Summary
Natação induzida por paralisia (SWIP) é um ensaio comportamental bem estabelecido, usado para estudar os mecanismos subjacentes de dopamina sinalização em Caenorhabditis elegans (c. elegans). No entanto, falta um método detalhado para realizar o ensaio. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para SWIP.
Abstract
O ensaio de natação descrito neste protocolo é uma ferramenta válida para identificar proteínas regulando o dopaminérgico sinapses. Semelhantes aos mamíferos, dopamina (DA) controla várias funções em c. elegans , incluindo atividade de aprendizagem e motor. Condições que estimulam a liberação DA (por exemplo, tratamentos de anfetamina (ANF)) ou que impedem DA autorização (por exemplo, animais faltando o transportador DA (dat-1) que são incapazes de reaccumulating para os neurônios) gerar um excesso DA extracelular em última análise, resultando em locomoção inibida. Esse comportamento é particularmente evidente quando os animais nadam na água. Na verdade, enquanto animais selvagem-tipo continuam a nadar por um longo período, dat-1 nula mutantes e selvagem-tipo tratadocom com ANF ou inibidores do transportador DA afundam até o fundo do poço e não se mexa. Esse comportamento é denominado "Natação paralisia induzida" (SWIP). Embora o ensaio SWIP está bem estabelecido, uma descrição detalhada do método está faltando. Aqui, descrevemos um guia passo a passo para executar SWIP. Para realizar o ensaio, larvas finais estágio-4 animais são colocados em uma placa de ponto de vidro contendo solução de sacarose de controle com ou sem ANF. Os animais são marcados por seu comportamento de natação ou manualmente pelo visualização sob um estereoscópio automaticamente por gravação com uma câmera montada sobre o estereoscópio. Vídeos são então analisados usando um software de rastreamento, que produz uma representação visual da frequência de debulha e paralisia na forma de mapas de calor. Ambos os sistemas manuais e automatizados garantem uma leitura facilmente quantificável de capacidade de natação dos animais e, assim, facilitam a triagem para animais com mutações dentro do sistema dopaminérgico ou para auxiliares genes. Além disso, SWIP pode ser usado para elucidar o mecanismo de ação de drogas de abuso como a ANF.
Introduction
Animais executam uma variedade de comportamentos inatos e complexas que são mediadas por neurotransmissores diferentes, coordenados por intrincados processos de sinalização. A neurotransmissor dopamina (DA) Medeia comportamentos altamente conservados entre espécies, incluindo a aprendizagem, a função motora e processamento de recompensa.
C. elegans, o nematódeo de solo com um sistema nervoso bem mapeado e relativamente simples consistindo de apenas 302 neurônios, mostra comportamentos marcadamente complexos, incluindo muitos que são regulados pelo DA como acasalamento, aprendendo, forrageamento, locomoção e postura de ovos 1. entre outras características, ciclo de vida curto, facilidade de manuseio e conservação de moléculas de sinalização, destacar as vantagens do uso de c. elegans como modelo para estudar a base neural dos comportamentos conservadas.
O hermafrodita c. elegans contém oito neurônios dopaminérgicos; Além desses, o macho contém seis pares extras para fins de acasalamento. Como em mamíferos, estes neurônios sintetizam DA e expressam o transportador DA (DAT-1), uma proteína de membrana encontrada exclusivamente em neurônios dopaminérgicos, que transporta DA liberada na fenda sináptica volta para os neurônios dopaminérgicos. Além disso, a maioria das proteínas envolvidas em cada etapa da síntese, a embalagem e a liberação DA é altamente conservada entre os vermes e os seres humanos e, como nos mamíferos, DA modula comportamentos de alimentação e locomoção em c. elegans2.
