Summary
Syftet med detta protokoll är att märka, berika och identifiera substrat av proteinkinas CK2 från en komplexa biologiska prov som en cell lysate eller vävnad Homogenatet. Denna metod utnyttjar unika aspekter av CK2 biologi för detta ändamål.
Abstract
Studien av Kreatinkinas-substrat relationer är avgörande för att få en komplett förståelse för funktionerna hos dessa enzymer och deras nedströms mål i både fysiologiska och patologiska stater. CK2 är en evolutionärt bevarade serin/treonin-Kinas med en växande lista av hundratals substrat inblandade i flera cellulära processer. På grund av dess pleiotropiska egenskaper, att identifiera och karaktärisera en omfattande uppsättning CK2 substrat har varit särskilt utmanande och förblir ett hinder i studien av detta viktiga enzym. För att möta denna utmaning, har vi utarbetat en mångsidig experimentella strategi som möjliggör riktade anrikning och identifiering av förmodad CK2 substrat. Detta protokoll utnyttjar unika dubbla samtidig substrat specificitet CK2 möjliggör specifika thiophosphorylation av dess substrat i en cell eller vävnad lysate. Dessa substrat proteiner är därefter alkylerade, immunoprecipitated, och identifieras av liquid chromatography/tandem masspektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidigare använt denna metod att framgångsrikt identifiera CK2 substrat från Drosophila äggstockarna och här vi utsträcka tillämpningen av detta protokoll till mänskliga glioblastoma celler, som illustrerar anpassningsförmåga med denna metod att undersöka den biologiska roller här Kinas i olika modellorganismer och experimentella system.
Introduction
Proteinkinaser är nyckelkomponenter för signaltransduktion cascades. Fosforylering av substrat proteiner av dessa enzymer framkallar biologiska svar som reglerar kritiska händelser kontrollerar celldelning, ämnesomsättning och differentiering, bland andra. CK2 är en ubiquitously uttryckt, acidofiler serin/treonin-Kinas som är bevarad från jäst till människor och som spelar viktiga roller i många cellulära processer alltifrån Transkriptionsreglering till cellcykelns förlopp till apoptos1 ,2,3. Enzymet är en heterotetramer består av två katalytisk α (eller α') subenheter och två reglerande β-subenheter4. Förutom att vara mycket pleiotropiska, uppvisar CK2 två andra ovanliga egenskaper som komplicerar dess analys, nämligen konstituerande verksamhet5 och dubbla samtidig substrat specificitet6. Detta sistnämnda Boende begåvar CK2 med möjlighet att använda GTP samt ATP för fosforylering av substrat proteiner.
Genetiska radering av katalytisk eller reglerande subunitsna av CK2 hos möss resulterar i embryonal dödlighet som anger att det spelar avgörande roller under utveckling och organogenes7,8. CK2 förekommer också i ökad utsträckning i flera typer av cancer och utgör därmed en lovande terapeutiskt mål9,10,11. Hämmare som målaktiviteten CK2 Kreatinkinas är faktiskt för närvarande under utredning för detta ändamål12,13,14. Medan hämning av CK2 är ett genomförbart alternativ, med tanke på dess pleiotropiska natur, ett alternativ och kanske mer rationellt tillvägagångssätt skulle vara att rikta kritiska CK2 substrat som ligger bakom utvecklingen av vissa cancerformer. Därför, omfattande identifiering och karakterisering av CK2 substrat proteiner skulle vara till stor nytta för belysa specifika funktionerna här Kinas inom en viss typ av vävnad eller tumör.
Här beskriver vi en mångsidig biokemisk metod för att identifiera CK2 substrat från komplexa biologiska prov som en cell eller vävnad lysate. Detta protokoll utnyttjar dubbla samtidig substrat specificitet CK2 genom användning av det GTP analogt GTPγS (guanosin 5'-[γ-thio]triphosphate) som andra endogena kinaser inte kan använda. Detta tillåter effektivt den Kinas att ”märka” dess substrat inom detta prov för efterföljande isolering och identifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Se till att material som behövs är tillgängliga och väl förberedda (se Tabell för material).
