due goccioline separate e quindi risciacquare gli animali in un'altra goccia.
      Nota: È necessario praticare questa procedura per essere in grado di eseguire rapidamente prima di effettuare qualsiasi esperimenti.
4. Goccia 2-3 µ l di soluzione tampone sulla superficie di un foglio di vite senza fine. Raccogliere gli animali lavati dalla goccia su di Petri e trasferirli alla goccia sul foglio di vite senza fine.
5. Racchiudere gli animali canali microfluidici come segue. Posizionare un film di copertura di PS sopra il foglio di verme con una pinzetta piatta e premere delicatamente sopra i canali da un'estremità del foglio a altro per mantenere l'umidità (come descritto in precedenza^4,9).
   Nota: Gli animali sono racchiusi in modo casuale nei canali. Goccioline contenenti animali sono distribuite attraverso il foglio di vite senza fine coprendo il foglio, conseguente goccioline ampiamente estese su diversi canali. Ogni animale può essere racchiusa in uno di questi canali. Il punto importante per quanto riguarda l'uso del foglio di vite senza fine per immobilizzazione su chip è che più canali sono disponibili in una vasta area.
6. Immediatamente dopo che racchiude gli animali nei canali microfluidici, confermare che sono vivi controllando per il movimento della testa sotto un microscopio (ad es., 1 x o 2 ingrandimenti).
7. Registrare la posizione dell'animale, allo stesso tempo come eseguito il punto 4.6 e notare quanto segue su un foglio dedicato (complementare File 1): numero del canale in cui è racchiuso l'animale; posizione di ogni animale nel canale (sinistra/centro/destra); e la direzione della testa.
8. Disegnare una freccia per contrassegnare la posizione di ogni animale nel canale, con la direzione della freccia corrispondente per la testa dell'animale.
   Nota: I numeri di canale (ad es., 1, 5, 10, 15, 20, 25) sono incisi sulla superficie del foglio verme vicino ai bordi sinistro e destro dei canali microfluidici (Figura 1B). Queste informazioni sul foglio dedicato permette animali di essere collocato in fretta, rendendo il processo più efficiente e aiuta anche a prevenire la fuoriuscita di radiazioni durante i passaggi successivi.

5. raccolta di animali provenienti da un foglio di vite senza fine

1. Immediatamente dopo immobilizzazione, rimuovere la pellicola di copertura dal foglio verme con una pinzetta piatta.
2. Goccia di 10-15 µ l di soluzione tampone sui canali microfluidici che racchiude gli animali e osservare gli animali iniziando a nuotare nelle gocce sotto un microscopio stereoscopico.
   Nota: Gli animali iniziano nuoto nella gocciolina di nuova il proprio senza alcun ulteriore pressione, aiuto o push. Basta cadere alcuni buffer in cima loro è sufficiente per farli nuotare fuori del canale. Un animale può essere incapace di nuotare in una goccia se è stato danneggiato vitale da irradiazione nel passaggio 7,9 o dal processo di immobilizzazione in passaggi 4.2-4.5, anche se questo è raro. Inoltre, se l'animale rimane attaccata alla pellicola di copertura quando viene rimosso, è possibile aggiungere le goccioline sulla pellicola di copertura anziché nei canali.
3. Raccogliere gli animali nuoto a goccia utilizzando un selettore di platina e adagiateli su un piatto di dosaggio.

6. applicazione di fogli di vite senza fine per l'imaging di osservazioni

Nota: Fogli di vite senza fine possono essere ampiamente usati in osservazioni al microscopio. Il chip può trattenere l'acqua e non influisce la motilità di c. elegans individui dopo 3 h di immobilizzazione su chip⁹. Inoltre, il chip stesso non ha nessun autofluorescence, che lo rende adatto per l'uso in analisi di imaging di fluorescenza. Un'applicazione di esempio per l'analisi di formazione immagine di fluorescenza è riportata qui sotto.

