Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Иммобилизации живой Caenorhabditis elegans лиц с использованием ультратонкие полидиметилсилоксан Microfluidic чип с удержанием воды

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

Чтобы позволить целевой облучения живых Caenorhabditis elegans был создан ряд методов иммобилизации лиц с использованием недавно разработанных ультратонкий полидиметилсилоксан microfluidic чип с удержанием воды. Этот роман иммобилизации на чипе также является адекватным для визуализации наблюдений. Объяснил подробно лечения и примеры применения чипа.

Abstract

Излучение широко используется для биологических приложений и ионно лучевые размножения, и среди этих методов Микролучевой облучения представляет собой мощное средство идентификации радиочувствительным сайтов в живых организмах. Этот документ описывает ряд методов иммобилизации на чипе, разработанных для целевых Микролучевой облучения живых лиц Caenorhabditis elegans. В частности лечение чипов microfluidic полидиметилсилоксан (PDMS), которые мы ранее разработанных для иммобилизации C. elegans лиц без необходимости для анестезии, подробно. Этот чип, упоминаемый как червь лист, эластичные чтобы microfluidic каналы будет расширена, и эластичность позволяет животных, чтобы мягко обволакивает. Кроме того благодаря способности самостоятельной адсорбции PDMS, животные могут быть герметизированы в каналах, покрывая поверхности листа червя с тонкой обложки фильма, в котором животные не вставлен в каналы для корпуса. Путем поворачивать крышку пленку над, мы можем легко собирать животных. Кроме того червь лист показывает удержания воды и позволяет C. elegans лица могут подвергаться микроскопические наблюдения для длительных периодов под напряжением. Кроме того лист находится всего в 300 µm толщиной, позволяя тяжелых ионов, например ионов углерода пройти через лист, включающего животных, таким образом позволяя ионных частицы выявляться и прикладной лучевая точно измерить. Потому что выбор фильмов обложки, используемые для ограждающих животных очень важно для успешной долгосрочной иммобилизации, мы провели отбор подходящего покрытия фильмов и показан рекомендуемый один среди некоторых фильмов. В качестве примера приложения чипа мы ввели изображений наблюдения мышечной деятельности животных, включающего microfluidic канал червь листа, а также Микролучевой облучения. Эти примеры показывают, что червь листы значительно расширили возможности для биологических экспериментов.

Introduction

Излучения, в том числе рентген, гамма-лучи и тяжелых ионный луч, широко используется для биологических приложений, таких как в диагностика и лечение рака и ионно лучевые разведения. Многочисленные исследования и технические разработки в настоящее время сосредоточены на последствия радиации1,2,3. Микролучевой облучения является мощным средством выявления радиочувствительным сайтов в живых организмов4. Такасаки Advanced излучения исследовательский институт национальных институтов для квантовой и радиологической науки и техники (QST-Такасаки) занимается разработкой технологии чтобы облучить отдельных ячеек под микроскопические наблюдения с использованием тяжелых Ион microbeams5и создала методы, позволяющие целевых Микролучевой облучения нескольких модель животных, таких как нематоды Caenorhabditis elegans4,6, шелкопряда7и Oryzias latipes (японской оризии)8. Целевые Микролучевой облучения нематоды C. elegans позволяет эффективного нокдаун конкретных регионов, таких как нерв кольцо в регионе головы, тем самым помогая определить роли этих систем в ходе процессов таких как локомоции.

Чтобы позволить Микролучевой облучения4был разработан метод для иммобилизации на чипе C. elegans лиц без необходимости в анестезии. Кроме того чтобы улучшить microfluidic чипы используются в предыдущем исследовании4, мы недавно разработали смачиваемые, Ион проницаемые, полидиметилсилоксан (PDMS) microfluidic фишки, именуемые как червь листов (см. Таблицу материалы), для иммобилизирующие C. elegans лиц9. Они включают в себя ультра-тонких листов мягкой (толщина = 300 мкм; ширина = 15 мм; длина = 15 мм) с несколькими каналами (20 или 25) прямой microfluidic (глубина = 70 мкм; ширина = 60 мкм или 50 мкм; длина = 8 мм) на поверхности (рис. 1A-D). Microfluidic каналы являются открытыми и позволяют несколько животных, чтобы быть заключены в них одновременно (рис. 1E). Листы являются устойчивыми чтобы microfluidic каналы быть расширен (~ 10%, Рисунок 1F), и эластичность позволяет животных, чтобы мягко обволакивает. Кроме того благодаря способности самостоятельной адсорбции PDMS, животные могут быть герметизированы в каналах, покрывая поверхности листа червя с тонкой обложки фильма, в котором животные не вставлен в каналы для корпуса. Путем поворачивать крышку пленку над, мы можем легко собирать животных.