1. beredning
- Mekaniskt lysera vävnadsprov (1-2 mg vävnad i 100 µL lyseringsbuffert, tabell 1) eller odlade celler (10 cm platta som är 80-90% konfluenta i 350 μl lyseringsbuffert), med målet är att samla in totalt 900 µL prov för experimentet. Observera att denna volym är i smärre överskott av vad som krävs för experimentet beskrivs nedan.
- Snurra ner proverna genom centrifugering vid 17.500 x g i 3 minuter vid 4 ° C. Efter avslutad, överföra 270 µL av supernatanten till var och en av tre nya 1,7 mL mikrocentrifugrör. Det kommer finnas ca 90 µL kvar. Ta bort 40 µL användas som en ”input control” och placera det i en ny tub. Placera alla prover på is.
2. Kinas assay: thiophosphorylation och alkylering
- Märka tre rören som innehåller 270 µL varje enligt följande: ”Kinas rxn”, ”endast GTPγS”, och ”PNBM (p-nitrobezyl MESYLAT) endast”. Förbereda Kinas reaktionerna.
- ”Kinas rxn” röret, tillsätt 2,7 µL (motsvarande 1,350 U) av CK2, sedan Tillsätt 2,7 µL av 2.5 mM GTPγS.
- Tillsätt 2,7 µL av 2,5 mM GTPγS till ”endast GTPγS” röret, och sedan lägga 2,7 μl lyseringsbuffert.
- Lägga till 5,4 μl lyseringsbuffert till röret ”endast PNBM”. Häll alla rör för att blanda och sedan placera omedelbart på is.
- Inkubera alla tre rör för 1 min i 30 ° C vattenbad. Efter inkubation, lägga till 13,5 µL av 12 mg/mL PNBM alla tre rör. Invertera om du vill blanda prover. Inkubera dessa prover i rumstemperatur i 1 h.
- Efter inkubering i steg 2.2, förbereda avsaltning kolumnerna så snart som möjligt eftersom processen tar cirka 45 min.
3. beredning av avsaltning kolumner
- Initialt förbereda kolumner (3 för detta exempel experiment) genom att vända varje kolumn flera gånger att slamma den Sephadex G-25 harts i lagring bufferten. Låt jonbytaren sedimentera genom att fästa varje kolumn till en klämma stå och låta det sitta ostört under cirka 5 minuter.
- Efter reglerandet av Sephadex G-25 kådan, ta bort locken från både toppen och botten av kolumnen för att tillåta lagring bufferten avtappning av gravitationen och har ett rör som placeras under nedre öppningen till samla genomströmmande för kassera.
- När lagring buffert töms, lägga till cirka 2,7 mL lyseringsbuffert för att temperera kolumnerna. Samla genomströmmande och kassera. Upprepa 3 gånger. Efter den slutliga Jämviktstiden är kolumnerna redo för steg 4.1.
4. borttagning av PNBM
- Efter 1 h långa inkubationen (steg 2.2) och kolumn beredning (steg 3) är kompletta, använda proven på kolumnerna. Märk varje kolumn enligt följande: ”Kinas rxn”, ”bara GTPγS” och ”endast PNBM”. Ladda alla av varje prov på sina respektive kolumn. Samla och kassera genomflöde.
- Tvätta prover genom att lägga till 420 μl lyseringsbuffert varje kolumn. Tillåta lyseringsbuffert att filtrera genom kolonnen och samla genomströmmande för kassera. Efter detta tvättningssteget, placera rören i position för provtagning.
- Eluera prover genom att lägga till 500 μl lyseringsbuffert varje kolumn. Samla den genomströmmande som nu innehåller thiophosphorylated och alkylerade CK2 substrat.
5. Immunoprecipitation: Del I
- Förbereda prover för immunoprecipitation genom första ta bort 80 µL för en ”eluering input control” prov från varje av de respektive elutions (”Kinas rxn”, ”bara GTPγS” och ”endast PNBM”) som samlats in i steg 4,3. Efter avlägsnande av 80 µL från varje prov, kommer det att finnas ca 420 µL återstående per prov.
