Summary
Formålet med denne protokol er at mærke, berige og identificere substrater af protein kinase CK2 fra en kompleks biologisk prøve celle lysate f.eks væv homogenatet. Denne metode udnytter unikke aspekter af CK2 biologi til dette formål.
Abstract
Studiet af kinase-substrat relationer er afgørende for at få en komplet forståelse af funktioner af disse enzymer og deres downstream mål i både fysiologiske og patologiske stater. CK2 er en evolutionært bevarede Serin/Threonin kinase med en voksende liste af hundredvis af substrater involveret i flere cellulære processer. På grund af sine pleiotrope egenskaber, identifikation og karakterisering af et omfattende sæt af CK2 substrater har været særligt udfordrende og forbliver en hurdle i studiet af dette vigtigt enzym. For at tage denne udfordring op, har vi udtænkt en alsidig eksperimentelle strategi, der muliggør målrettet berigelse og identifikation af formodede CK2 substrater. Denne protokol drager fordel af den unikke dual Co substrat specificitet af CK2 giver mulighed for specifikke thiophosphorylation sit underlag i en celle eller væv lysate. Disse substrat proteiner er efterfølgende alkylerede, immunoprecipitated, og identificeret af liquid chromatography/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidligere brugt denne tilgang til med held identificere CK2 substrater fra Drosophila æggestokke og her vi udvide anvendelsen af denne protokol på menneskelige glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne af denne metode til at undersøge de biologiske roller af denne kinase i forskellige modelorganismer og eksperimentelle systemer.
Introduction
Protein kinaser er vigtige komponenter i signaltransduktion cascades. Fosforylering af substrat proteiner af disse enzymer fremkalder biologiske svar, der regulerer kritiske begivenheder kontrollerer celledeling, stofskifte og differentiering, blandt andre. CK2 er en allestedsnærværende udtrykt, acidophilic Serin/Threonin kinase der er bevaret fra gær til mennesker og der spiller vigtige roller i mange cellulære processer lige fra transkriptionel regulering til cellecyklus progression til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer bestående af to katalytiske α (eller α') subunits og to lovgivningsmæssige β underenheder4. Ud over at være meget pleiotrope, udstiller CK2 to andre usædvanlige egenskaber at komplicerer sin analyse, nemlig konstitutiv aktivitet5 og dobbelt Co substrat specificitet6. Denne sidstnævnte egenskab forlener CK2 med mulighed for at bruge GTP samt ATP for fosforylering af substrat proteiner.
Genetiske sletning af de katalytiske eller administrative underenheder af CK2 i mus resultater i embryonale dødelighed viser, at det spiller afgørende roller i udviklingen og organogenesis7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer af kræft og dermed udgør en lovende terapeutiske mål9,10,11. Faktisk, specifikke hæmmere at mål CK2 kinase aktivitet er i øjeblikket under efterforskning for dette formål12,13,14. Mens hæmning af CK2 er en farbar vej, sin pleiotrope karakter, et alternativ og er måske mere rationel tilgang til at målrette kritiske CK2 substrater, der ligger til grund for progression af visse kræftformer. Derfor, omfattende identifikation og karakterisering af CK2 substrat proteiner ville være til betydelig gavn for belyse den specifikke funktioner af denne kinase inden for en bestemt væv eller tumor type.
Her, beskriver vi en alsidig biokemiske metode til at identificere CK2 substrater fra en komplekse biologiske prøve en celle eller væv lysate. Denne protokol udnytter dual Co substrat specificiteten af CK2 ved brug af GTP analog GTPγS (Guanosinmonofosfat 5'-[γ-thio]triphosphate), som andre endogene kinaser ikke kan bruge. Dette giver effektivt kinase at "mærke" sin substrater i denne prøve for efterfølgende isolation og identifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Sikre, at de nødvendige materialer er tilgængelige og ordentligt forberedt (Se Tabel af materialer).
1. forberedelse
- Mekanisk lyse vævsprøve (1-2 mg af væv i 100 µL af lysisbuffer, tabel 1) eller kulturperler celler (10 cm plade, der er 80-90% sammenflydende i 350 µL af lysisbuffer), med det mål er at samle alt 900 µL af prøven for eksperimentet. Bemærk, at denne diskenhed i lille overskud af hvad der kræves for eksperimentet beskrevet nedenfor.