1. Selezionare un microscopio a fluorescenza e montare una fotocamera digitale o videocamera digitale sul microscopio per catturare immagini o video, rispettivamente (Figura 3A).
   Nota: La distanza di lavoro (WD) del microscopio è superiore a 0,2 mm a seconda delle specifiche dell'obiettivo (Vedi Figura 3B, C). Le specifiche dell'apparato del microscopio di fluorescenza utilizzato in questa carta sono riportate nella Tabella materiali. Tuttavia, la specifica non è limitata al nostro esempio, perché si basa sullo scopo di osservazione o / e gli utenti.
2. Selezionare qualsiasi ceppo fluorescente di c. elegans e mantenere come descritto nella sezione 1.
   Nota: Se è necessario osservare la contrazione muscolare del corpo-parete (Vedi risultati rappresentativi), utilizzo di giovane adulto HBR4¹¹c. elegans, in cui un gene reporter viene utilizzato per esprimere l'indicatore di calcio GCaMP3.35 in tutte le cellule di muscolo del corpo-parete. È importante utilizzare giovani adulti (≤ 3 giorni dopo la schiusa) che sono più sottili rispetto alla larghezza dei canali microfluidici (50 o 60 µm) del foglio di vite senza fine. Il piccolo grado della clearance significa che gli animali possono piegare leggermente, rendendo possibile osservare la contrazione muscolare e l'estensione durante la scansione, utilizzando un indicatore di ioni calcio.
3. Svolgere il recinto degli animali secondo la procedura di immobilizzazione nella sezione 4.
4. Osservare macchie fluorescenti di animali (per esempio, verde fluorescente proteina-identificati ceppi) utilizzando un microscopio a fluorescenza e catturare immagini utilizzando una fotocamera digitale montata sul microscopio.
   Nota: Seguire i metodi precedentemente stabilito^14,15,16, poiché i metodi di osservazione del microscopio (tra cui osservazione fluorescenza) e la specifica del sistema microscopio dipende lo scopo dell'osservazione.
5. Propagazione delle onde in ioni di calcio immagine utilizzando acquisizione video per osservare le attività dinamiche, come la contrazione muscolare corpo-parete e l'estensione nel HBR4 worms (Video 1).

7. applicazione di fogli di vite senza fine per irradiazione microbeam

Nota: Il collimatore microbeam irradiazione system⁵ può utilizzare diverse particelle di ioni pesanti accelerate da azimutalmente vari ciclotrone campo installato presso gli acceleratori di ioni di Takasaki per facilità di applicazione avanzata di radiazione (TIARA) di QST-Takasaki (Figura 4A). C'è una fase automatica per irradiazione sotto l'uscita del fascio (Figura 4B). La procedura per ioni pesanti microbeam irradiazione di c. elegans usando questo sistema è come segue.

1. Individuare il foglio di vite senza fine che racchiude più animali su un telaio in alluminio su misura per l'impianto di microbeam-irradiazione e impostarlo sulla scena automatica per irradiazione (Figura 4C).
2. Raccogliere il campione di irradiazione (cioè, animali racchiusi in un foglio di vite senza fine su un telaio), a immediatamente sotto uscita (~ 2 mm) il fascio basato sull'immagine sul monitor da un microscopio situato sotto il palco automatico (Figura 4D).
3. Dopo il posizionamento verticale, individuare ogni animale a destinazione con l'irradiazione di microbeam utilizzando il software su misura per irradiazione mirata di animali e colture cellulari. Per individuare ogni animale racchiuso tra il canale di microfluidica, consultare la scheda dedicata descritta nel passo 4.7-4.8 (Vedi supplementari File 1) e confermare il numero del canale vicino ai bordi sinistro e destro dei canali.
4. Controllare la fase automatica in X e Y indicazioni per posizionare gli animali appena sotto la trave uscita utilizzando un sistema di controllo remoto e un mouse laser operati con il software di irradiazione.
5. All'incirca sintonia della zona di irradiazione guardando la proiezione dal microscopio situato sotto il palco automatico del campione e spostando il cursore nella posizione di irradiazione dell'animale per essere mirati.
6. Dopo il posizionamento del grezzo, uscire e chiudere la camera di irradiazione e spostare la camera di controllo adiacente per evitare d'irradiazione degli operatori.
7. Impostare il numero desiderato di particelle di ioni per una procedura di irradiazione, corrispondente all'irradiazione di una regione specifica dell'animale, utilizzando la console di connessi a un sistema di ioni-contatore.
   Nota: Si tratta di uno scintillatore plastico e un moltiplicatore di fotoelettroni nel sistema a irraggiamento microbeam collimatore.
8. Dalla sala di irradiazione-controllo, ottimizzare la posizione degli animali sulla base dell'immagine del monitor dal microscopio situato sotto il palco automatico, che è la stessa immagine proiettata sul monitor dentro la camera di irradiazione (Figura 4E).
9. Destinazione l'irradiazione microbeam cliccando il pulsante di irradiazione del software per irradiazione.
   Nota: Nell'esempio mostrato nella Figura 4F, ci rivolgiamo alla faringe nella regione cefalica e irradiare con il numero appropriato di ioni carbonio microbeam. Poiché viene contato il numero di particelle di ioni passando attraverso il campione utilizzando un sistema di ioni-contatore collegato alla console e il software di irradiazione, l'irradiazione viene interrotta dopo la consegna del numero desiderato di particelle di ioni.
10. Individuare ogni animale registrato sul foglio dedicato e svolgere irradiazione mirata per ogni animale. Ripetere i passaggi 7,8 e 7,9 per tutti gli animali sono stati irradiati.
11. Immediatamente dopo l'irradiazione, entra nella camera di irradiazione e abbassare il tavolino di irradiazione automatico. Rimuovere l'esempio sul telaio su misura che si trova sulla scena automatica.
12. Raccogliere gli animali come descritto ai punti 5.1-5.3.
13. Effettuare analisi comportamentali e/o molecolari come richiesto per valutare gli effetti dell'irradiazione mirata, a seconda dello scopo dello studio.
    Nota: Il dosaggio di locomozione descritto al punto 3.6 è un metodo efficace per valutare gli effetti dell'irradiazione su motilità^4,9.

