Summary
El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.
Abstract
El estudio de las relaciones del sustrato de la quinasa es esencial tener una comprensión completa de las funciones de estas enzimas y sus objetivos downstream en Estados fisiológicos y patológicos. CK2 es una cinasa serina/treonina evolutivamente conservados con una creciente lista de centenares de sustratos implicados en múltiples procesos celulares. Debido a sus propiedades pleiotrópicos, identificar y caracterizar un conjunto amplio de sustratos de CK2 ha sido particularmente difícil y sigue siendo un obstáculo en el estudio de esta enzima importante. Para abordar este desafío, hemos ideado una estrategia experimental versátil que permite el enriquecimiento objetivo e identificación de posibles sustratos de CK2. Este protocolo aprovecha de la especificidad de sustrato Co dual única de CK2 permitiendo thiophosphorylation específico de sus sustratos en una célula o tejido lisado. Estas proteínas de sustrato son posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por líquido cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). Previamente hemos utilizado este enfoque para identificar con éxito CK2 sustratos de Drosophila ovarios y aquí extendemos la aplicación del presente Protocolo a las células de glioblastoma humano, ilustrando la capacidad de adaptación de este método para investigar la funciones biológicas de esta quinasa en diversos organismos modelo y sistemas experimentales.
Introduction
Proteínas quinasas son componentes clave de cascadas de transducción de la señal. Fosforilación de las proteínas sustrato de estas enzimas produce respuestas biológicas que regulan eventos críticos que controla la división celular, el metabolismo y la diferenciación, entre otros. CK2 es una quinasa de serina/treonina ubicuo expresada, acidófilos que se conserva de la levadura a los seres humanos y que juega un papel importante en muchos procesos celulares que van desde la regulación transcripcional de la progresión del ciclo celular apoptosis1 ,2,3. La enzima es un heterotetrámero compuesto de dos α catalítica (o α') subunidades y dos subunidades β regulador4. Además de ser muy pleiotrópico, CK2 exhibe dos otras características inusuales que complican su análisis, es decir, actividad constitutiva5 y de la especificidad de sustrato Co doble6. Esta última propiedad dota la habilidad de usar GTP y ATP para la fosforilación de las proteínas sustrato de CK2.
Supresión genética de las subunidades catalíticas o reglamentarias de CK2 en ratones produce mortalidad embrionaria que indica que desempeña papeles cruciales durante el desarrollo y organogénesis7,8. CK2 también se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y representa una prometedora diana terapéutica9,10,11. De hecho, inhibidores específicos quinasa CK2 de destino están actualmente bajo investigación para este propósito12,13,14. Mientras que la inhibición de la CK2 es una opción viable, dada su carácter pleiotrópico, alternativa y quizás más racional sería objetivo crítico sustratos CK2 que subyacen a la progresión de ciertos tipos de cáncer. Por lo tanto, la completa identificación y caracterización de proteínas de sustrato de CK2 sería un beneficio significativo para dilucidar las funciones específicas de esta quinasa en un tipo particular de tejido o tumor.
Aquí, describimos un método versátil bioquímico para la identificación de sustratos de CK2 de una muestra biológica compleja como una célula o un tejido lisado. Este protocolo toma ventaja de la especificidad de sustrato Co dual de CK2 utilizando el análogo del GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) de guanosina que otras quinasas endógenas no pueden utilizar. Esto permite con eficacia la quinasa a sus substratos dentro de esta muestra para posterior aislamiento e identificación de la "etiqueta".
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Protocol
Nota: Asegúrese de que los materiales están disponibles y preparados adecuadamente (véase Tabla de materiales).
1. preparación
- Mecánicamente lyse muestra de tejido (1-2 mg de tejido en 100 μl de tampón de lisis, tabla 1) o cultivadas las células (placa de 10 cm que es 80-90% confluente en 350 μl de tampón de lisis,) con el objetivo de recolectar un total de 900 μl de la muestra para el experimento. Tenga en cuenta que este volumen es en ligero exceso de lo que se requiere para el experimento que se describe a continuación.