Каналы не повредит червей, когда они прилагаются или когда они собраны. Кроме того листы изготовлены из PDMS, который является по существу гидрофобная, но задержка воды может быть достигнуто путем придания гидрофильность материала. Удержания воды и толщины являются благоприятные характеристики червь листов. Мощность удержания воды предотвращает обезвоживание животных после длительной иммобилизации и позволяет долгосрочных наблюдений осуществляться.

Кроме того как было описано ранее9, листы являются лишь 300 µm толщиной, позволяя тяжелых ионов, например ионов углерода (с диапазоном около 1 мм в воде) пройти через лист, включающего животных. Это позволяет ионных частицы выявляться и прикладной лучевая точно измерить. Кроме того червь листы могут быть повторно использованы и таким образом являются экономичными. С помощью метода обычных инъекций животные прилагается иногда мертвых, и они не могут быть приняты из канала; их яйца могут также закупоривают каналы. Это делает чип непригодными. Чипы, таким образом, в основном одноразовые и затрат выгод соотношение бедных.

В настоящем документе, мы подробно описать ряд методов для на чипе иммобилизации живой C. elegans лиц с использованием червь листов. Через локомоции анализов животных 3 ч после иммобилизации на чипе мы оценивали фильм подходящего покрытия. Кроме того мы показали примеры иммобилизации на чипе для визуализации замечания и Микролучевой облучения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. штаммы и техническое обслуживание

  1. Выберите подходящую штамм C. elegans и Escherichia coli (питание) в зависимости от цели эксперимента.
    Примечание: В настоящем документе, одичал тип N210C. elegans (рисA) обычно используется и HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' УТР, unc-119(+)] V11 применяется только для изображений пробирного. E. coli ОР50 был использован как пища для C. elegans. Некоторые мутантов с ненормальное фигуры, например unc-119(e2498) III мутант с свернутой формы (рис. 2B), также могут быть заключены в прямые microfluidic каналов (рис. 2C).
  2. Поддерживать C. elegans при 20 ° C на 6 см Петри, содержащие 10 мл нематоды роста среднего (НГМ) распространение с инкубированы всю ночь (37 ° C) E. coli как описано выше10. Если возможно синхронизируйте этапы развития C. elegans от стадии эмбриона.
  3. Использование хорошо кормят взрослых животных, примерно 3-4 дней после вылупления с шириной около 50-60 мкм, которые оптимально подходят для размера microfluidic каналов в листах червя.

2. Подбор буферного раствора для иммобилизации на чипе

  1. Для листов смачиваемые червь используйте любые буферного раствора в зависимости от цели экспериментов.
    Примечание: Подходит буферных растворов для иммобилизации на чипе на PDMS microfluidic фишки были определены ранее9 и иметь не влияет на моторику животных после иммобилизации были показаны следующие решения буфера: S базальной буфера решение (5.85 г NaCl, 1 мл холестерин (5 мг/мл в этиловом спирте), 50 мл 1 М pH 6.0 фосфат калия, H2O до 1 Л; стерилизован автоклавированием)10 , содержащий большое количество NaCl, M9 фосфатного буферного раствора (5 г NaCl , 3 g2PO х4, 6 g Na2HPO4, 1 мл 1 М MgSO4H2O до 1 Л; стерилизован автоклавированием)10, мыть буферный раствор (5 мл 1 М pH 6.0 фосфат калия, 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 1 М MgSO4, 0,5 г желатина pf, H2O до 1 Л; стерилизован автоклавированием)12 , содержащий желатина и ультрачистая вода9. В настоящем документе промывочный раствор буфера обычно используется, и S базальной буферного раствора используется только для оценки на чипе иммобилизации, используя различные обложки фильмов в разделе 3.
  2. Для обычных microfluidic чипов без смачиваемость используйте мыть буферный раствор, который обеспечивает наиболее эффективным средством поддержания влажности в каналах microfluidic чипа и таким образом предотвращает пересыхание C. elegans лиц ( независимо от того, смачиваемости microfluidic фишек).