C. elegans rasteja sobre superfícies sólidas e nada com um comportamento característico de goleada na água. Curiosamente, mutantes, falta de expressão do DAT-1 (dat-1) rastejam normalmente na superfície sólida, mas não conseguem sustentar natação quando imerso em água. Este comportamento foi denominado paralisia induzida de natação, ou SWIP. Experiências anteriores demonstraram que SWIP, em parte, é causado por um excesso na fenda sináptica que, finalmente, estimula os receptores pós-sinápticos D2-like (DOP-3). Embora originalmente identificado em dat-1 nocaute animais3, SWIP também é observado no tipo selvagem animais tratados com drogas que bloqueiam a atividade de DAT (por exemplo, imipramina4) e/ou induzir DA liberação (por exemplo, anfetaminas5). Por outro lado, manipulações farmacológicas ou genéticas evitando a síntese e liberação DA e DOP-3 receptor função de bloqueio impedem SWIP6. Tomados em conjunto, estes dados já publicados estabeleceram SWIP como uma ferramenta confiável para estudar os efeitos comportamentais causados pela mutação proteínas dentro dopaminergic sinapses3,4,7 e a ser empregado para telas de genéticas para a frente para a identificação das vias reguladoras romance envolvidas em DA sinalização7,8,9,10,11,12. Além disso, fornecendo uma leitura facilmente quantificável de comportamento induzido em animais vivos, SWIP permite a elucidação dos mecanismos de ação de drogas como anfetaminas (ANF) e azaperona no dopaminérgico sinapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolos para a realização de ensaios os SWIP têm sido descritos antes16. Aqui, descrevemos em detalhe a metodologia e a instalação para realizar o ensaio com o objetivo de fornecer um guia visual para a comunidade de c. elegans executar eficazmente SWIP.
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Protocol
1. preparação de soluções e meios de comunicação
- Preparar a M9 reserva dissolvendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e g NaCl 5.0 (85,5 mM) em 1 litro de água destilada esterilizada. Adicione 1,0 mL de 1m MgSO4 (12 g em um volume final de 100 mL de água deionizada esterilizada) após a esterilização em autoclave. Mistura de 100 mL do resultante x 10 M9 com 900 mL de autoclavados deionizada para fazer uma solução de 1x.
- Para fazer a reserva do ovo, dissolva 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g de MgCl2-6 H2O (2 mM) e 5,958 g (25 mM) de HEPES em 1 litro de água destilada esterilizada. Ajuste o pH para 7,3 usando NaOH.
- Prepare a solução de hipoclorito de sódio/NaOH fresco, adicionando 1 mL de 5-6% de hipoclorito de sódio (água sanitária) e 180 µ l de 10 N de NaOH a 3,8 mL de água desionizada.
- Pesar de sacarose de 60 g e dissolver em água deionizada esterilizada até um volume final de 100 mL para fazer 60% de solução de sacarose.
- Dissolva 0,684 g de sacarose em 10 mL de água desionizada autoclavada tornar sacarose 200 mM. Verificar e ajustar para o mesmo uma osmolaridade usando aparelhos. Fazer alíquotas de 1 mL em 1,5 mL microcentrifuge tubos e congelar a-20 ° C.
- Pesar, 0,184 g de ANF (peso molecular 184.75 g/mol) e dissolver em 10 mL de água desionizada, tornar-se uma solução estoque de 100 mM. Misture 2 µ l da solução estoque em 400 µ l de água para fazer a solução de trabalho de 0,5 mM.
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Preparar o crescimento nutriente placas de mídia (NGM)
- Mix 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptona, 25 g de bacto ágar e 975 mL de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L. Inclua uma barra de agitação magnética e autoclave (121 ° C, 15 PSI) por 1 hora usando ciclo de líquido.
- Arrefecer e manter a temperatura a cerca de 50 ° C, colocando o frasco em um aquecedor, agitando. Adicionar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2 e 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g de K2HPO4 deionizada para 1 L).
- Pipetar 25 mL cada para placas de Petri 100 x 15 mm e permitir que os meios de comunicação solidificar. Armazene as placas de cabeça para baixo a 4 ° C em uma caixa por até 4 semanas.
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Preparação de caldo de caldo de carne (LB) lisogenia
- Dissolva 5 g de mistura de pó LB em 200 mL de água deionizada em um balão de Erlenmeyer. Ciclo de autoclave para 30 minutos utilizando a esterilização de líquidos. Deixe o caldo esfriar. Armazenar em temperatura ambiente por 1-2 semanas.