- Spin ned prøverne ved centrifugering på 17.500 x g i 3 minutter ved 4 ° C. Ved afslutningen, skal du overføre 270 µL af supernatanten til hver af tre nye 1,7 mL microcentrifuge rør. Der vil være ca 90 µL resterende. Fjerne 40 µL til at blive brugt som en "input kontrol" og sted i en ny tube. Placere alle prøver på is.
2. kinase assay: thiophosphorylation og alkylering
- Mærke til tre rør indeholdende 270 µL som følger: "kinase rxn", "GTPγS kun", og "PNBM (p-nitrobezyl mesylat) kun". Forberede kinase reaktioner.
- Til "kinase rxn" rør, tilføje 2,7 µL (svarende til 1.350 U) af CK2, derefter tilføje 2,7 µL af 2,5 mM GTPγS.
- "Kun GTPγS" rør, tilføje 2,7 µL af 2,5 mM GTPγS og derefter tilføje 2,7 µL af lysisbuffer.
- "Kun PNBM" rør, tilføje 5.4 µL af lysisbuffer. Svip til alle rør for at blande og derefter straks sted på is.
- Inkuber alle tre rør i 1 min i et 30 ° C vandbad. Efter inkubation, tilføje 13,5 µL af 12 mg/mL PNBM til alle tre reagensglas. Inverter til at blande prøver. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 1 time.
- Efter start inkuberingen i trin 2.2, forberede kolonnerne udvanding så hurtigt som muligt, da processen tager ca 45 min.
3. forberedelse af afsaltning kolonner
- I første omgang forberede kolonner (3 til dette eksempel eksperiment) af invertere hver kolonne flere gange til genopslæmmes Sephadex G-25 harpiks i bufferen til opbevaring. Ionbytteren henstår til at bosætte sig ved montering hver kolonne til en klemme stå og lade det sidde uforstyrret i ca 5 min.
- Efter afvikling af Sephadex G-25 harpiks, fjerne caps fra både toppen og bunden af kolonnen til at tillade opbevaring bufferen til at dræne af grovhed og har en slange, placeret under den nederste åbning at indsamle gennemstrømnings for udsmid.
- Når opbevaring buffer er forarmet, tilføje ca. 2,7 mL lysisbuffer for at reagensglasset kolonnerne. Indsamle gennemstrømnings- og kassér. Gentag 3 gange. Efter den endelige ækvilibrering er kolonnerne klar til trin 4.1.
4. fjernelse af PNBM
- Efter 1 h inkubation (trin 2.2) og kolonne forberedelse (trin 3) er fuldført, gælde kolonnerne, der prøver. Label hver kolonne som følger: "kinase rxn", "GTPγS" og "PNBM". Indlæse alle af hver prøve sin respektive kolonne. Indsamle og kassér gennemstrømnings.
- Vask prøver ved at tilføje 420 µL af lysisbuffer til hver kolonne. Tillad lysisbuffer filtreres gennem kolonnen og indsamle gennemstrømnings for udsmid. Efter trinnet vask sted rør i stilling til udtagning af prøver.
- Elueres prøver ved at tilføje 500 µL af lysisbuffer til hver kolonne. Indsamle de gennemstrømnings-der nu indeholder thiophosphorylated og alkylerede CK2 substrater.
5. Immunoprecipitation: Del I
- Forberede prøverne til immunoprecipitation af første fjerne 80 µL for en "eluering input kontrol" prøve fra hver af de respektive elutions ("kinase rxn", "GTPγS" og "PNBM") indsamlet i trin 4.3. Efter fjernelse af 80 µL af hver prøve, vil der være ca 420 µL resterende pr. prøve.
- Opdele hver prøve i 2 rør indeholdende 200 µL. Label hver respektive tube: "kinase rxn anti-thiophosphate ester", "kinase rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" og "PNBM IgG".
- Tilføje 2,8 µg anti-thiophosphate ester antistof til hvert af anti-thiophosphate ester-mærket rør og 2,8 µg isotype kontrol antistof til hver af de IgG-mærket rør. Sted rør på en rotator ved 4 ° C i 2 timer.