3. подбор подходящего покрытия фильма для иммобилизации на чипе

  1. Приготовляют различные обложки фильмов следующим образом. Основанный на легкость обработки, вырезать следующее прозрачным, биосовместимые покрытия фильмов до подходящего размера (т.е., ширина 10-15 мм и длиной 30-50 мм): 130-170 мкм стекла толщиной покрытия, 125 мкм толщиной полиэстер (ПЭТ) фильм и ~ 130 мкм толщиной полистирол (PS) фильм.
  2. Выполните 3 h на чипе иммобилизации, используя различные обложки фильмов следующим. Основываясь на шагах 4.1-4.6, заключите ≥10 промывают взрослых животных (3,5 дней после вылупления) в листе червя, с использованием каждой обложки фильма, соответственно и оставить на 3 ч.
  3. Для целей сравнения позволяют 3 h свободного движения следующим образом. ≥10 место промывают взрослых животных на плите 3,5 см, содержащие 3 мл свежих NGM, накрыть крышкой и оставить на 3 ч.
  4. Соберите животных сразу после 3 h на чипе иммобилизации согласно шаги 5.1-5.3. Удалите из червь листа обложки фильма и добавить каплю буферного раствора для каждого животного. Забрать животных плавание в капли, используя средство выбора платина и перенести их к плите 3,5 см, содержащие 3 мл свежие NGM без пищи (пробирного плита).
  5. Соберите животных после 3 h свободного движения. Добавьте каплю буферного раствора для каждого животного. Забрать животных, купание в капли на пластину НГМ и перенести их в Пробирной пластину, используя средство выбора платина.
  6. Оцените эффекты обложки фильма на подвижность (локомоции проба).
    1. По крайней мере 5 минут после перевода в Пробирной пластины, Фото ' тела поворотах (определяется как количество изгибов в регионе передней тела каждые 20-s) вручную под микроскопом13.
    2. Осуществлять передвижение анализов пять раз независимо для каждой обложки фильма.
      Примечание: В экспериментах показано в результатах представительных, 10 животных были оценены для каждого эксперимента, в котором несколько животных были заключены одновременно, по сравнению с всего лишь пять животных, перечисленных в предыдущем исследовании13.
    3. Вычислите среднее количество изгибов тела для 10 животных в каждой группе для каждого эксперимента. Затем средняя значения из пяти независимых экспериментов для оценки влияние иммобилизации на чипе. Проанализируйте данные статистически с помощью теста односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) в таблицу программного обеспечения на уровне значимости 0,01 и 0,05.
      Примечание: На основе этих экспериментов, обложки фильма PS с высокой кислородной проницаемости было сочтено подходящим (см. Представитель результаты). Эти фильмы PS включены в червь листов. Пленка ПЭТ, который имеет проницаемость низким содержанием кислорода, не было сочтено подходит потому, что животные, как правило, задушить, если с ним во время долгосрочного иммобилизации на листах червь. Кроме того, важно, что обложки фильма не ломается во время серии процедур; стеклянные крышки были поэтому также неподобающе (см. Представитель результаты).

4. на чипе иммобилизации

Примечание: Одноразовые стерильные перчатки следует надевать, чтобы избежать загрязнения червь листов.