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Preparação das placas bacterianas NA22
- Use uma ponta de pipeta estéril ou um loop bacteriano estéril para marcam uma placa LB com um pequeno volume de NA22 Escherichia coli bactérias do estoque de glicerol e incubar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para crescer colónias isoladas. Pegam e introduzir uma única colônia em 200 mL de caldo LB preparado no passo 1.8 e deixe crescer durante a noite a 37 ° C em uma plataforma de agitação.
- Para propagar as placas, dispense 200 µ l de cultura bacteriana nas chapas de NGM preparado anteriormente na etapa 1.7 e espalhar com um taco de hóquei de vidro estéril. Deixe as placas secar durante a noite ou mais sob um capuz e armazenar de cabeça para baixo em uma caixa hermética a 4 ° C.
- Para tornar a ferramenta Pestana/platina para pegar vermes, cola um cílio grosso ou um filamento de platina em um vidro Pasteur pipeta usando super bonder. Corte a ponta da pestana em ângulo usando uma lâmina de barbear. Alternativamente, um bico de Bunsen pode ser usado para derreter a ponta da pipeta de vidro em torno do filamento de platina.
2. criação de c. elegans
Nota: Cultura do selvagem-tipo N2C. elegans estirpe em placas de NA22 de Escherichia coli . Os métodos de cultura detalhadas são descritos abaixo.
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Preparação da cultura worm
- Para fazer uma cultura de vermes, cortar um pequeno pedaço de ágar de uma placa contendo animais bem alimentados e transferi-lo em uma placa de bactérias NA22 Escherichia coli preparada na etapa 1.9 usando uma espátula estéril. Incube as placas a 20 ° C por 3-4 dias. Sob um microscópio estéreo, confirme visualmente a presença de adultos gravid.
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Preparação da população sincronizada de vermes
- Colete gravid adultos de pelo menos 2 placas pelo fornecimento de água deionizada esterilizada ao redor da placa usando uma garrafa de esguicho. Agite suavemente a placa para desalojar os vermes e coletar os vermes em um tubo cônico poliestireno 15 mL com uma pipeta descartável de plástico.
- Girar o tubo em uma centrífuga a 140 x g por 2 min para os vermes de pelotas e, em seguida, Aspire o sobrenadante usando uma bomba de vácuo ou com construído no vácuo de laboratório.
- Ressuspender e lave os vermes, preenchendo o tubo com água destilada esterilizada e mistura e centrifugar 140 x g por 2 min. Aspire o sobrenadante e repetir este último passo dois mais vezes ou até vermes são claras de bactérias (água parece clara quando misturado com os vermes).
- Adicionar 5 mL de solução de hipoclorito de sódio/NaOH recém-feitos (etapa 1.3) para a pelota de minhoca e misture rapidamente usando um vórtice. Incube o tubo em um balancim para cerca de 4-8 min. O tempo de incubação com solução de hipoclorito de sódio/NaOH oscila entre 4-8 minutos, baseados na qualidade da solução estoque de hipoclorito de sódio (água sanitária).
- Coloque uma gota (2-50 µ l) de solução contendo worms em um vidro de microscópio e verificar cada 2min sob o microscópio para lise de verme. Quando cerca de 70% dos vermes lysed e ovos são liberados, preencher o tubo com buffer de ovo preparado na etapa 1.2 e imediatamente Centrifugue durante 1 min a x 140 g para os embriões de pelotas e carcaças de verme.
- Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento 3 vezes mais preenchendo cada vez que o tubo com buffer de ovo. Spin para baixo a 140 x g por 1 min e retirar o sobrenadante de cada vez. A pelota fica branca no final de lavagens.
- Após a lavagem final, separe os embriões as carcaças mortas em 30% de solução de sacarose. Adicionar 5 mL de água destilada esterilizada ao pellet, resuspenda e adicionar 5 mL de 60% de sacarose preparada na etapa 1.4. Misture bem e centrifugar a 160 x g durante 6 minutos.