- Begynde udarbejdelsen af protein A/G perle i løbet af de sidste 15 min. 2 h inkubation i trin 5.2.
6. protein A/G Agarosen perle forberedelse
- Kort vortex opbevaring røret at sikre perler er helt re suspenderet. Skåret ud i slutningen af en P200 pipette tip ved hjælp af en ren barberblad for at øge gauge størrelse. Afpipetteres 100 µL af perle gylle pr. immunoprecipitation ind i en ny 1,7 mL microcentrifuge rør. I dette eksempel, ialt 6 rør er nødvendige.
- Centrifugeres rør på 17.500 x g i 1 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og kassér. Genopslæmmes perlerne i 200 µL af kort lysisbuffer og vortex. Gentag spin og vaske trin 3 gange.
- Efter den sidste vask, skal du placere perlerne på is, indtil inkubering i trin 5.2 er fuldført.
7. Immunoprecipitation: Del II
- Efter 2 h inkubation fra trin 5.2, spin ned prøver på 17.500 x g i 3 min. ved 4 ° C. Efter centrifugering tilføje 200 µL af hver prøve til rør med vasket perlerne. Sted rør på en rotator ved 4 ° C i 1 time.
- Efter inkubationen 1 h centrifugeres rør på 17.500 x g i 1 min. ved 4 ° C. Næste fjerne 40 µL af supernatanten fra hver prøve og gemme som en "nedbrydning kontrol" (i alt 6 rør). Fjerne resten af supernatanten og kassér. Passe på ikke for at forstyrre perlerne.
- Vask prøverne ved at tilføje 200 µL af lysisbuffer og vortexing kort. Derefter centrifugeres ved 17.500 x g i 1 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og kassér. Gentag vask og spin trin 3 gange. Passe på ikke for at forstyrre perlerne under disse trin.
- Efter endt vask trin, skal du tilføje 50 µL af 2 x prøvebuffer til hver prøve, der indeholder perler. For alle andre prøver, tilføje 8 µL af 6 x prøvebuffer: "input kontrol", "eluering input kontrol" og "udtynding kontrol".
- Når bufferen er tilføjet til rør, afpipetteres op og ned at blande, og varme alle prøver ved 95 ° C i 5 min før man går videre med SDS-PAGE.
8. analyse/validering af resultaterne
- Validere vellykket CK2-afhængige thiophosphorylation og alkylering.
- For at fastlægge effekten af CK2-medieret thiophosphorylation i trin 2.2, udføre SDS-PAGE og Western blotting ved at køre 15-20 µL af den "eluering input kontrol" indsamlede i trin 5.1 på en 12,5% polyacrylamid gel.
- Probe membraner med de følgende antistoffer: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α, og anti-GAPDH (eller andre passende lastning kontrol). Hvis dette skridt var vellykket, skal en forbedret anti-thiophosphate ester signal være synlige i "kinase rxn" lane i forhold til de andre to baner (figur 2).
- Visualisere beriget formodede substrater af CK2 og bestemme protein identitet.
- For at vurdere om immunoprecipitation skridt var vellykket, køre 25-30 µL af prøverne elueres fra perler i trin 7.4 på en separat 12,5% polyacrylamid gel. Sikre, at alt udstyr er ren og slid handsker på alle tidspunkter under dette skridt til at minimere forurening.
- Pletten gel med Coomassie blå til at visualisere beriget proteiner fra forskellige stadier af forsøgsplan (figur 3). Ved hjælp af nye barberblade, omhyggeligt Punktafgifter unikke bands i "kinase rxn anti-thiophosphate ester IP" lane, at bemærke deres omtrentlige Molekylær vægt.