- Desactivación de las muestras por centrifugación a 17.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C. Al finalizar, traslado 270 μl del sobrenadante a cada uno de tres tubos de microcentrífuga de 1,7 mL nuevo. Habrá aproximadamente 90 μl restantes. Eliminar 40 μL para ser utilizado como un "control de entrada" y el lugar en un tubo nuevo. Coloque las muestras en hielo.
2. Análisis de la cinasa: thiophosphorylation y alquilación
- Etiquetar los tres tubos que contienen 270 μl cada una como sigue: "cinasa reacción", "GTPγS", y "PNBM (p-nitrobezyl mesylate) sólo". Preparar las reacciones de la cinasa.
- El tubo "cinasa reacción", añadir 2,7 μl (equivalente a 1.350 U) de CK2, luego añada 2,7 μl de 2.5 mM GTPγS.
- En el tubo "GTPγS solamente", añadir 2,7 μl de 2.5 mM GTPγS y luego añadir 2,7 μl de tampón de lisis.
- Al tubo de "PNBM sólo" añadir 5,4 μL de tampón de lisis. Película de todos los tubos para mezclar y colocar inmediatamente en hielo.
- Incubar todos los tubos de tres por 1 min en un baño de agua de 30 ° C. Tras la incubación, añadir 13,5 μl de 12 mg/mL PNBM a todos los tres tubos. Invertir para mezclar las muestras. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h.
- Después de iniciar la incubación en el paso 2.2, preparar las columnas desalación tan pronto como sea posibles mientras el proceso toma aproximadamente 45 minutos.
3. preparación de columnas de la desalación
- Inicialmente preparar columnas (3 para este experimento ejemplo) invirtiendo cada columna varias veces para volver a suspender el Sephadex G-25 resina en el buffer de almacenamiento. Permita que la resina a resolver por cada columna a un soporte de abrazadera y dejarla sentarse tranquilo durante aproximadamente 5 minutos.
- Después de colocar la resina Sephadex G-25, retire las tapas de la parte superior e inferior de la columna para permitir que el tampón de almacenamiento drene por gravedad y tienen un tubo que se coloca debajo de la abertura de la parte inferior para recoger el flujo a través para descartar.
- Una vez que se agota la memoria intermedia de almacenamiento, agregar aproximadamente 2,7 mL de tampón de lisis para equilibrar las columnas. Recoge el flujo a través y deseche. Repita 3 veces. Tras el final equilibrado, las columnas están listas para el paso 4.1.
4. eliminación de PNBM
- Después de la preparación de la columna (paso 3) y 1 h de incubación (paso 2.2), se aplican las muestras a las columnas. Cada columna de la etiqueta como sigue: "cinasa reacción", "Solo GTPγS" y "Sólo PNBM". La carga de cada muestra en su respectiva columna. Recoger y desechar el flujo a través.
- Lavar las muestras añadiendo 420 μl de tampón de lisis para cada columna. Permiten el tampón de lisis filtrar a través de la columna y recoger el flujo a través de descarte. Después de este paso de lavado, coloque los tubos para recogida de muestras.
- Eluir las muestras añadiendo 500 μl de tampón de lisis para cada columna. Recoger el paso que ahora contiene sustratos de CK2 alkylated y thiophosphorylated.
5. inmunoprecipitación: Parte I
- Preparar muestras para la inmunoprecipitación de primera extracción 80 μl de una muestra "de elución entrada control" de cada uno de los elutions respectivos ("cinasa reacción", "Solo GTPγS" y "Sólo PNBM") recogidos en el paso 4.3. Después del retiro de 80 μl de cada muestra, habrá aproximadamente 420 μl restantes por muestra.
- Cada muestra se dividió en 2 tubos que contiene 200 μl. Etiquetar cada tubo respectivo: "cinasa reacción anti-thiophosphate éster", "cinasa reacción IgG", "Ester GTPγS anti-thiophosphate", "GTPγS IgG", "Ester de anti-thiophosphate PNBM" y "PNBM IgG".
- Añadir 2,8 μg de anticuerpo de anti-thiophosphate ester a cada uno de los tubos anti-thiophosphate de marcado con éster y 2.8 μg de anticuerpo control de isotipo a cada uno de los tubos marcados con IgG. Coloque los tubos en un rotador a 4 ° C por 2 h.