- Use um pipeta Pasteur de vidro para transferir os embriões flutuando no menisco superior em um tubo cónico de 15 mL. Não tome mais de 3-4 mL. Para remover qualquer restante sacarose, lave os embriões 3 vezes com água esterilizada por centrifugação a 140 x g durante 3 min, remover o sobrenadante e resuspending a pelota (e o tubo de enchimento) cada vez.
- Repita as lavagens com 1 x M9 de buffer. Após a lavagem final, resuspenda o pellet em 10 mL de M9. Deixe os tubos num agitador durante a noite (não mais que 14 h) para os ovos, que eclodem em larvas de L1. Worms permanecerá em fase larval L1 devido à falta de comida.
- Larvas de lavagem a L1 3 vezes com água esterilizada para remover qualquer feromônios liberados pelas larvas por centrifugação a 140 x g por 2 min. Ressuspender as larvas em 1 mL de água. Fazer um 01:10 diluição dos vermes na água, Pipetar uma queda de 10 µ l em uma lâmina de vidro, colocar uma lamela e contar o número de minhocas sob um estereoscópio. Repita isso duas vezes e a média dos resultados.
- Pipetar o volume de vermes que corresponde a cerca de 1.000 worms em um prato de NA22 (que anteriormente foi trazido à temperatura ambiente) colocando pequenas gotas na placa. Deixe a placa entreabertas até seca a gota. Em seguida, cobrir a placa e incubadora de 20 ° C por cerca de 44-48 h ou até que os vermes chegam a fase tardia de L4, tal como foi confirmado visualmente sob um estereomicroscópio, incubar de cabeça para baixo. Agora os vermes estão prontos para ser testado para SWIP.
3. SWIP
Nota: Descrevemos o método manual de avaliação SWIP em selvagem-tipo worms tratados com ANF. Discutimos também brevemente o rastreamento de vermes e posterior análise da cinética de worm usando um rastreador de worm automatizado e um software de rastreamento que anteriormente foram descritos por Hardaway et al10.
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Método manual para testar SWIP
- Alíquota de 40 µ l de solução de sacarose, 200 mOsm/L com ou sem 0,5 mM ANF em uma placa de ponto de vidro. Sob o estereoscópio, pick 8-10 tarde-L4 palco vermes com um cílio ou platina escolher e mergulhe a palheta na placa contendo a solução até vermes saiam a palheta e nadam na solução. Anote o número de minhocas que escolheu para o poço, iniciar o temporizador, observar e registrar o número de vermes exibindo SWIP em cada minuto marca.
- Copie os dados brutos em uma planilha e calcular a porcentagem de vermes paralisados, dividindo o número de vermes paralisado no cada minuto pelo número total de vermes testados durante todo o ensaio e multiplique por 100. Copiar os valores de porcentagem para quaisquer gráficos e enredo e software estatístico os dados com valores de porcentagem no eixo Y e tempo no eixo utilizando o gráfico XY X formato.
- Execute a ANOVA de duas vias seguido de análise post-hoc (por exemplo, Bonferroni pós-teste) para testar a significância estatística entre controle, grupos de ANF e tempo de tratamento.
-
Análise automatizada de SWIP
- Execute análise automatizada em um único verme de cada vez. O protocolo para definir câmera, o software do tracker worm e o script para executar o software de rastreamento análise são descritas em detalhes no Hardaway et al.16.
- Brevemente, coloque uma hermafrodita de fase única tarde L4 em uma placa de vidro local utilizando um furador de cílios, conforme descrito no método manual na seção 3.1.2. Gravar vídeos de natação de um verme no momento e usar o software tracker worm para calcular a frequência das curvas do corpo.
- Siga o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de goleada do worm e para gerar mapas de calor a partir dos dados de goleada do worm.