- Indsende disse bands for protein identifikation af liquid chromatography/tandem massespektrometri (LC-MS/MS) (figur 4). Hvis antistoffer rettet mod de identificerede proteiner er til rådighed, bekræfter resultaterne af massespektrometri af SDS-PAGE og immunoblotting af input, forarmet, og IP fraktioner indsamles i løbet af protokollen (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk diagram af forsøgsmetoden tilbydes i figur 1. Den underliggende grundlag af teknikken er CK2 usædvanlige evne til at bruge GTP for phosphoryl gruppe overførsel. Tilsætning af eksogene CK2 holoenzym sammen med GTP analog, GTPγS, at en celle lysate resultater i thiophosphorylation af endogene CK2 substrater. Efterfølgende behandling af de lysate med alkylating reagens p- nitrobenzyl mesylat (PNBM) genererer en thiophosphate ester gruppe på disse specifikke substrat proteiner, som derefter kan immunoprecipitated ved hjælp af et anti-thiophosphate ester antistof og i sidste ende identificeret ved massespektrometri. Figur 2 viser et positivt resultat efter tilsætning af CK2 og GTPγS og derefter PNBM til T98G (glioblastom) celle lysate. Disse resultater viser, at CK2-afhængige thiophosphorylation og efterfølgende alkylering var vellykket. Som forventet, er en forbedret anti-thiophosphate ester signal ved Western blotting observeret kun i den vognbane, der indeholder den komplette kinase reaktion og ikke i den GTPγS kun- og PNBM kun behandlet prøver. Vist i figur 3 er en Coomassie blå-farvede gel af immunoprecipitated og elueret proteiner ved hjælp af isotype kontrol IgG eller anti-thiophosphate ester antistoffer i tilstedeværelse eller fravær af overskydende CK2 og/eller GTPγS. Disse data også vise et positivt resultat flere unikke bands er indlysende kun i anti-thiophosphate ester IP lane, hvor de lysate var inkuberes med eksogene CK2 og GTPγS. Bandet er angivet med en stjerne var skåret ud fra gel og indsendt til protein identifikation af massespektrometri. Figur 4 illustrerer repræsentative data opnået ved massespektrometrisk analyse herunder protein identifikation, procent dækning, og antallet af unikke peptider identificeret pr. protein i bandet. Vist er top ti hits fra de indsendte band (figur 3) og oplysninger om hvorvidt protein tidligere er blevet identificeret som et substrat CK215,16,17. Identiteten af en af de kendte immunoprecipitated CK2 substrater, nucleolin15, blev bekræftet af SDS-PAGE og immunoblotting af de angivne fraktioner ved hjælp af et anti-nucleolin antistof.
Figur 1: skematisk diagram over den eksperimentelle strategi. Analog GTP GTPγS, sammen med overskydende rekombinante CK2 holoenzym føjes til en celle eller væv lysate og giver mulighed for thiophosphorylation af substrater af CK2, men ikke af andre endogene kinaser. Thiophosphorylated substrater er næste alkylerede med PNBM, generere en thiophosphate ester gruppe på disse proteiner, der er så fanget via immunoprecipitation (IP) for efterfølgende identifikation af liquid chromatography-tandem massespektrometri ( LC-MS/MS). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: validering af CK2-afhængige thiophosphorylation i hele cellen lysate. Hele cellelysater forberedt fra T98G celler blev inkuberet med GTPγS i (kinase reaktion) eller ej (GTPγS kun) af eksogene rekombinante CK2 holoenzym. PNBM blev efterfølgende føjet til de angivne reaktioner, og prøver blev løst af SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotting med de angivne antistoffer. Protein molekylvægt markører er angivet i kDa. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunoprecipitation af formodede CK2 substrat proteiner. Berigelse og visualisering af formodede CK2 substrater (tredje vognbane) er indlysende som flere unikke bands efter immunoprecipitation med anti-thiophosphate ester antistoffer. Immunoprecipitates blev løst af SDS-PAGE og gelen var plettet med Coomassie blå. Bandet er markeret med en stjerne var skåret ud fra gel og indsendt til protein identifikation af massespektrometri. Protein molekylvægt markører er angivet i kDa. IP = immunoprecipitation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Identifikation og bekræftelse af proteiner som substrater af CK2 i vitro. Oplysninger indhentet ved massespektrometri viser, at både tidligere kendte15,16,17 samt formodede roman CK2 substrater blev identificeret ved hjælp af denne eksperimentelle tilgang. Vist er toppen ti proteiner identificeret fra den skåret band (øverst). Af nucleolin, en kendt CK2 substrat, identitet blev bekræftet ved immunoblotting af de angivne fraktioner ved hjælp af et anti-nucleolin antistof (nederst). Protein molekylvægt markører er angivet i kDa. IP = immunoprecipitation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens Stock koncentration | Reagens endelige koncentration | Eksempel diskenheder tilføjet baseret på lager koncentrationer |