- Dela varje prov i 2 tuber innehållande 200 µL varje. Märk varje respektive rör: ”Kinas rxn anti-thiophosphate ester”, ”Kinas rxn IgG”, ”GTPγS anti-thiophosphate ester”, ”IgG-GTPγS”, ”PNBM anti-thiophosphate ester” och ”IgG-PNBM”.
- Lägg till 2,8 µg av anti-thiophosphate ester antikropp till var och en av anti-thiophosphate ester-märkt rören och 2,8 µg isotypen kontroll antikroppar av IgG-märkt rören. Placera rören på en rotator vid 4 ° C i 2 h.
- Börja förbereda protein A/G pärla under de sista 15 min av 2 h inkubering i steg 5.2.
6. protein A/G agaros pärla förberedelse
- Kort vortex förvaring röret att säkerställa pärlor är helt nytt svävande. Avskuren i slutet av en P200 pipettspetsen med en ren rakblad för att öka gauge storlek. Pipettera 100 µL av pärla slam per immunoprecipitation till en ny 1,7 mL mikrocentrifug rör. Det här exemplet behövs sammanlagt 6 rör.
- Centrifugera rören på 17.500 x g för 1 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och kassera. Återsuspendering pärlorna i 200 µL lyseringsbuffert och kortfattat vortex. Upprepa spin och tvätta steg 3 gånger.
- Efter den sista tvättningen, placera pärlorna på is tills inkubering i steg 5.2 är klar.
7. Immunoprecipitation: Del II
- Efter 2 h ruvning från steg 5.2, snurra ner proverna på 17.500 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Efter centrifugering tillsätt 200 µL från varje prov till rören med tvättade pärlor. Placera rören på en rotator vid 4 ° C för 1 h.
- Efter 1 h ruvning, Centrifugera rören på 17.500 x g för 1 min vid 4 ° C. Nästa bort 40 µL av supernatanten från varje prov och spara som en ”utarmning kontroll” (totalt 6 rör). Avlägsna återstoden av supernatanten och kassera. Se till att inte störa pärlorna.
- Tvätta proverna genom att tillsätta 200 µL lyseringsbuffert och vortexa kort. Sedan Centrifugera 17.500 x g för 1 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och kassera. Upprepa tvätten och snurra steg 3 gånger. Se till att inte störa pärlorna under dessa steg.
- Efter avslutad tvätt stegen, tillsätt 50 µL 2 x provet buffert i varje prov som innehåller pärlor. För alla andra prover, tillsätt 8 µL av 6 x provet buffert: ”input control”, ”eluering ingående kontroller” och ”utarmning kontroller”.
- När bufferten är lagt på rören, Pipettera upp och ner för att blanda och värma alla prover vid 95 ° C i 5 min innan du fortsätter med SDS-PAGE.
8. analys/validering av resultat
- Verifiera lyckad CK2-beroende thiophosphorylation och alkylering.
- För att avgöra effekten av CK2-medierad thiophosphorylation i steg 2.2, utföra SDS-PAGE och Western blotting genom att köra 15-20 µL av ”eluering ingående kontroller” samlas i steg 5.1 på en 12,5% polyakrylamid gel.
- Sond membran med följande antikroppar: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α, och anti-GAPDH (eller annan lämplig lastning kontroll). Om detta steg var lyckad, bör en förbättrad anti-thiophosphate ester signal vara uppenbar i ”Kinas rxn” körfält jämfört med de andra två körfält (figur 2).
- Visualisera berikad förmodad substrat för CK2 och bestämma protein identitet.
- För att bedöma om immunoprecipitation stegen var framgångsrika, kör 25-30 µL av de prov som elueras från pärlorna i steg 7,4 på en separat 12,5% polyakrylamid gel. Se till att all utrustning är rena och Använd handskar vid alla tillfällen under detta steg att minimera kontaminering.
- Fläcken gelen med Coomassie blå att visualisera berikad proteiner från olika stadier av det experimentellt protokollet (figur 3). Använda nya rakblad, presenterar noggrant punktskatter unika band i ”Kinas rxn anti-thiophosphate ester IP” körfält att notera deras ungefärliga molekylvikter.