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Representative Results
Nós apresentamos um exemplo de ensaio SWIP induzido pelo tratamento de ANF. A Figura 1 mostra uma representação esquemática da instalação do ensaio conforme descrito acima. Para o ensaio manual, aproximadamente 8-10 idade sincronizado tarde L4 palco vermes são coletados com um cílio ou platina escolher e colocado em uma placa de vidro local repleto de 40 µ l de 200 mOsm/L sacarose (solução controle) ou sacarose com 0,5 mM ANF e testado para SWIP.
Quando animais parem de nadar (ou seja, exibem SWIP), eles rapidamente afundar até o fundo do poço e não se mexa. Portanto, a discriminação entre os animais que ainda nadam na superfície da água contra aqueles que estão firmes no fundo do poço é muito simples. A maioria dos vermes testado em mergulho de solução controle continuamente pelo menos 10 minutos, enquanto sob tratamento ANF, aumenta o número de animais exibindo SWIP progressivamente. A porcentagem máxima de animais exibindo SWIP é proporcional à concentração de ANF usado1,5,13. Quando os vermes de DAT-1 nocaute (dat-1) são testados em solução de controle, vermes de 40-70% apresentam SWIP dentro de 10 minutos,4,13. Esse resultado é comparável à percentagem de animais paralisados, medido em tipo selvagem animais tratados com 0,5 mM ANF (Figura 2).
Vermes expostos à sacarose ou sacarose contendo ANF não mostram SWIP no primeiro minuto de observação (Figura 2). No entanto, enquanto vermes tratados com sacarose continuam a nadar durante 10 minutos, vermes tratados com ANF começam a exibir SWIP após 2 minutos de tratamento e após 10 minutos, 66 ± 3% animais mostram SWIP (Figura 2).
Para a análise automatizada, registam-se vídeos de vermes sob controle ou tratamentos ANF um worm de cada vez usando um software de gravação de vídeo. Um computador software de rastreamento é usado para controlar a surra de verme e os dados resultantes são importados e analisados com o terno de software. Exemplos de mapas de calor dos animais expostos ao controle ou ANF, exibindo ativamente mover animais em minhocas vermelhas e paralisadas em verde, está mostrado na Figura 3.
Figura 1 : Ensaio definido para SWIP. Gravid adultos vermes do selvagem-tipo (N2) foram lysed com hipoclorito de sódio/NaOH tratamento para liberar os embriões. Os embriões foram permitidos para chocar e se desenvolvem em larvas de L1 sincronizadas no buffer de M9 para 14 h num agitador e depois banhados em um prato NGM inoculado com bactérias NA22. Após 42-48 h tarde larvas L4 foram visualmente identificadas sob o estereoscópio selecionou com um picador de cílios em um prato local com ou sem anfetamina em solução de sacarose de controle e marcou para SWIP manualmente ou através de análise automatizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Induzido por anfetamina SWIP usando ensaio manual. Vermes em sacarose ou sacarose com anfetamina 0,5 mM (ANF) visualmente foram marcados por comportamento SWIP cada minuto usando um estereoscópio. A porcentagem de animais de que swip expositora foi calculada dividindo o número paralisado vermes pelo número total de vermes analisada para cada ponto de tempo e em seguida, multiplicar o resultado por 100. A porcentagem de vermes expostos a ANF (quadrados azuis) mostrando SWIP aumentos extras, enquanto os vermes não tratados (círculos vermelhos) continuam a nadar durante a janela de 10 minutos. N representa o número de animais testados em cada grupo. Barras de erro indicam o erro padrão dos meios (SEM). Significância estatística foi avaliada através da realização de teste de comparação múltipla (p < 0,0001) ANOVA de duas vias com Bonferroni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Induzido por anfetamina SWIP através de análise automatizada. Vídeos de vermes em sacarose ou sacarose com 0,5 mM ANF foram gravados usando uma câmera montada em um estereoscópio. Vídeos de natação de vermes individuais foram rastreados com um software de rastreamento e analisados usando terno de software de rastreamento. Mapas de calor foram gerados a partir dos dados onde áreas vermelhas mostram os vermes que estão ativamente se movendo, e áreas verdes indicam vermes paralisados. Cada grupo experimental é representante de 6 animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para realizar um ensaio comportamental, SWIP, em c. elegans. Este protocolo é simples e direta com nenhum obstáculos técnicos tornando este usuário de ensaio muito amigável. No entanto, existem alguns aspectos essenciais que precisam ser considerados para efetivamente realizar o ensaio.