- Comienza preparación de bolas de proteína A/g durante los últimos 15 minutos de la 2 h de incubación en el paso 5.2.
6. proteína A/g agarosa preparación de grano
- Brevemente vortex el tubo de almacenamiento para granos se suspende completamente de nuevo. Cortar el extremo de una P200 pipeta usando una cuchilla de afeitar limpia para aumentar calibre tamaño. Pipetee 100 μl de la mezcla de grano por inmunoprecipitación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Para este ejemplo, se necesitan un total de 6 tubos.
- Centrifugar los tubos a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y deséchelo. Vuelva a suspender los granos en 200 μL de tampón de lisis y brevemente vortex. Repetir el centrifugado y lavar pasos 3 veces.
- Después del último lavado, coloque los granos en hielo hasta que se complete la incubación en el paso 5.2.
7. inmunoprecipitación: Parte II
- Después de la incubación de 2 h de paso 5.2, desactivación de las muestras a 17.500 x g durante 3 min a 4 ° C. Tras centrifugación añadir 200 μL de cada muestra en los tubos con los granos lavados. Colocar los tubos en un rotador a 4 ° C durante 1 h.
- Después de la 1 h de incubación, centrifugar los tubos a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. A continuación quitar 40 μl del sobrenadante de cada muestra y guardar como un "control de agotamiento" (total 6 tubos). Quitar el resto del sobrenadante y desechar. Tenga cuidado de no para molestar a los granos.
- Lavar las muestras mediante la adición de 200 μL de tampón de lisis y de Vortex brevemente. Luego Centrifugue a 17.500 x g durante 1 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y deséchelo. Repetir el lavado y centrifugado pasos 3 veces. Tenga cuidado de no para molestar a los granos durante estos pasos.
- Después de completar los pasos de lavado, añada 50 μl de tampón x 2 para cada muestra que contiene los granos. Para todas las muestras, añadir 8 μl de 6 x el tampón de muestra: "control de entrada", "controles de elución de entrada" y "controles de agotamiento".
- Una vez que el buffer se agrega a los tubos, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar y calentar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos antes de proceder a SDS-PAGE.
8. Análisis y validación de resultados
- Validar la alquilación y thiophosphorylation dependiente de la CK2 exitosa.
- Para determinar la eficacia de la thiophosphorylation mediada por CK2 en el paso 2.2, realizar SDS-PAGE y Western Blot ejecutando 15-20 μl de los "elución controles de entrada" recogido en el paso 5.1 en un gel de poliacrilamida al 12,5%.
- Probe las membranas con los siguientes anticuerpos: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α y anti-GAPDH (u otro control de carga apropiado). Si este paso fue exitoso, una señal de mayor anti-thiophosphate éster debe ser evidente en el carril "cinasa reacción" frente a los otros dos carriles (figura 2).
- Visualizar enriquecidos sustratos putativos de CK2 y determinar la identidad de la proteína.
- Para evaluar si los pasos de inmunoprecipitación tuvieron éxito, ejecute 25-30 μl de las muestras que se eluyen de los granos en el paso 7.4 en un gel de poliacrilamida al 12,5% separados. Asegúrese de que todo el equipo esté limpio y use guantes en todo momento durante este paso para minimizar la contaminación.
- Tinción del gel con Coomassie azul para visualizar proteínas enriquecidas de diversas etapas del protocolo experimental (figura 3). Usando nuevo razorblades, suprimir cuidadosamente bandas únicos presentes en el carril "cinasa reacción anti-thiophosphate ester IP", tomando nota de sus pesos moleculares aproximados.
- Presentar estas bandas para la identificación de la proteína líquida cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) (figura 4). Si existen anticuerpos dirigidos contra las proteínas identificadas, confirmar los resultados de la espectrometría de masas por SDS-PAGE y el immunoblotting de entrada, agotado, y fracciones de la propiedad intelectual recolectan en el curso de protocolo (figura 4).