8. trattamento dei fogli della vite senza fine per uso ripetuto

Nota: Fogli di vite senza fine possono essere usato ripetutamente almeno 10 volte⁹ senza effetti negativi sugli animali se puliti e sterilizzati correttamente dopo l'uso come segue.

1. Pulizia
   1. Posizionare il foglio usato verme su un 6cm di Petri e rilasciare circa 100 µ l di acqua ultrapura sterilizzata sul foglio intero.
   2. Paddle l'acqua sulla superficie del foglio utilizzando guanti dita per lavare via la sporcizia come polvere, cibo batterico e tutte le uova di cui i canali.
   3. Asciugare l'umidità dei fogli della vite senza fine accuratamente con salviette monouso.
2. Sterilizzazione
   1. Iniettare circa 5 mL di etanolo al 70% di Petri contenente il foglio di vite senza fine e pagaia la superficie del foglio usando le dita guantate per lavare via lo sporco.
3. Essiccazione
   1. Rimuovere i trucioli di Petri riempito con etanolo al 70% e lasciare per asciugare naturalmente.
4. Deposito
   1. Dopo l'essiccazione, posizionare il foglio di vite senza fine su una piastra Petri sterile e coprire. Fogli possono anche essere memorizzati su una piastra Petri sterile riempito con etanolo al 70%.
      Nota: È preferibile smaltire le pellicole di copertura dopo l'uso, ma se essi sono di essere riutilizzati, pulirli come fatto per il foglio di vite senza fine. Tuttavia, se pieghe sviluppano il film di copertura dopo l'uso non aderirà al chip, conseguente disidratazione degli animali, e pertanto deve essere sostituito.

Representative Results

Attivo di c. elegans individui potrebbero essere immobilizzati con successo usando un ultra-sottile, bagnabile PDMS, chip microfluidico (foglio di vite senza fine). Abbiamo studiato l'idoneità delle pellicole di copertina diversa per sigillare il foglio di vite senza fine, come descritto nel protocollo sezione 3. Per valutare gli effetti di tenuta dei film copertura, abbiamo determinato la motilità degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip con copertura in vetro (spessore: 130-170 µm), pellicola dell'animale domestico (spessore: 125 µm) e film di PS (spessore: ~ 130 µm), rispettivamente. Come illustrato nella Figura 5, non c'era differenza significativa nella motilità (corpo curve) tra gli animali di controllo ha permesso di muoversi liberamente per 3 h e animali racchiusi tra il foglio di vite senza fine con film di PS. Al contrario, motilità è stata ridotta significativamente in animali racchiusi sotto una copertura in vetro. Alcuni animali sono sembrato avere asciugato, suggerendo che il vetro di copertura respinse la gocciolina, impedendo una guarnizione stretta e permettendo agli animali di parzialmente asciugare fuori, con conseguente ridotta motilità. La motilità degli animali racchiusi utilizzando una pellicola dell'animale domestico è stato anche significativamente diminuita; anche se è stata osservata nessuna essiccazione, motilità degli animali ha teso a diminuire in modo uniforme, suggerendo che la velocità di trasmissione di ossigeno basso (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), che è circa 100 volte inferiore a quella di PS, causato agli animali di soffocare. Questi risultati indicano che coprono PS film dovrebbe essere usato per racchiudere gli animali nel foglio di vite senza fine.

