Summary
在 rna 病毒复制过程中产生的双链 rna 可以通过模式识别受体来识别, 从而诱导先天免疫反应。对于负感 rna 病毒, 低水平 dsrna 和 prr 之间的相互作用仍不清楚。我们开发了一种共聚焦显微镜方法, 用于在单个细胞中显示腺病毒 dsrna 和 prr。
Abstract
双链 rna 是在 rna 病毒感染过程中作为复制中间体产生的。通过宿主模式识别受体 (prr) (如维甲酸 (MDA-5) 样受体 (rlr) 和黑色素瘤差异相关蛋白 5 (mda-5)) 识别 dsrna, 从而诱导先天免疫反应。在正感 rna 病毒感染中, dsrna 的形成和细胞内分布已通过显微镜观察。许多负面的 rna 病毒, 包括一些芳烃病毒, 在感染过程中触发先天免疫反应。然而, 负感 rna 病毒被认为产生低水平的 dsrna, 这阻碍了对病毒 dsrna 的 prr 识别的成像研究。此外, 高致病性芳烃的感染实验必须在高遏制生物安全设施 (bsl-4) 中进行。病毒 rna 和高致病性 rna 病毒的 prr 之间的相互作用在很大程度上是未知的, 因为研究人员需要在 bsl-4 设施中面临额外的技术挑战。最近, 一种最初用于泛肠病毒检测的单克隆抗体 (mab) (克隆 9d5) 被发现能够以比传统的 j2 或 k1 抗 dsrna 抗体更高的灵敏度专门检测 dsrna。在此, 通过使用9d5 抗体, 我们描述了一种共聚焦显微镜协议, 该协议已成功地用于在感染芳烃病毒的单个细胞中同时显示 dsrna、病毒蛋白和 prr。该方案也适用于 bsl4 设施中致病性腺病毒感染细胞的 dsrna 和 prr 分布的成像研究。
Introduction
诱导先天免疫反应的第一步是通过模式识别受体 (prr) (如维甲酸 (rigi) 样受体 (rlr) r-i 和黑色素瘤差异相关的双链 rna 的宿主识别蛋白 5 (mda-5)1。对于正感 rna 病毒, 通常可以使用 j2 或 k1 抗 dsrna 单克隆抗体 (mab)2很容易检测到 dsrna。利用共聚焦显微镜3对阳性链 rna 病毒 (如 picornas-病毒) 中 dsrna 和 prr 之间的相互作用进行了表征。然而, 对于负感 rna 病毒, prr 和 dsrna 相互作用的可视化和表征由于缺乏对 dsrna 的敏感抗体而受到阻碍。rna 荧光原位杂交 (fish) 已被应用于病毒 rna 和 prrs4 的可视化。然而, fish 方法要求了解目标 rna 序列, 并且可能与 prr 共染色不兼容。最近, 9d5 mab, 最初是为诊断泛肠病毒感染而开发的, 被发现比 j2 mab 更敏感, 并且可以很容易地检测到 dsrna 在负感 rna 病毒感染5,6。因此, mab 9d5 是研究负感 rna 病毒的病毒复制以及 prr 与病毒 rna 相互作用的一种新的有用工具。
竞技场病毒是单链、负感 rna 病毒的家族, 包括几种人类病原体, 如拉萨病毒 (lasv)、junín 病毒 (junv) 和 machupo 病毒 (macv), 这些病毒在人类中引起严重的出血热疾病7。新世界腺病毒引起的阿根廷严重和致命出血热病例的临床数据显示出异常高的血清 ifn-α08,9。我们已经证明, 致病性的 nw 芳烃 (junv 和 macv), 而不是致病性的旧大陆腺病毒, lasv, 诱导 i 型干扰素 (ifn) 反应在人类单核细胞衍生树突状细胞10。此外, rigi 是在 junv 感染细胞11中介导 i 型 ifn 响应的传感器之一。我们还发现, 蛋白激酶 r (pkr) 受体, 这是传统上已知的 dsrna 识别, 被激活的致病性 nw 腺病毒感染12。为了进一步了解腺病毒感染过程中病毒特异性 ifn 反应的机制, 我们的目标是开发一个协议, 以可视化病毒 dsrna 与细胞质 prr 之间的相互作用。
对致病性 junv、macv 和 lasv 的感染实验必须在生物安全第4级 (bsl-4) 设施中进行。因此, 除了在芳烃病毒感染中形成的 dsrna 水平可能较低之外, 在对这些高致病性病毒进行成像研究时, 满足生物安全要求是另一个技术挑战。本报告利用 junv 的9d5 抗体和 candid1# 疫苗株, 描述了一种基于共聚焦显微镜的协议, 该协议已成功地用于在感染芳烃病毒的细胞中同时显示 dsrna、病毒蛋白和 prr。bsl2 实验室。该方案也适用于 bsl4 设施致病性腺病毒感染过程中 dsrna 和 prr 的细胞内分布的可视化。
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Protocol
1. a549 细胞的制备和 junv 感染
- 种子 2 x 10 5 人肺上皮 a549 细胞到多 d-赖氨酸 (pdl) 涂层玻璃覆盖物在12孔板在感染前24小时。
- 在 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 培养基中稀释的每细胞1.0 斑块形成单位的感染 (moi) 中, 以2% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素和链霉素 (p/s) 为补充, 制备150毫升的 junm13 等价物).