Deve ter cuidado para garantir que os vermes que usada para o ensaio são bem alimentados, desde que a restrição dietética afeta SWIP17. Gentil de manuseamento de vermes durante a colheita, como tratamento de hipoclorito de sódio/NaOH bem como cronometrado durante lise são passos críticos, como trauma durante a colheita (mais comum quando utilizando um palito platina) ou exposição prolongada de embriões para solução de hipoclorito de sódio/NaOH pode causar danos permanentes para os vermes18 e, assim, comprometer a sua capacidade de nadar.
Técnicas estéreis devem ser seguidas para evitar a contaminação. Contaminação das placas de ágar compromete a saúde dos animais e, portanto, altera sua capacidade de nadar. Pequena diferença na percentagem de animais exibindo SWIP pode ser observada usar placas de ágar inoculado com diferentes cepas de bactérias Escherichia coli (NA22, OP50, etc.). Em nosso protocolo, usamos NA22 para produzir um grande número de vermes.
Placas de vidro local, usadas durante o ensaio SWIP, são preferidas para placas plásticas porque podem ser completamente lavados, esterilizados em autoclave e re-utilizadas quando diferentes tipos de drogas são testados.
Outro fator importante a ser considerado em um ensaio SWIP é a osmolaridade da mídia líquida na qual os animais são testados19. Em nosso protocolo, usamos sacarose para trazer a osmolaridade de água até 200 mOsm/L, o que anteriormente foi mostrado para ser uma condição ideal para os animais (comunicação pessoal de RD. Blakely). Água com uma osmolaridade controlada é preferida porque elimina as possíveis diferenças na qualidade da água ao longo de vários ensaios realizados em diferentes dias, semanas ou meses. Notavelmente, dat-1 e o tipo selvagem animais tratados com ANF não exibem SWIP se salgado soluções (por exemplo, solução de M9) são utilizadas como meios de controle.
O tempo necessário para a maioria dos animais para exposição SWIP pode alterar ligeiramente entre estágios diferentes worm (L1-L4). Por exemplo, Molinari et al. (2014) relataram que depois de 5 min de 80% dos animais dat-1 L1 ainda nadar, assim, apenas 20% dos animais apresentam SWIP. Por outro lado, apenas 50% dos animais de dat-1 L4 ainda nadar após 5 min20. Portanto, é importante que os animais testados para SWIP são doseados com a mesma idade. Otimizamos nosso ensaio usando sempre tarde L4 encenado de animais. As larvas de L4 tarde têm a vantagem de ser facilmente reconhecível entre os outros estágios larvas porque, nesta fase, os animais atingiram o tamanho adulto e exibem uma característica linha fina dividindo a mancha branca no centro do seu corpo que serão mais tarde Diferencie-se em uma vulva madura. O tempo do ensaio é também crítico. Por exemplo, depois de 15 minutos, 90% dos mutantes de dat-1 L4 exibem SWIP mas em momento posterior (30 min), apenas 60% deles apresentam SWIP20.
O ensaio SWIP automatizado elimina erros humanos e melhora o rastreio com throughput alto com relação a ensaios de manuais. No entanto, o software de rastreamento programas são demorados, uma vez que apenas podem rastrear um único verme cada vez.
Em relação a outros comportamentos dependentes DA c. elegans , SWIP é um tipo menos demorado de ensaio. Por exemplo, o basal retardando resposta2 não é um tipo imediato-ensaio. Na verdade, vermes precisam de ser alimentados cronicamente com as drogas, e isto pode resultar em efeitos penetrante e o alvo. Assim, não é tão eficaz para a tela para drogas.