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Representative Results
Un diagrama esquemático del procedimiento experimental se ofrece en la figura 1. La base subyacente de la técnica es la inusual habilidad de CK2 con GTP para la transferencia de grupo fosforilo. Además de holoenzyme de CK2 exógeno junto con el análogo del GTP, GTPγS, a un lisado celular resulta en thiophosphorylation de sustratos de CK2 endógenos. Posterior tratamiento de lisado con lo alquilantes reactivo p- Nitrobencilo mesilato (PNBM) genera una molécula de éster thiophosphate en estas proteínas sustrato específico que puede ser immunoprecipitated utiliza un anticuerpo de anti-thiophosphate ester y en última instancia determinada por espectrometría de masas. Figura 2 muestra un resultado positivo tras la adición de CK2 y GTPγS y luego PNBM T98G lysate de la célula (glioblastoma). Estos resultados demuestran que thiophosphorylation dependientes de la CK2 y posterior alquilación tuvieron éxito. Como era de esperar, una señal de mayor anti-thiophosphate éster por borrar occidental se observa sólo en el carril que contiene la reacción completa de quinasa y no en el GTPγS único - y muestras PNBM sólo tratados. Se muestra en la figura 3 es un gel teñido de azul de Coomassie de immunoprecipitated y proteínas eluídas con control de isotipo IgG o anticuerpos de anti-thiophosphate éster en presencia o ausencia de CK2 exceso y/o GTPγS. Estos datos también demuestran un resultado positivo como múltiples bandas únicas son evidentes sólo en el carril IP anti-thiophosphate ester en el que el lisado se incubó con exógeno CK2 y GTPγS. La banda se indica con un asterisco fue suprimida del gel y enviada para identificación de proteínas por espectrometría de masas. Figura 4 ilustra datos representativos obtenidos por espectrometría de masa análisis incluyendo la identificación de proteínas, porcentaje cobertura y número de péptidos únicos identificado por proteína dentro de la banda. Se muestran los éxitos del top 10 de la banda presentada (figura 3) e información acerca de si la proteína se ha identificado previamente como un sustrato de CK215,16,17. La identidad de uno de los sustratos conocidos immunoprecipitated CK2, nucleolin15, fue confirmada por SDS-PAGE y el immunoblotting de las fracciones indicadas utilizando un anticuerpo anti-nucleolin.
Figura 1: esquema de la estrategia experimental. El análogo del GTP, GTPγS, junto con el exceso recombinante holoenzyme CK2 se agrega a una célula o tejido lisado y permite thiophosphorylation de sustratos por CK2 pero no por otras quinasas endógenas. Thiophosphorylated sustratos luego son alquilados con PNBM, generando una molécula de éster de thiophosphate en estas proteínas, que luego son capturados mediante inmunoprecipitación (IP) para posterior identificación por espectrometría de masas tándem cromatografía líquido ( LC-MS/MS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: validación de thiophosphorylation dependiente de la CK2 en células enteras lisado. Lysates de la célula entera de T98G células se incubaron con GTPγS en la presencia (reacción de cinasa) o ausencia (GTPγS solamente) de exógeno recombinante holoenzyme de CK2. PNBM fue agregado posteriormente a las reacciones indicadas y muestras fueron resueltas por SDS-PAGE seguido immunoblotting con los anticuerpos indicados. Marcadores de peso molecular de proteínas están indicados en kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: inmunoprecipitación de supuestas proteínas de sustrato de CK2. Enriquecimiento y la visualización de posibles sustratos de CK2 (tercer carril) es evidente como múltiples bandas únicos después de inmunoprecipitación con anticuerpos de anti-thiophosphate ester. Immunoprecipitates fueron resueltas por SDS-PAGE y el gel fue teñido con azul de Coomassie. La banda marcada con un asterisco fue suprimida del gel y enviada para identificación de proteínas por espectrometría de masas. Marcadores de peso molecular de proteínas están indicados en kDa. IP = inmunoprecipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación y confirmación de las proteínas como sustrato de CK2 en vitro. Datos obtenidos por espectrometría de masas muestra que conocido15,16,17 , así como sustratos putativos de CK2 novela se identificaron con este enfoque experimental. Se muestran la parte superior diez proteínas identificadas de la banda suprimida (arriba). La identidad de nucleolin, un conocido sustrato de CK2, fue confirmada por immunoblotting de las fracciones indicadas utilizando un anticuerpo anti-nucleolin (abajo). Marcadores de peso molecular de proteínas están indicados en kDa. IP = inmunoprecipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Concentración Stock de reactivos | Concentración Final de reactivo | Volúmenes del ejemplo ha añadido concentraciones comunes en base a |
| 1 M Tris pH 7,4 | 20,0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20,0 mM | 50 ΜL |
| 20% Tritón X-100 | 0.50% | 250 ΜL |
| 1 M de MgCl2 | 10,0 mM | 100 ΜL |
| TDT DE 1 M | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1.0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 ΜL |
| β-glicerol fosfato de 500 mM | 10,0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8,945 mL | |
| + 1 completa Mini ficha/10 mL | 1 tableta de |
Tabla 1. Receta de buffer de lisis (10 mL, 1 X).