- Skicka dessa band för protein identifiering av liquid chromatography/tandem masspektrometri (LC-MS/MS) (figur 4). Om det finns antikroppar riktade mot de identifiera proteinerna bekräfta resultaten av masspektrometri av SDS-PAGE och immunoblotting av input, utarmat och IP fraktioner som samlats in under loppet av protokollet (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En Schematisk bild av det experimentella förfarandet ges i figur 1. Underliggande grunden för tekniken är CK2 ovanliga förmåga att använda GTP för phosphorylen grupp överföring. Tillsats av exogen CK2 holoenzyme tillsammans med det GTP analogt, GTPγS, till en cell lysate resulterar i thiophosphorylation av endogena CK2 substrat. Efterföljande behandling av den lysate med den alkylerande reagens p- nitrobenzyl MESYLAT (PNBM) genererar en thiophosphate ester biexponentiellt på dessa särskilda substrat proteiner som sedan kan immunoprecipitated med en anti-thiophosphate ester antikroppen och slutligen identifieras med masspektrometri. Figur 2 visar ett positivt resultat efter tillägg av CK2 och GTPγS och sedan PNBM till T98G (glioblastoma) cell lysate. Dessa resultat visar att CK2-beroende thiophosphorylation och efterföljande alkylering var framgångsrik. Som förväntat, observeras en förbättrad anti-thiophosphate ester signal av Western blotting bara i körfältet som innehåller komplett Kinas reaktion och inte i GTPγS bara- och PNBM bara-behandlade prover. Visas i figur 3 är en Coomassie blå-färgade gel av immunoprecipitated och eluerat proteiner med isotypen kontroll IgG eller anti-thiophosphate ester antikroppar i närvaro eller frånvaro av överskjutande CK2 och/eller GTPγS. Dessa data visar också ett positivt resultat som flera unika band märks bara i anti-thiophosphate ester IP körfält där den lysate var inkuberas med exogena CK2 och GTPγS. Bandet som anges med en asterisk censurerade från gelen och fram för protein identifiering av masspektrometri. Figur 4 illustrerar representativa uppgifter som erhållits genom massa spektrometriska analys inklusive protein identifiering, procentuella täckningen och antal unika peptider identifieras per protein inom bandet. Som visas är de tio bästa hitsna från inlämnade bandet (figur 3) och information om huruvida proteinet tidigare har identifierats som ett substrat CK215,16,17. Identiteten på en av de kända immunoprecipitated CK2 substratesna, nucleolin15, bekräftades av SDS-PAGE och immunoblotting av de angivna fraktioner med hjälp av en anti-nucleolin antikropp.
Figur 1: Schematisk bild av den experimentella strategin. Det GTP analogt, GTPγS, tillsammans med överskott rekombinant CK2 holoenzyme läggs till i en cell eller vävnad lysate och möjliggör thiophosphorylation av substrat av CK2 men inte av andra endogena kinaser. Thiophosphorylated substrat är nästa alkylerade med PNBM, genererar en thiophosphate ester biexponentiellt på dessa proteiner, som fångas sedan via immunoprecipitation (IP) för efterföljande identifiering av flytande kromatografi-tandem mass spectrometry ( LC-MS/MS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: validering av CK2-beroende thiophosphorylation i hela cell lysate. Hela cellen lysates beredd från T98G celler inkuberades med GTPγS i närvaro (Kinas reaktion) eller frånvaro (GTPγS bara) av exogena rekombinant CK2 holoenzyme. PNBM lades därefter till de angivna reaktionerna och prover löstes av SDS-PAGE följt av immunoblotting med de angivna antikropparna. Protein molekylvikt markörer anges i kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunoprecipitation av förmodad CK2 substrat proteiner. Anrikning och visualisering av förmodad CK2 substrat (tredje lane) är uppenbart som flera unika band efter immunoprecipitation med anti-thiophosphate ester antikroppar. Immunoprecipitates löstes av SDS-PAGE och gelen var fläckade Coomassie blå. Bandet med asterisk censurerade från gelen och fram för protein identifiering av masspektrometri. Protein molekylvikt markörer anges i kDa. IP = immunoprecipitation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Identifiering och bekräftelse av proteiner som substrat för CK2 in vitro-. Data som erhållits genom masspektrometri visar att såväl tidigare kända15,16,17 som förmodad roman CK2 substrat identifierades med hjälp av detta experimentella tillvägagångssätt. Visas är topp tio proteiner identifierats från exciderad bandet (överst). Identiteten hos nucleolin, en känd CK2 substrat, bekräftades av immunoblotting av de angivna fraktioner med hjälp av en anti-nucleolin antikropp (nederst). Protein molekylvikt markörer anges i kDa. IP = immunoprecipitation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens lager koncentration | Reagens slutlig koncentration | Exempel volymer lagt till utifrån lager koncentrationer |