Uma das principais aplicações de SWIP é a tela para várias drogas que visam o caminho dopaminérgico. Em casos onde as drogas não são solúveis em água (por exemplo, mazindol), diluições apropriadas devem ser realizadas para atingir concentrações onde a solução transportadora não é tóxica para os vermes. Além disso, se as concentrações diferentes da mesma droga são usados5,13,14, curvas dose-resposta também podem ser analisadas. Por exemplo, a taxa de progressão (declive da curva de animais por minuto, Figura 2) pode ser relatada como função da concentração e usada para comparar os efeitos de diferentes drogas (por exemplo, cocaína de vs ANF).
Quando SWIP é usado para investigar o mecanismo de ação das drogas nas sinapses dopaminérgicas, deve prestar atenção se os resultados são estendidos para outros animais. Por exemplo, a imipramina, um inibidor específico do transportador mamíferos de norepinefrina (NET) tem sido usada para induzir SWIP DA-mediar em N2 animais4. C. elegans faz não sintetizar norepinefrina e consequentemente não expressa NET. No entanto, o transporte de c. elegans DA partilha homologia com mamíferos NET21. Por esta razão, medicamentos que são inibidores específicos de mamíferos NET e limitaram efeitos sobre mamíferos DAT (por exemplo, imipramina) mostram alta seletividade para c. elegans DAT. Assim, a seletividade de espécies pode limitar nossa capacidade de extrapolar os achados de c. elegans aos seres humanos.
O fator mais importante a considerar ao projetar SWIP ensaios é a inclusão de experimentos provando que SWIP é mediada pelo sistema dopaminérgico. Na verdade, natação prejudicada poderia ser gerada por fatores diferente de genes relacionados ao sistema DA (por exemplo, gerais defeitos na contração de músculos). Para garantir que SWIP realmente é mediada por DA, os protocolos devem incluir experimentos realizados com animais em que foi esgotada DA. Isto pode ser conseguido por qualquer um usando animais nocaute, falta de expressão do gato-2, o homólogo de c. elegans da tirosina hidroxilase, que é a enzima limitante DA síntese ou se por pre-tratar animais selvagem-tipo com reserpina, uma drogas que causa DA depleção de vesículas3. Por exemplo, McDonald et al3 mostrou que SWIP basal observada em dat-1 mutantes foi recuperada quando estes animais foram pré-tratados com reserpina. Este resultado sugere que SWIP é mediada por DA. Por outro lado, usando o gato-2, dat-1 e mutantes, falta de expressão de cada um dos receptores dopaminérgicos, Safratowich et al. (2014) demonstraram que o rastreamento amina β-feniletilamina (βPEA) induz SWIP dentro de 1 minuto de tratamento independentemente do pai mas por ativação direta do íon ligand-gated canal LGC-5514. Os autores mostraram que βPEA e DA-induzida SWIP são mecanicamente diferente e eles podem ser facilmente discriminados experimentalmente. Na verdade, enquanto SWIP induzida por βPEA é DA - e dop-3-independente, atinge valores máximas dentro de 1 min e rapidamente diminui após 2 min14, mediada por DA SWIP é gato-2 e dop-3 dependentes e é essencialmente zero após 1 minuto (Figura 2). Assim, há uma grande diferença no tempo necessário para alcançar efeitos máximas, e isso permite que rapidamente discriminar entre os dois fenómenos: 1) a SWIP rápido induzida por βPEA dentro de 1 minuto obtidos pela ativação direta dos canais LGC-55 e 2) o lento SWIP mediada por DA que ocorre quando um excedente DA extracelular acumula ao longo do tempo (10-15 min) e os receptores DA DOP-3 são estimulado3.
Em conclusão, com o conjunto certo de experiências, que incluem o uso de animais nocaute para genes do jogador-chave do sistema dopaminérgico (gato-2, dat-1, dop-3) e o uso de drogas, empobrecimento DA storages (reserpina), tem sido SWIP usada com sucesso para elucidar o mecanismo de ação das drogas como ANF5,13, βPEA14,15 e azaperona6.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Osama Refai do laboratório do Dr. Randy Blakely para orientação com a análise automatizada de SWIP. Este trabalho foi financiado por fundos do NIH R01 DA042156 para LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
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