  1. Поместите тонкий прозрачный лист как PS или стеклянная крышка фильм, который имеет не аутофлюоресценция, для использования в качестве нижней крышки фильм, на экспериментальных бюро или стадии микроскопических. Поместите лист червь мягко на нижней обложки фильма с помощью плоский пинцет.
    Примечание: В дополнение к червь листы с 60 мкм всей microfluidic каналов (подходит для взрослых 3-4 дней после вылупления), могут быть использованы листы с 50 мкм общесистемной каналов (подходит для молодых взрослых 3 дней после вылупления и мутанты с небольшим телом в взрослой стадии). Выберите подходящий листа на основе размера животных, которые будут использоваться.
  2. Собирать животных, подобрать индивидуальный Взрослый C. elegans от культуры пластины под стереомикроскопом, используя средство выбора платина. Повторите этот процесс, если необходимо несколько животных.
  3. Мыть животных для удаления продуктов питания (бактерии).
    1. Место по крайней мере три капли (капли 5 мкл) буферного раствора на поверхности Петри 6 см-лечение (водоотталкивающим).
    2. Передать дроплета, используя средство выбора платина животных и дать им возможность удалить любой пищи вплавь. Мыть их дважды в двух отдельных капель, а затем промыть животных в другой капли.
      Примечание: Необходимо практиковать эту процедуру, чтобы иметь возможность быстро выполнять его перед выполнением каких-либо экспериментов.
  4. Капли 2-3 мкл буферного раствора на поверхность листа червь. Подобрать мыть животных от капли на Петри блюдо и передавать их на капли на листе червя.
  5. Заключите животных в microfluidic каналы как следовать. Поместите лист червя, используя плоский пинцет фильм крышки Л.С и осторожно нажмите через каналы от одного конца листа в другой для поддержания влажности (как описано ранее в4,9).
    Примечание: Случайно животных заключены в каналах. Капли, содержащие животные распределены по червь лист, покрывая листа, в результате капельки, широко распространяется через несколько каналов. Каждое животное может быть заключен в любой из этих каналов. Важный момент относительно использования листа червь для иммобилизации на чипе, что множественные каналы доступны на большой площади.
  6. Сразу же после ограждающих животных в каналах microfluidic, подтверждают, что они живы, проверяя для движения головы под микроскопом (например, 1 x или 2 x увеличение).
  7. Записать позицию животного, в то же время, как проведение шаг 4.6 и обратите внимание на выделенный лист бумаги (дополнительный файл 1) следующее: номер канала, в котором заключена животное; позиция каждого животного в канале (/ центр/влево); и направление головы.
  8. Нарисуйте стрелки для обозначения позиции каждого животного в канале, с направлением стрелки, соответствующий голова животного.
    Примечание: Номера канала (например, 1, 5, 10, 15, 20, 25) выгравированы на поверхности листа червь вблизи левого и правого краев microfluidic каналов (рис. 1Б). Эта информация на выделенный лист позволяет животных находиться быстро, что делает этот процесс более эффективным, а также помогает предотвратить утечки излучения во время последующих шагов.

5. коллекция животных из листа червь

  1. Сразу же после иммобилизации удалите обложки фильма из листа червя, используя плоский пинцет.
  2. Падение 10-15 мкл буфера раствор на microfluidic каналы, включающего животных и наблюдать за животными, начинают плавать в капельках под стереомикроскопом.
    Примечание: Животные начинают плавательный в новой капли на свои собственные без какого-либо дополнительного давления, помощь или толчок. Просто снижается некоторые буфера поверх их достаточно, чтобы сделать их плавать из канала. Животное может быть не в состоянии плавать в капли, если он был жизненно поврежден путем облучения в шаге 7,9 или процесс иммобилизации в шагах 4.2-4.5, хотя это редко. Кроме того если животное остается прикрепленным к обложки фильма, когда он удаляется, добавьте капель на обложки фильма вместо в каналы.
  3. Забрать животных, плавание в палитре платина капли и разместить их на плите пробирного.

6. применение червь листы для визуализации наблюдений

Примечание: Червь листы могут широко использоваться в микроскопические наблюдения. Чип может удерживать воду и не влияет на моторику C. elegans лиц после 3 h на чипе иммобилизации9. Кроме того сам чип имеет не аутофлюоресценция, что делает его пригодным для использования в флуоресцировании изображений анализов. Ниже приводится пример приложения для визуализации assay флуоресценции.