- 从细胞培养中删除介质。在每口含有盖板的井上加入病毒接种剂, 在37°c 下孵育1.5 小时。每15分钟摇晃一次盘子。
- 取出病毒接种物, 加入1毫升的 dmem, 辅以5% 的 fbs 和1% 的 pss, 在37°c 孵育板达到所需的时间点。
2. 固定和免疫染色
- 激励媒体。在每口井中加入1毫升的磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 补充钙和镁, 冲洗细胞。
- 删除 pbs。在-20°c 预冷, 在-20°c 或干冰上孵育 15分钟, 加入1毫升甲醇 (meoh)。
- 把美欧移开
- 在每口井中加入1毫升的 pbs, 在4°c 下清洗样品, 轻轻摇晃 5分钟, 重复清洗共4次。
- 在4°c 时, 用 0.2%-辛氧基苯氧乙烯醚在1毫升的盖板上清洗固定细胞 5分钟, 轻轻摇晃。
- 在每口井中添加1毫升的 pbs。在4°c 下清洗样品 5分钟, 轻轻摇晃。重复清洗步骤, 共4次。
- 为了检测 dsrna 和 mda5, 在2% 的牛血清白蛋白 (bsa) 中稀释的200毫升原代抗体中培养样本。在1:2 稀释时稀释抗 dsrna 9d5 抗体, 在1:2 稀释抗 anti-dsRNA 抗体。在4°c 下轻轻摇晃过夜。
- 去除原代抗体, 用1毫升的 pbs 清洗每口井 5分钟, rt 轻轻摇晃, 再重复4次。
- 加入200毫升的二级抗体 (1:2000 稀释), 在3% 的 bsa 中稀释, 并在 rt 孵育1小时。
- 去除二级抗体, 用1毫升的 pbs 清洗每口井 5分钟, rt 轻轻摇晃, 再重复4次。
- 为了检测 junv 核蛋白 (np) 和 rigi i, 加入在 3% bsa 中稀释的200毫升共轭抗体。在1:1000 时稀释共轭的抗 junv np (ag-12), 在 rt 孵育2小时的样品, 轻轻摇晃。在1:500 稀释共轭抗 rigi 抗体, 在4°c 孵育, 轻轻摇晃。
- 去除共轭抗体, 用1毫升的 pbs 清洗每口井 5分钟, rt 轻轻摇晃, 再重复4次。
- 用 dapi (1:1000) 对抗盖板 3分钟, rt 轻轻摇晃。
- 将盖板清洗 3次, 每次 5分钟, 在1毫升0.5% 的 t-octyd 聚氧乙烯醚, 并在 rt 轻轻摇晃。
- 每次在 rt 轻轻摇晃, 在1毫升的 pbs 中清洗两次, 每次5分钟。
- 在 rt清洗1 毫升的 ddh2o 1分钟, 轻轻摇晃。
- 使用安装介质将盖板安装在玻璃幻灯片上。让治疗一夜。
- 用指甲油密封滑梯, 空气干燥1小时。
- 在共聚焦显微镜上使用 60x·1.42 数字孔径油浸入镜头使用相同的激光发射每个样品。
- 在分析数据时, 如有必要, 请对所有样品使用相同的线性调整来调整亮度和对比度。
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Representative Results
该方案用于研究 rlr (rigi 和 mda-5) 与 dsrna 在 junv 感染细胞中的分布和共化。如图 1和图 2所示, 随着病毒感染的进展, dsrna 的积累会随着时间的推移而增加。浓度 mda-5 (图 1) 和 rigi (图 2) 信号与 np 和 dsrna 的点状结构同相化。