| 1 M Tris pH 7,4 | 20,0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20,0 mM | 50 ΜL |
| 20% Triton X-100 | 0,50% | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DTT | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1.0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-glycerol phosphat | 10,0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 komplet Mini tab/10 mL | 1 tablet |
Tabel 1. Lysis buffer opskrift (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, beskriver vi en relativt simpel biokemiske metode til at identificere substrater af protein kinase CK2 fra et komplekst biologisk prøve. De kritiske trin i denne protokol er baseret på de usædvanlige enzymatisk egenskaber af CK2 og omfatter CK2-afhængige thiophosphorylation af specifikke substrat proteiner ved hjælp af GTPγS og deres efterfølgende immunoprecipitation og identifikation. Med disse resultater, har vi bevist nytte og alsidighed af denne tilgang, som vi nu har anvendt denne strategi i både menneskelige glioblastom celler og Drosophila æggestokkene18.
En række tidligere offentliggjorte undersøgelser ved hjælp af kvantitative fosfoproteomanalyse tilgange har faktisk vist sig succesfuld i at identificere nye CK2 substrater19,20,21,22, 23. men nogle af disse strategier gør brug af immobiliserede substrat arrays, og det er muligt, at kropsbygning af et immobiliseret protein kan gøre en potentiel fosforylering websted utilgængelige for kinase. Den teknik beskrevet her tillader fosforylering inden for en mere fysiologisk eller den oprindelige miljø (dvs. en celle lysate), således at reducere sandsynligheden for, at webstedet ikke er tilgængeligt. En anden fordel ved denne strategi er at når protein identifikation bestemmes af massespektrometri, validering af formodede CK2 substrater kan nemt udføres på prøver, der opsamlet under proceduren, hvis antistoffer rettet mod underlaget de(n) af interesse er tilgængelige. For eksempel bør bruger standard western blotting, man iagttage en reduktion i niveauet for den relevante protein i forarmet (post-IP) prøver og sin tilstedeværelse i anti-thiophosphate ester immunoprecipitates som vi har vist for de kendte CK2 substrat nucleolin (figur 4).
En bemærkelsesværdig begrænsning af denne metode er, at det sidste trin af proceduren forud for analyse af massespektrometri er afhængig af evnen til at skelne diskrete forskelle i banding mønster på en gel. Således er det bestemt muligt, at specifikke CK2 substrater kan blive savnet, hvis de er af lav overflod og derfor under grænsen på visuel genkendelse. Hvis man er bekymret over denne mulighed, kan en mere følsom metode som sølv farvning bruges til at visualisere disse proteiner i stedet for at bruge Coomassie blå. En yderligere overvejelse, der bør anerkendes er, at en række CK2 substrater ikke kan identificeres ved hjælp af denne strategi, eftersom de fysiologisk relevante websteder vil allerede være fosforyleres i vivo. Det er næsten helt sikkert være tilfældet givet den konstituerende aktivitet af CK2. Det bør endelig også bemærkes, at denne metode kun identificerer proteiner som formodede substrater af CK2 i vitro. Efterfølgende assays til at validere, at disse er fysiologisk relevante substrater af CK2 i vivo er påkrævet og bør medføre identifikation af CK2-afhængige fosforylering websteder og vurdere hvis fosforylering af disse særlige rester er ændret i svar til manipulation af CK2 kinase aktivitet.
I Resumé, vil denne strategi kombineret med downstream eksperimenterende tilgange (fosforylering site mapping af trunkering/sletning analyse, site-directed mutagenese, funktionelle in vitro og i vivo assays, etc.) lette undersøgelsen af denne usædvanlige kinase og vil øge vores forståelse af de forskellige roller, som CK2 spiller i flere biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af Commonwealth Universal forskning Enhancement tilskud fra Pennsylvania Department of Health til T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