  1. Выберите флуоресцентным микроскопом и монтировать цифровой камеры или цифровой камеры видео на микроскопе для захвата изображения или видео, соответственно (рис. 3А).
    Примечание: Рабочая дистанция (WD) микроскопа является более чем на 0,2 мм в зависимости от спецификации объектива (см. Рисунок 3B, C). Спецификация Микроскоп флюоресценции, используемые в данном документе показана в Таблице материалов. Однако спецификация не ограничен к нашему примеру потому, что это зависит от цели наблюдения или / и пользователей.
  2. Выберите любой флуоресцентные штамм C. elegans и поддерживать как описано в разделе 1.
    Примечание: Если это необходимо соблюдать мышечного сокращения стенки тела (см. Представитель результаты), использовать молодых взрослых HBR411C. elegans, в котором Репортер ген используется для выражения кальция индикатор GCaMP3.35 во всех клетках мышцы стенки тела. Важно использовать молодых взрослых (≤3 дней после вылупления), которые тоньше, чем ширина microfluidic каналов (50 или 60 мкм) червь листа. Небольшая степень очистки означает, что животных можно согнуть немного, что делает его можно наблюдать во время обхода, мышечного сокращения и расширения с помощью индикатора кальций иона.
  3. Осуществляют корпус животных в порядке иммобилизации, в разделе 4.
  4. Соблюдать флуоресцентные пятна животных (например, Зеленый флуоресцентный белок меченых штаммы) с помощью микроскопа флуоресценции и захвата изображения с помощью цифровой камеры, установленной на микроскопе.
    Примечание: Следовать ранее установленные методы14,,1516, поскольку методы наблюдения микроскоп (включая флуоресценции наблюдения) и зависит от спецификации системы микроскопа Цель наблюдения.
  5. Изображение иона кальция волн с помощью видео приобретение соблюдать динамичной деятельности, например стенки тела мышечного сокращения и расширения в HBR4 червей (видео 1).

7. применение червь листы для Микролучевой облучения

Примечание: Коллиматорный Микролучевой облучения системы5 можно использовать несколько тяжелых ионных частицы, ускорился от azimuthally различной поле циклотрон, установлены в Такасаки Ион ускорители для повышенной радиации приложения (тиара) объекта QST-Такасаки (рис. 4A). Есть автоматический этап для облучения под выхода луча (Рисунок 4B). Процедура для тяжелых Ион Микролучевой облучения C. elegans с помощью этой системы заключается в следующем.

  1. Найдите лист червь, включающего несколько животных на алюминиевой раме под заказ для Микролучевой облучательной установки и установить его на автоматическое сцену для облучения (рис. 4C).
  2. Поднять облучения образца (т.е., животные, заключенный в листе червя на раме), непосредственно под выхода луча (~ 2 мм), основанный на изображение на мониторе с микроскопом, расположенный под автоматическое стадии (рис. 4D).
  3. После вертикальное позиционирование, найдите каждого животного к целевому объекту с Микролучевой облучения, с помощью специализированного программного обеспечения для целевых облучение животных и клеточных культур. Чтобы найти каждое животное, заключенный в канале microfluidic, обратитесь к выделенный лист, описанные в шаге 4.7-4,8 (см. дополнительный файл 1) и подтвердите номер канала вблизи края левого и правого каналов.
  4. Контроль автоматического этап в X и Y направления для размещения животных только под луч выхода с помощью системы дистанционного управления и лазерная мышь работает с программным обеспечением облучения.
  5. Примерно Мелодия области облучения, наблюдая проекции от Микроскоп находится в стадии автоматической выборки и перемещение курсора облучения позицию животного, чтобы быть направлены.
  6. После грубой позиционирования, выйти и закрыть номер облучения и двигаться в комнату рядом элемента управления, чтобы избежать облучающих операторы.
  7. Настройте желаемое количество частиц ионов для одной процедуры облучения, соответствующий облучения конкретного региона животного, с помощью консоли, связанные с системой Ион счетчик.
    Примечание: Это состоит из пластиковый сцинтиллятор и фотоэлектронный умножитель в системе коллиматорный Микролучевой облучения.
  8. От облучения-диспетчерской отрегулировать положение животных, основанный на изображение на мониторе от Микроскоп, расположенный под автоматическое стадии, которая это же изображение на мониторе в зале облучения (Рисунок 4E).
  9. Целевой Микролучевой облучения нажмите кнопку облучения программного обеспечения для облучения.
    Примечание: В примере, показанном на рисунке 4F, мы нацелены глотки в регионе головы и облучать с соответствующим числом Микролучевой ионов углерода. Потому что количество ионов частиц, проходящих через образец подсчитывается с помощью Ион счетчик системы связан с консоли и программное обеспечение облучения, облучение остановлена после поставки требуемого числа частиц ионов.
  10. Найдите каждое животное, записанные на выделенный лист и осуществлять целенаправленные облучения для каждого животного. Повторите шаги 7,8 и 7,9 до тех пор, пока все животные были облучены.
  11. Сразу же после облучения войти в комнату облучения и опустите стадию автоматической облучения. Удаление образца на заказные рамы, находится на стадии автоматической.
  12. Соберите животных, как описано в шагах 5.1-5.3.
  13. Осуществляют поведенческий и/или молекулярные анализы, необходимые для оценки последствий целевого облучения, в зависимости от цели исследования.
    Примечание: Assay локомоции, описанные в шаге 3.6 является эффективным методом для оценки воздействия радиационного облучения на моторику4,9.