Abbiamo anche applicato la tecnica di foglio di vite senza fine per osservazioni di imaging ed eseguire regione-specific microbeam irradiazione. Immobilizzazione su chip con un foglio di vite senza fine con ritenzione idrica e nessun autofluorescence era adatto per l'osservazione al microscopio in condizioni live. Ad esempio, abbiamo applicato la tecnica al ceppo HBR4¹¹ di c. elegans, in cui un gene reporter espresso l'indicatore di calcio GCaMP3.35 in tutte le cellule di muscolo del corpo-parete. Abbiamo osservato le attività di tutte le cellule di muscolo di parete del corpo in animali adulti, giovani a ≤ 3 giorni post-schiusa in fogli di vite senza fine con 50 canali microfluidici µm-wide, che ha permesso che gli animali lo spazio per piegare leggermente. L'intensità di segnale GCaMP3.35 nel ceppo HBR4 corrisponde alla contrazione delle cellule muscolari corpo-parete. Il Ca^{2 +} propagazione dell'onda corrisponde all'attività muscolare è stato chiaramente osservata (Video 1). Inoltre, abbiamo confermato che il foglio di verme non aveva nessun autofluorescence come mostrato nell'ultima fase (ultimo ~ 10 s) del Video 1. In questo modo, la mancanza di necessità di anestesia possono le attività fisiologiche delle cellule del muscolo devono essere rispettate condizioni dal vivo.

Inoltre, abbiamo applicato il foglio di vite senza fine per regione-specific microbeam irradiazione degli individui di c. elegans . Più canali microfluidici dritto sul foglio verme ammessi più animali essere immobilizzato contemporaneamente, senza la necessità di anestesia, consentendo in tal modo sequenza irradiazione di ≥ 20 animali (sufficiente per un'analisi di gruppo) in breve tempo (30 min per 20 individui).

Figura 1 : Schematico di un foglio di worm. Panoramica di (A) di un foglio di vite senza fine con una moneta del centesimo americano 1 per scala. Il foglio di verme era 300 µm di spessore 15 mm, larghezza e lunghi 15 mm. (B) la superficie del foglio verme contenuto 25 canali microfluidici dritto (profondità = 70 µm; larghezza = 60 µm; lunghezza = 8 mm). Schema (C) dei campioni rappresentati dal film di copertura inferiore, il foglio di vite senza fine e il film di copertura. (D) il foglio di vite senza fine è un morbido, ultra-sottile foglio fatto da PDMS e può essere piegato pizzicando con una pinzetta piatta. (E) esempio di più animali racchiusi in più canali. (F) espansione di un canale di microfluidica spingendo con un selettore di platina. L'elasticità del canale permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Forma di c. elegansdel corpo. (A) Wild-type (N2) di c. elegans su una piastra di NGM. (B) un mutante di unc-119 con forma anomala su una piastra di NGM. (C) l' unc-119 mutanti racchiusi nei canali microfluidici del foglio verme. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Schemi di osservazione del microscopio di vivono gli individui di c. elegans racchiusi tra il foglio di worm. (A) schema del sistema stereomicroscopio per osservazioni di imaging. (B) schema di osservazione del microscopio del worm foglio inclusione diretta di c. elegans individui. (C) vista in sezione del worm foglio inclusione diretta di c. elegans individui disposto sulla fase di microscopio. W.D. indica la distanza di lavoro del microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Disegno schematico della collimazione microbeam sistema a QST-Takasaki e procedura di irradiazione microbeam mirati per vivere gli individui di c. elegans . (A) Panoramica del collimatore microbeam irradiazione sistema⁵, che può utilizzare diverse particelle di ioni pesanti accelerate da azimutalmente vari ciclotrone campo installato presso la TIARA di QST-Takasaki. Panoramica (B) l'uscita del fascio e la fase automatica per irradiazione. (C) impostazione sulla scena automatico del sistema microbeam collimatore di esempio. (D) il posizionamento verticale del campione irradiazione condotto nella camera di irradiazione. (E) messa a punto della zona di irradiazione condotto nella sala di controllo di irradiazione. (F) Targeted microbeam irradiazione di streaming in c. elegans. La faringe è stato scelto in quanto la posizione mirata ed irradiati premendo il pulsante di irradiazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Motilità di c. elegans dopo immobilizzazione su chip con copertura in vetro, pellicola di poliestere (PET) e film di polistirene (PS). Le barre indicano curve corporeo medio degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip o libera circolazione per 3 ore su una piastra NGM (controllo). Dieci animali sono stati esaminati e corpo curve erano una media tra ogni gruppo. Infine, dati da cinque esperimenti indipendenti sono stati in media per ogni gruppo. Barre di errore rappresentano errore standard della media dei cinque esperimenti indipendenti. Tutti i dati sono stati analizzati usando il One-way ANOVA a 0.05 (*) o livello di significatività di 0.01 (*). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: esempi di imaging osservazioni di attività muscolare in C. elegans racchiuso in un foglio di worm. Propagazione dell'onda di ioni calcio corrispondente alla contrazione delle cellule muscolari corpo-parete durante la ricerca per indicizzazione in individui HBR4 c. elegans , racchiusi in un foglio di vite senza fine. Le ultime 10 ~ s sono stati osservati sotto illuminazione in campo chiaro. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Complementare File 1: esempio di dedicato foglio di carta (versione di irradiazione microbeam). Disegnare una freccia per indicare la posizione di ogni animale nel canale. La direzione della freccia corrisponde alla testa. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Immobilizzazione su chip di c. elegans in condizioni dal vivo utilizzando un bagnabile PDMS microfluidic chip consente l'irradiazione efficiente microbeam mirata di più animali. La facilità di movimentazione e caratteristiche per evitare l'essiccazione rendono questo sistema adatto per applicazioni non solo in microbeam irradiazione, ma anche in diversi saggi comportamentali. Questi fogli di vite senza fine sono già stati commercializzati e possono essere facilmente ottenuti. Chip microfluidici convenzionali, quali i circuiti integrati olfattivi, sono associati con problemi tra cui intasamento di animali e uova nei canali microfluidici chiuso rendendo difficile raccogliere gli animali, e così questi chip tendono ad essere USA e getta, quindi l'aumento del costo. Al contrario, i canali microfluidici nel foglio corrente worm sono aperti, rendendo più facile per raccogliere gli animali. Questi fogli di vite senza fine possono pertanto essere utilizzati ripetutamente, che li rende più economico.