图 1: dsrna 和 junv np 形成的时间过程和 mda-5 的分布.根据该协议, 在感染后24、36和48小时内固定、染色和成像的 junv 感染 a549 细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: dsrna 和 junv np 形成的时间过程和 rig-i 的分布.根据协议, 在24、36和 48 hpi 时, 对感染 junv 和模拟感染的 a549 细胞进行了固定、染色和成像。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
对于正感 rna 病毒和 dsdna 病毒, dsrna 很容易被广泛使用的 j2 抗 dsrna 抗体检测。然而, 负感 rna 病毒被认为在低或低于检测水平产生 dsrna 使用相同的抗体2。因此, 病毒 rna 和 prr 相互作用的许多方面在很大程度上是不清楚的负感 rna 病毒。我们试图使用 j2 抗体染色牙病毒感染中的 dsrna, 但与模拟感染相比, 荧光信号是不可微的。最初用于泛肠病毒检测的 mab 9d5 被发现是特定于 dsrna 的, 比 j2 抗体5更敏感。该抗体已成功地用于检测病毒 dsrna 在负感 rna 病毒感染期间, 包括原型芳香细胞病毒淋巴细胞性脉络膜炎病毒5,6,14。因此, 我们使用 mab 9d5 共同染色 dsrna、病毒 np 和 prr 的存在, 以进一步了解它们在芳烃病毒感染期间在单个细胞中的分布和相互作用。
有多种固定方法可用于保存细胞结构。与 meoh 固定作用由沉淀蛋白作用, 而甲醛和福尔拉林交联蛋白。meoh 比醛更有效地保存细胞中的核酸, 并提供低背景免疫染色。甲醇还能去除细胞中的脂质, 从而同时渗透细胞膜 15.在这个协议中, 细胞是用冰凉的 meoh 固定的。还尝试了其他固定方法, 包括固定样品与4% 的甲醛, 福尔拉林, 甲醛其次是甲醇, 甲醇, 其次是甲醛。然而, 在使用甲醛或福尔拉林时, 在模拟感染细胞中观察到高基础水平的非特异性染色。根据结果的敏感性和特异性, 将 meoh 固定在-20°c。原发抗体染色前, 用 3% bsa、5% bsa 和10% 或5% 山羊血清进行30分钟至1小时的样品阻断测试, 但均导致非特异性背景染色。在抗体稀释中, 无需阻断步骤, 直接使用 3% bsa, 取得了较好的效果。最大限度地减少背景信号的关键步骤是 pbs 和 t-octy案子合氧聚氧乙烯醚固定后清洗。虽然市售的9d5 抗体被毒液稀释, 可供直接使用, 但用 3% bsa 稀释 1: 2 抗体也效果很好。在 dsrna 信号较弱的情况下, 可以在不稀释的情况下使用抗体。
该方案可用于研究 dsrna 与 prr 在腺病毒感染中的相互作用。虽然这种方法是在 bsl-2 环境中开发的, 但本文所述的甲醇固定允许对腺病毒完全失活。因此, 同样的协议可用于 bsl-4 设施中高致病性芳烃 (即 lasv、junv 和 macv) 的成像研究。也可以将该协议应用于其他 rna 病毒的研究。为了获得最佳结果, 可能需要修改协议。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢 utmb 成像核心设施和 maxim ivnikov 的显微镜协助。
这项工作得到了公共卫生服务机构向 sp、给方案的 utmb 承诺基金 p84373 和 t32 ai007526 至 em 的 RO1AI093445 和 ro1aia129198 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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