8. Лечение червь листов для многократного использования

Примечание: Червь листы можно многократно использовать по крайней мере 10 раз9 без неблагоприятных эффектов на животных, если чистить и стерилизовать должным образом после использования следующим образом.

  1. Очистка
    1. Поместите лист используется червя на 6 см Петри и падение около 100 мкл стерилизованные ультрачистая вода на весь лист.
    2. Весла, вода на поверхности листа с использованием перчатках пальцы, чтобы смыть грязь, пыль, бактериальных продуктов питания и любые яйца заложен в каналах.
    3. Протрите влаги внебалансовые червь, тщательно с использованием одноразовых салфеток.
  2. Стерилизация
    1. Придать Петри, содержащий лист червь около 5 мл 70% этанола и весло поверхности листа, с помощью пальцев перчатке смыть грязь.
  3. Сушка
    1. Убрать фишки Петри, заполнены с 70% этанола и дайте высохнуть естественным образом.
  4. Хранения
    1. После высыхания, поместите лист червя на стерильную Петри и покрывают его. Листы могут также храниться на стерильной Петри заполнены с 70% этиловом спирте.
      Примечание: Это лучше распоряжаться обложки фильмов после использования, но если они должны быть использованы повторно, очистить их, как это сделано для листа червь. Однако если складки на обложки фильма после использования он больше не будет придерживаться чип, что приводит к обезвоживанию животных, и поэтому его следует заменить.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Активные C. elegans лиц может быть иммобилизованным успешно с использованием ультра-тонкий, смачивающихся PDMS, microfluidic чип (червь лист). Мы исследовали пригодности различных обложки фильмов для герметизации червь лист, как описано в протоколе раздела 3. Оценить эффекты герметизации обложки фильмов, мы определили моторику животных 3 ч после иммобилизации на чипе, используя Стекло покровное (толщина: 130-170 мкм), ПЭТ-пленка (толщина: 125 мкм) и фильм PS (толщина: ~ 130 мкм), соответственно. Как показано на рисунке 5, не было никаких существенных различий в подвижности (изгибы тела) контрольных животных разрешено свободно передвигаться на 3 h и животных, заключенный в червь лист PS пленкой. В отличие от подвижности значительно сократилось в животных, заключенный под покровным стеклом. Некоторые животные, как представляется, высохли, предполагая, что Стекло покровное отразили капли, предотвращения непосредственной печати и позволяя животных для частично просохнет, обусловило снижение подвижности. Подвижности животных, заключенный, используя ПЭТ-пленка также значительно сократилась; Хотя наблюдалось не сушки, подвижности животных, как правило, уменьшить равномерно, предполагая, что скорость передачи низким содержанием кислорода (~ 30 мл / [24 h·m²· MPa]), который находится примерно в 100 раз меньше, чем вызвавшие ПС, животных, чтобы задушить. Эти результаты позволяют предположить, что PS Обложка, фильмы должны использоваться заключить животных в червь листа.