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Discussion
Aquí, describimos un método bioquímico relativamente simple para la identificación de sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja. Los pasos críticos de este protocolo se basan en las propiedades enzimáticas inusuales de CK2 e incluyen thiophosphorylation CK2 dependiente de las proteínas sustrato específico utilizando GTPγS y su posterior inmunoprecipitación e identificación. Con estos resultados, hemos demostrado la utilidad y versatilidad de este enfoque como ahora hemos aplicado esta estrategia en células de glioblastoma humano y Drosophila ovarios18.
Un número de estudios previamente publicados utilizando aproximaciones cuantitativas fosfoproteómico de hecho ha demostrado éxito en la identificación de nuevos CK2 sustratos19,20,21,22, 23. sin embargo, algunas de estas estrategias hacen uso de matrices de sustrato inmovilizados, y es posible que la conformación de una proteína inmovilizada puede hacer inaccesibles a la cinasa de un sitio potencial de fosforilación. La técnica aquí descrita permite la fosforilación en un entorno más fisiológica o nativo (es decir, una célula lisado), de tal modo reduciendo la probabilidad de la inaccesibilidad del sitio. Otro beneficio de esta estrategia es que una vez identificación de proteínas por espectrometría de masas, validación de sustratos putativos de CK2 puede fácilmente realizarse en muestras recogidas durante el procedimiento si anticuerpos dirigidos contra el sustrato proteínas de interés están disponibles. Por ejemplo, usando el borrar occidental estándar, se debe observar una reducción en el nivel de la proteína correspondiente en las muestras de agotamiento (post-IP) y su presencia en el anti-thiophosphate ester immunoprecipitates como hemos demostrado de la CK2 conocido nucleolin del sustrato (figura 4).
Una limitación notable de este método es que el último paso del procedimiento antes del análisis por espectrometría de masas se basa en la capacidad de discernir las diferencias discretas en bandas de patrón en un gel. Así, es ciertamente posible que sustratos específicos de CK2 pueden perderse si están de baja abundancia y por lo tanto por debajo del límite de detección visual. Si uno está preocupado por esta posibilidad, puede utilizarse un método más sensible como la tinción de plata para visualizar estas proteínas en lugar de utilizar el azul de Coomassie. Una consideración adicional que debe reconocerse es que no puede identificar un número de CK2 sustratos usando esta estrategia ya que los sitios fisiológicamente relevantes ya será fosforilada en vivo. Esto es casi ciertamente ser el caso dado la actividad constitutiva de CK2. Por último, también cabe señalar que esta metodología sólo identifica proteínas como sustratos putativos de CK2 en vitro. Posteriores ensayos para validar que son fisiológicamente relevantes sustratos de CK2 en vivo son necesarios y deben implica la identificación de sitios de fosforilación dependiente de la CK2 y evaluar si la fosforilación de estos residuos particular es alterada en respuesta a la manipulación de la actividad de la quinasa CK2.
En Resumen, esta estrategia juntada con posteriores aproximaciones experimentales (mapas de sitio de fosforilación por mutagénesis sitio-dirigida, funcionales ensayos in vitro e in vivo , análisis de truncamiento y eliminación, etc.) facilitará el estudio de esta quinasa inusual y aumentará nuestra comprensión de los múltiples roles que desempeña la CK2 en varios sistemas biológicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por una beca de la Commonwealth mejora Universal de investigación del Departamento de salud de Pennsylvania a T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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