| 1 M Tris pH 7,4 | 20.0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20.0 mM | 50 ΜL |
| 20% Triton x-100 | 0,50% | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DTT | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1,0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-glycerol fosfat | 10,0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 komplett Mini flik/10 mL | 1 tablett |
Tabell 1. Lysis buffert recept (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en relativt enkel biokemiska metod för att identifiera substrat av proteinkinas CK2 från ett komplext biologiskt prov. De kritiska steg i detta protokoll baseras på CK2 ovanliga enzymatisk egenskaper och inkluderar CK2-beroende thiophosphorylation av särskilda substrat proteiner använder GTPγS och deras efterföljande immunoprecipitation och identifiering. Med dessa resultat, har vi visat nytta och mångsidigheten hos denna strategi som vi nu har tillämpat denna strategi i både mänskliga glioblastoma celler och Drosophila äggstockarna18.
Ett antal tidigare publicerade studier med kvantitativ phosphoproteomics metoder har verkligen visat sig framgångsrika i att identifiera roman CK2 substrat19,20,21,22, 23. dock vissa av dessa strategier gör använda immobiliserade substrat matriser, och det är möjligt att konformation av en immobiliserade protein kan återge en potentiell fosforylering plats otillgängliga för tyrosinkinashämmare. Den teknik som beskrivs här tillåter fosforylering inom en mer fysiologisk eller infödda miljö (dvs. en cell lysate), därmed minska sannolikheten för webbplatsen otillgänglighet. En annan fördel med denna strategi är att när protein identifiering bestäms av masspektrometri, validering av förmodad CK2 substrat kan enkelt utföras på prover som tagits under förfarandet om antikroppar riktade mot underlaget proteinernas sevärdheter finns tillgängliga. Exempelvis bör använder standard western blotting, en observera en minskning av nivån på de relevanta proteinet i utarmat (post-IP) proverna och dess närvaro i den anti-thiophosphate ester immunoprecipitates som vi har visat för den kända CK2 substratet nucleolin (figur 4).
En betydande begränsning av denna metod är att det sista steget i förfarandet före analys av masspektrometri bygger på förmågan att urskilja diskreta skillnader i banding mönstret på en gel. Därför är det säkert möjligt att specifika CK2 substrat kan missas om de är av låg överflöd och därför nedan visuella detektionsgränsen. Om man oroas över denna möjlighet, kan en känsligare metod såsom silverfärgning användas för att visualisera dessa proteiner istället för att använda Coomassie blå. En ytterligare faktor som bör erkännas är att ett antal CK2 substrat inte kan identifieras med hjälp av denna strategi eftersom fysiologiskt relevanta webbplatser kommer redan att fosforyleras i vivo. Detta är nästan säkert att så är fallet ges CK2 konstituerande verksamhet. Slutligen bör det också noteras att denna metod endast identifierar proteiner som förmodad substrat för CK2 i vitro. Efterföljande analyser att validera att dessa är fysiologiskt relevanta substrat för CK2 i vivo krävs och bör innebära identifiering av CK2-beroende fosforylering platser och bedöma om fosforylering av dessa särskilda restprodukter är ändras som svar på manipulation av CK2 Kinas aktivitet.
Sammanfattningsvis, kommer att denna strategi tillsammans med nedströms experimentella metoder (fosforylering webbplats mappning av trunkering/radering analys, webbplats riktad mutagenes, funktionellt in vitro och i vivo analyser, etc.) underlätta studien Denna ovanliga Kinas och kommer att öka vår förståelse av de olika roller som CK2 spelar i flera biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av Commonwealth Universal forskning Enhancement bidrag från Pennsylvania hälsodepartementet till T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