Мы также применяется метод лист червь для визуализации наблюдения и выполнения конкретного региона Микролучевой облучения. На чипе иммобилизация с помощью червь листа с удержания воды и не аутофлюоресценция был пригоден для микроскопические наблюдения под напряжением. Например мы применили технику для штамма HBR411 C. elegans, в котором Репортер ген выразил кальция индикатор GCaMP3.35 во всех клетках мышцы стенки тела. Мы наблюдали деятельности всех мышечных клеток стенки тела в молодых взрослых животных ≤3 дней после вылупления в червь листы с 50 мкм всей microfluidic каналов, которые позволили животных пространство слегка согнуть. Интенсивность сигнала GCaMP3.35 в HBR4 напряжение соответствует сокращение мышечных клеток стенки тела. Ca2 + волн соответствующий мышечной деятельности четко наблюдалось (1 видео). Кроме того, мы подтвердили, что червь лист не аутофлюоресценция как показано на последнем этапе (последние ~ 10 s) 1 Видео. Таким образом отсутствие необходимости в анестезии позволили физиологической деятельности мышечных клеток, чтобы наблюдать живой условиях.

Кроме того мы применили червь лист для конкретного региона Микролучевой облучения C. elegans лиц. Несколько каналов прямой microfluidic на листе червь допускается несколько животных, чтобы быть иммобилизованным одновременно, без необходимости для анестезии, таким образом позволяя последовательное облучение каналов ≥20 животных (достаточно для assay группы) в течение короткого времени (30 минут для 20 физические лица).

Figure 1
Рисунок 1 : Схема червь листа. (A) Обзор червь листа с 1 американский цент для масштаба. Лист червь был 300 µm толщиной 15 мм широкий и 15 мм в длину. (B) поверхности листа червя содержится 25 каналов прямой microfluidic (глубина = 70 мкм; ширина = 60 мкм; длина = 8 мм). (C) схема образцов, состоящий из нижней обложки фильма, червь лист и обложки фильма. (D) червь лист мягкой, ультра-тонкий лист из PDMS и может быть согнуты на ущемление с плоский пинцет. (E) пример нескольких животных, заключенный в нескольких каналов. ()F) расширение microfluidic канала, нажав с Платина выбора. Эластичность канала позволяет животных, чтобы мягко обволакивает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Тела формы C. elegans. (A) одичал тип (N2) C. elegans на плите NGM. (B) unc-119 мутант с ненормальные формы на плите NGM. (C) unc-119 мутантов, заключенный в каналах microfluidic червь листа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Схема микроскопа наблюдения жить C. elegans лиц, заключенный в червь листа. Схема (А) стереомикроскопом системы для визуализации наблюдений. (B) схема микроскопа наблюдения червя лист включающего живой C. elegans лиц. (C) в разрезе червя лист включающего живой C. elegans лиц размещены на микроскопа. W.D. указывает рабочее расстояние микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Схема коллиматорный Микролучевой системы QST Такасаки и процедура облучения целевых Микролучевой жить C. elegans лиц. (A) Обзор коллиматорный Микролучевой облучения системы5, который может использовать несколько тяжелых ионных частицы, ускорился от azimuthally различной циклотрон поле установлен на ТИАРЕ QST-Такасаки. (B) Обзор выхода луча и автоматическое сцену для облучения. (C) образец установки на автоматическое стадии коллиматорный Микролучевой системы. (D) вертикальное позиционирование образца облучения проведена в зале облучения. (E) тонкой настройки зоны облучения проведены в комнате облучения управления. (F) целевые Микролучевой облучения живых C. elegans. Глотки была нажата на качестве целевой позиции и облученных, нажав на кнопку облучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Моторику C. elegans после иммобилизации на чипе, используя Стекло покровное, полиэстер (ПЭТ) фильм и фильм полистирол (PS). Бары указывают среднее тела поворотах животных 3 h после на чипе иммобилизации или свободное движение за 3 ч на плите NGM (управления). Десять животных были изучены и изгибы тела были среднем среди каждой группы. Наконец данные из пяти независимых экспериментов были среднем для каждой группы. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения пяти независимых экспериментов. Все данные анализировали с помощью односторонней ANOVA на 0,05 (*) или 0,01 уровне значимости (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Video 1
Видео 1: примеры изображений наблюдений мышечной деятельности в C. elegans заключены в листе червь. Кальций иона волн соответствующее сокращение мышечных клеток стенки тела во время обхода в HBR4 C. elegans лиц, заключенный в листе червь. Последние 10 ~ s наблюдались при освещении ярко поле. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Supplementary Figure 1
Дополнительный файл 1: пример выделенный лист бумаги (версия Микролучевой облучения). Нарисуйте стрелки, чтобы указать положение каждого животного в канале. Направление стрелки соответствует голову. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