Recenti innovazioni tecnologiche nel chip microfluidici PDMS hanno mostrato una tendenza all'aumento di complessità strutturale e multifunzionalità^{16,18,19,20,21, 22,23}. Tuttavia, riteniamo che sia importante rendere il sistema semplice e facile da usare. Infatti, in contrasto con l'uso di convenzionale grande microfluidic chip^{19,20,21,22,23} che richiedono il collegamento di una pompa a vuoto, le piccole dimensioni e design semplice dei fogli worm consentono procedure dovranno svolgersi facilmente all'interno di uno spazio limitato.

Le prestazioni di ritenzione di acqua dei fogli verme consentono osservazioni a lungo termine da effettuarsi. Inoltre, lo spessore del foglio permette agli ioni particelle di passare attraverso i campioni, consentendo in tal modo mirato irradiazione da applicare per vivere gli individui di c. elegans con un preciso numero di particelle di ioni. Questi vantaggi i fogli della vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.

Noi crediamo che sia importante per i biologi a sviluppare nuove attrezzature e metodi per migliorare l'efficienza dei loro esperimenti e analisi. I fogli della vite senza fine e microbeam irradiazione software sono stati sviluppati con questo obiettivo in mente e hanno il potenziale per contribuire al successo dei futuri esperimenti innovativi oltre loro obiettivi originali.

Al meglio della nostra conoscenza, il nostro gruppo è il primo a sviluppare questa tecnologia in tutto il mondo. Tuttavia, suo uso standardizzato in futuro faciliterà l'applicazione di irradiazione microbeam mirati per gli animali in condizioni live, contribuendo così a identificare i ruoli di cellule/tessuti specifici nei processi interni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans wild-type strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	N2	Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	CB4845	C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape
C. elegans transgenic strain HBR4	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	HBR4	The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	OP50	E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM17-0001	Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper
Worm Sheet 60	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001	Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C.
Worm Sheet 50	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0002	Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C.
MICRO COVER GLASS	MATSUNAMI GLASS IND. LTD.	C030401	Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film	Biocosm, Inc., Hyogo, Japan	BCM18-0001/ BCM18-0002	Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror	TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan	Lumirror T60 (t 125 µm)	PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-060	Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).	1010-035	Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q	Merck, France		Ultrapure water
Kimwipe S-200	Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan	62020	120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick	Genesee Scientific Corporation, CA, USA)	59-AWP	Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX16	Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX2-ILLB	This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO1×PF	NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SDFPLAPO2XPFC	NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	U-LH100HG	The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan	SZX2-FYFPHQ	Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM	CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan		EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013	Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA		EXCEL Software used for statistical analyses