На чипе иммобилизации C. elegans живой условиях использование смачиваемые PDMS microfluidic чип позволяет эффективных целевых Микролучевой облучения несколько животных. Простота обработки и возможности для предотвращения высыхания сделать эту систему подходит для приложений, не только в Микролучевой облучения, но и в нескольких поведенческих анализов. Эти листы червь уже освоено и может быть легко получены. Обычные microfluidic микросхемы, например обонятельных чипов, связаны с проблемами, включая засорение животных и яйца в закрытой microfluidic каналы, что делает его трудно собирать животных, и таким образом такие чипы, как правило, чтобы быть одноразовые, тем самым увеличение стоимости. В отличие от microfluidic каналы на текущем листе червя являются открытыми, что делает его легче собирать животных. Эти листы червь поэтому может использоваться неоднократно, что делает их более экономичным.

Последние технологические новшества в PDMS microfluidic фишки показали тенденцию к увеличению в структурной сложности и многофункциональности16,18,19,20,21, 22,23. Однако мы считаем, что важно сделать систему простой и легкой в использовании. Действительно, в отличие от использования обычных крупных microfluidic фишки19,20,21,22,23 , требуют крепления вакуумного насоса, небольшой размер и простой дизайн червь листов позволяет процедурам легко осуществляться в ограниченном пространстве.

Вода удержания производительность червь листов позволяет долгосрочных наблюдений осуществляться. Кроме того толщина листа позволяет ионных частицы проходят через образцы, таким образом позволяя целевого облучения применяться жить C. elegans лиц с точное количество частиц ионов. Эти преимущества червь листов значительно расширили возможности для биологических экспериментов.

Мы считаем, что важно для биологов для разработки нового оборудования и методов в целях повышения эффективности их опыты и анализы. Червь листы и Микролучевой облучения программного обеспечения были разработаны с учетом этой цели и имеют потенциал, чтобы внести вклад в успех будущих новаторских экспериментов за пределами своих первоначальных целей.

В меру наших знаний наша группа является первым разработал эту технологию во всем мире. Однако его использование стандартизированных в будущем облегчит применение целенаправленных Микролучевой облучение животных под напряжением, тем самым помогая определить роли конкретных клеток/тканей в внутренние процессы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-р Ацуши Higashitani за добрые советы относительно лечения C. elegans и Drs. Юя Хаттори, Йичиро Йокота и Ясухико Кобаяши ценных дискуссий. Авторы благодарят Caenorhabditis генетический центр для предоставления штаммов C. elegans и E. coli. Мы благодарим экипаж циклотрон тиара QST-Такасаки за их любезное содействие с облучением экспериментов. Мы благодарим д-р Сьюзен Furness для редактирования проекта этой рукописи. Это исследование было поддержано в части KAKENHI (Грант номера JP15K11921 и JP18K18839) с JSP-Страницами для м.с.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

Биоинженерии выпуск 145 C. elegans Микролучевой облучения на чипе иммобилизации PDMS microfluidic чип червь лист смачиваемости
Иммобилизации живой <em>Caenorhabditis elegans</em> лиц с использованием ультратонкие полидиметилсилоксан Microfluidic чип с удержанием воды
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter