Summary
용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.
Abstract
면역 표지에 의한 조직 및 기관의 감염 과정의 시각화는 현대 감염 생물학의 핵심 방법입니다. 장기 조직의 내부 병원체의 분포, 트로피즘 및 풍부를 관찰하고 연구하는 능력은 질병 발달과 진행에 대한 중추적 인 데이터를 제공합니다. 기존의 현미경 검사법을 사용하여, 면역 표지는 주로 파라핀 임베디드 또는 냉동 샘플에서 얻은 얇은 단면으로 제한됩니다. 그러나, 이 얇은 단면도의 한정된 2D 심상 평면은 감염한 기관의 복잡한 구조 및 감염의 세포 문맥에 중요한 정보의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 현대다색, 면역염색 호환 조직 청산 기술은 이제 바이러스에 감염된 장기 조직의 대용량 3D 이미지 스택을 연구하는 비교적 빠르고 저렴한 방법을 제공합니다. 유기 용매에 조직을 노출시킴으로써 광학적으로 투명해집니다. 이는 샘플의 굴절 지수와 일치하며 결국 광 산란이 크게 감소합니다. 따라서, 긴 자유 작동 거리 목표와 함께, 최대 1mm 크기의 큰 조직 섹션은 고해상도에서 기존의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법(CLSM)에 의해 이미지화될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 바이러스 병인, 퍼짐, 트로피즘 및 신경 침략 같이 주제를 공부하기 위하여 감염된 두뇌에 있는 광견병 바이러스 분포를 구상하기 위하여 조직 정리 후에 심층 조직 화상 진찰을 적용하는 프로토콜을 기술합니다.
Introduction
전통적인 조직학 기술은 주로 복잡한 3D 환경에 대한 2D 통찰력만 제공할 수 있는 장기 조직의 얇은 부분에 의존합니다. 원칙적으로 가능하지만, 직렬 얇은 섹션에서 3D 재구성은 획득 한 이미지의 실리코 정렬에슬라이스 및 후속 모두 까다로운 기술 파이프 라인을 필요로1 . 또한, 마이크로토임 슬라이싱 후 z-volumes의 원활한 재구성은 비오버랩 이미지 평면, 염색 변형 및 물리적으로 인한 최적이 아닌 이미지 등록으로 인해 기계적 및 계산 적 아티팩트가 모두 남아 있기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 마이크로토메 블레이드에 의해 조직의 파괴. 대조적으로, 그대로 두꺼운 조직 샘플의 순수한 광학 슬라이스는 중첩 이미지 평면 (오버 샘플링)의 수집을 허용하고, 따라서, 3D 재구성을 용이하게한다. 이것은, 차례로, 복잡한 세포 집단에 있는 감염 프로세스의 분석을 위해 높게 유리합니다 (예를 들면, 주변 신경교 및 면역 세포의 맥락에서 신경 세포). 그러나, 두꺼운 조직 단면도의 내재된 장애물은 조직으로 광 산란 및 제한된 항체 침투를 포함합니다. 최근에는이러한문제를 극복하기 위해 다양한 기술이 개발되고 최적화되어 2, 3,4,5,6,7,8 , 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13. 본질적으로 대상 조직은수성2,3,4,5,6및7로 처리하여 광학적으로 투명하게 바뀌습니다. ,8,9 또는 유기 용매 기반10,11,12,13 솔루션. 3DISCO (용매 클리어 기관의 3D 이미징)11,12 및 그 후속 uDISCO (용매 클리어 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징)13의 도입은 상대적으로 빠르고 간단하고 저렴한 도구를 제공 우수한 클리어링 기능. 클리어링 프로토콜의 주요 성분은 유기 용매 테르트-부탄올(TBA), 벤질 알코올(BA), 벤질 벤조에이트(BB), 및 디페닐 에테르(DPE)이다. iDISCO(용매 클리어란의 면역표지 지원 3D 이미징)의 개발 및 추가14,호환 가능한 면역 염색 프로토콜은 기존 방법에 비해 또 다른 장점을 구성하고 항원의 심부 조직 라벨링을 가능하게 하였다. 면역 염색 된 샘플의 장기 저장뿐만 아니라 관심의. 따라서, iDISCO14 와 uDISCO13의 조합은 기존의 CLSM을 사용하여 큰 조직 섹션 (최대 1mm)에서 항체 표지 단백질의 고해상도 이미징을 허용합니다.
모든 3 차원에서 장기의 복잡 한 구조의 보존은 뇌 조직에 대 한 특히 중요 하다. 뉴런은 그들의 신경질적 투영에 기초하여 매우 다양한 3D 형태학을 가진 매우 이질적인 세포 하위 집단을 포함한다 (Masland15에의해 검토됨). 더욱이, 뇌는 신경교 세포 및 뉴런을 포함하는 상이한 세포 소집단 및 비율로 각각 구성된 다수의 구획 및 하위구획으로 구성된다(폰 바르톨드 등 16). 신경 트로픽 바이러스로서, 광견병 바이러스 (RABV, Fookset al. 17)는 주로 뉴런을 감염시키고, 그들의 수송 기계를 사용하여 감염의 기본 부위에서 중추 신경계 (CNS)로 의 축삭을 따라 역행 방향으로 여행합니다. 여기서 설명된 프로토콜(도1A)은 감염된 뇌 조직으로부터 수득된 크고 일관된 이미지 스택에서 RABV 및 RABV 감염 세포의 면역 염색 보조 검출 및 시각화를 허용한다. 이를 통해 감염 환경에 대한 편견없는 3D 고해상도 평가를 가능하게 합니다. 다양한 종으로부터의 뇌 조직에 적용 가능하며, 고정 직후 또는 파라포름알데히드(PFA)에서 시료를 장기간 보관한 후 즉시 수행할 수 있으며, 수개월 동안 염색 및 시료의 저장 및 재이미징을 허용한다.
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Protocol
RABV-감염, PFA 고정 보관 된 뇌 물질을 사용 하 고 있습니다. 각각의 동물 실험 연구는 메클렌부르크 서부 포메라니아(LALFF M-V)의 농업, 식품 안전 및 어업관리국의 책임있는 동물 관리, 사용 및 윤리 위원회에 의해 평가되었으며 허가를 받았습니다. 7221.3-2.1-002/11(마우스) 및 7221.3-1-068/16(페렛). 동물 실험에 사용된 일반적인 관리 및 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다.
주의: 이 프로토콜은 PFA, 메탄올(MeOH), 과산화수소(H2 O2),아지드 나트륨(NaN3),TBA, BA, BB 및 DPE를 포함한 다양한 독성 및/또는 유해 물질을 사용합니다. MeOH 및 TBA는 매우 가연성입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 눈 보호)를 착용하고 연기 후드에서 실험을 수행하여 노출을 피하십시오. 폐기물을 적절한 용기에 따로 수거하여 현지 규정에 따라 폐기하십시오. 광견병 바이러스는 생물 안전 성 수준 (BSL)-2 병원 체로 분류 하 고 수 있습니다., 따라서, 일반적으로 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 에어로졸을 생성하거나, 바이러스 농도가 높거나, 새로운 lyssaviruses로 작업할 수 있는 절차를 포함한 일부 활동은 BSL-3 분류가 필요할 수 있습니다. 사전 노출 예방은 동물 관리및 실험실 노동자18,19를포함하여 고위험 직원에게 추천됩니다. 지역 당국 규정을 참조하십시오.
1. 뇌 조직의 고정 및 절제
- 인산완충식염수(PBS[pH 7.4])에서 4%의 적절한 부피에서 뇌 시료를 4°C에서 48시간 이상(대략 1:10[v/v]의 대략적인 조직 대 고정 비율)으로 수정합니다.
- 조직 샘플을 PBS에서 3x 이상 30분 동안 세척하고 사용 전까지 4°C에서 0.02% NaN 3/PBS로 저장합니다.
- 조직을 진동을 사용하여 1mm 두께의 섹션으로 단면도하십시오 (블레이드 이송 속도 : 0.3-0.5 mm / s, 진폭 : 1mm, 슬라이스 두께 : 1,000 μm).
- 올바른 슬라이스 서열을 유지하려면 각 조직 섹션을 멀티웰 세포 배양 판의 우물에 별도로 보관하십시오. 0.02% NaN3/PBS를 추가하고 사용 될 때까지 4 °C에서 조직 섹션을 저장합니다.
2. 메탄올시료 전처리
참고 : 부드러운 진동으로 모든 인큐베이션 단계를 수행하고, 그렇지 않으면 실온에서 지시하지 않으면. 빛으로부터 시료를 보호하십시오. 샘플 전처리는 MeOH 및H2O2에 노출시킴으로써 항체 확산을 개선하고 조직 자가형광을 감소시키는 전반적인 목적을 제공하며, 각각14.
- 증류수에서 20%(v/v), 40%, 60%, 80% MeOH 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 20% MeOH의 경우, 100% MeOH의 10mL를 적절한 밀봉 용기에 40 mL의 증류수를 넣고 뒤집어 혼합합니다.
- 샘플을 합리적인 크기의 용기(예: 5 mL 반응 튜브)로 옮긴다. 이 프로토콜에 사용된 시약에 화학적으로 저항하는 물질을 사용하십시오. 예를 들어 폴리프로필렌이 적합하지만 폴리스티렌은 적합하지 않습니다.
참고: 이 프로토콜의 볼륨 사양은 5mL 반응 튜브를 참조합니다. 다른 용기를 사용하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정합니다. - MeOH 용액의 제조된 계열의 각 농도의 4 mL에서 샘플을 각각 1시간씩 오름차순으로 배양한다.
- 순수 (100 %)에서 각각 1 시간 동안 2 x 샘플을 배양하십시오. MeOH.
- 샘플을 4°C(예: 실험실 용 냉장고)로 냉각시.)
- 표백 용액 (MeOH에서 5 % H2O2)을 준비하여 30 % H2O2 스톡 솔루션을 1 :6에서 순수 (100 %)로 희석합니다. MeOH, 4 °C에서 냉각.
- 냉장 샘플에서 100% MeOH를 제거하고 미리 냉각된 표백 용액 4 mL(MeOH의 5% H2O2)를 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양.
- 표백 용액을 80% MeOH의 4 mL에 대해 교환하고 1 시간 동안 배양하고 1 시간 동안 배양하십시오.
- 샘플을 4 mL의 PBS로 1 시간 동안 1 x로 씻습니다.
3. 면역 염색
참고 : 부드러운 진동으로 모든 인큐베이션 단계를 수행하고, 그렇지 않으면 실온에서 지시하지 않으면. 빛으로부터 시료를 보호하십시오. 미생물 성장을 방지하려면 이 섹션의 솔루션에 NaN3를 최종 농도 0.02%에 추가합니다. 조직 샘플은 트리톤 X-100 및 트웬 20으로 처리하여 더 투과된다. 정상 혈청은 비특이적 항체 결합을 차단하는 데 사용됩니다. 글리신과 헤파린이 첨가되어 면역표지배경(14)을감소시소한다.
- 0.2% 트리톤 X-100/PBS의 4 mL에서 각각 1 시간 동안 샘플을 2 x 씻습니다.
- 0.2% 트리톤 X-100/20% DMSO/0.3 M 글리신/PBS의 4 mL로 37°C에서 2일 동안 시료를 투과시합니다.
- 0.2% 트리톤 X-100/10% DMSO/6% 정상 혈청/PBS의 4 mL에서 37°C에서 2일 동안 샘플을 배양하여 항체의 비특이적 결합을 차단한다.
참고: 이상적인 차단 결과를 달성하기 위해 이차 항체가 제기된 동일한 종의 정상 혈청을 사용하십시오. - 37 °C에서 5 일 동안 1 차 항체 용액 (3 % 정상 혈청 / 5 % DMSO / PTwH [헤파린이있는 PBS-Tween 20 ] + 1 차 항체 / 항체)의 2 mL에서 샘플을 배양하십시오. 2.5 일 후에 1 차 항체 용액을 새로 고칩니다.
- PTwH의 경우, 증류수에서 헤파린 나트륨 염을 재구성하여 10 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다(이 용액을 4°C에서 aliquoted로 저장). 재고 용액을 0.2% 트웬 20/PBS에 추가하여 최종 농도인 10 μg/mL에 추가합니다.
참고: 올바른 항체 희석을 선택하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 일반적으로, 표준 면역 성 화학 농도는 좋은 출발점이다.
- PTwH의 경우, 증류수에서 헤파린 나트륨 염을 재구성하여 10 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다(이 용액을 4°C에서 aliquoted로 저장). 재고 용액을 0.2% 트웬 20/PBS에 추가하여 최종 농도인 10 μg/mL에 추가합니다.
- PTwH의 4 mL에서 1 일 동안 샘플을 세척하고 하루 중 적어도 4x-5x의 세척 버퍼를 교환하고 밤새 최종 세척을 남깁니다.
- 37 °C에서 5 일 동안 이차 항체 용액 (3 % 정상 혈청 / PTwH + 이차 항체 / 항체)의 2 mL에서 샘플을 배양하십시오. 2.5 일 후에 이차 항체 용액을 새로 고칩니다.
- 이차 항체/항체를 1:500에서 이차 항체 용액(즉, 2 mL에서 4 μL)에서 희석한다.
- 3.5단계에서 설명한 대로 1일 동안 샘플을 세척하고, 최종 세척을 하룻밤 동안 방치한다.
4. 핵 염색
참고 : 부드러운 진동으로 모든 인큐베이션 단계를 수행하고, 그렇지 않으면 실온에서 지시하지 않으면. 빛으로부터 시료를 보호하십시오. 핵 염색이 필요하지 않거나 다른 형광소의 여기 또는 검출을 위해 TO-PRO-3의 여기 파장/방출 스펙트럼이 필요한 경우 이 단계를 건너뜁니다.
- PTwH에서 1:1,000에서 핵산 얼룩 TO-PRO-3을 희석하고 5 시간 동안 핵 염색 용액 4 mL에서 샘플을 배양하십시오.
- 3.5단계에서 설명한 대로 1일 동안 샘플을 세척하고, 최종 세척을 하룻밤 동안 방치한다.
참고: 세차 후, 시료는 광학 적폐가 될 때까지 4 °C에서 PBS에 보관할 수 있습니다.
5. 조직 정리
참고 : 부드러운 진동으로 모든 인큐베이션 단계를 수행하고, 그렇지 않으면 실온에서 지시하지 않으면. 빛으로부터 시료를 보호하십시오. 조직 샘플은 TBA 솔루션의 등급이 매겨진 시리즈에서 탈수됩니다. 면역 염색은 수성 해결책을 요구하기 때문에, 모든 염색 절차는 조직 정리의 앞에 완료되어야 합니다. 광학 클리어런스 및 굴절률 매칭은 BA, BB 및 DPE를 혼합한 처리에 의해 달성됩니다. 클리어링 용액은 항산화제 13으로서 DL-α-토코페롤로 보충된다.
- 증류수에서 30%(v/v), 50%, 70%, 80%, 90%, 96% TBA 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 30% TBA의 경우, 100% TBA의 15 mL을 적절한 밀봉 용기에 35 mL의 증류수를 추가하고 반전하여 혼합합니다.
참고: TBA는 25-26 °C의 융점을 갖는다; 따라서, 실온에서 고체가 되는 경향이 있다. TBA 용액을 준비하기 위해, 잘 밀봉된 병을 인큐베이터 또는 수조에서 37°C에서 가열한다. - 각각 2 시간 동안 오름차순으로 TBA 용액의 제조된 시리즈의 각 농도의 4 mL로 샘플을 탈수한다. 하룻밤에 96 % TBA를 둡니다.
- 순수 (100 %)에서 더 샘플을 탈수 2 시간 동안 TBA.
- 클리어링 솔루션 BABB-D15를 준비합니다.
참고: BABB-D15는 BA와 BB(BABB)의 조합으로, DPE와 x:1의 비율로 혼합되며, 여기서 x는 용액 이름에 지정되어 있습니다(이 경우 15).- BABB의 경우, 한 부분의 BA를 두 부분BB와 혼합하십시오.
- BABB와 DPE를 15:1의 비율로 섞습니다.
- 0.4 vol% DL-α-토코페롤(비타민 E)을 첨가합니다.
참고: 예를 들어, BABB-D15의 20 mL의 경우 BA의 6.25 mL와 BB 의 12.5 mL를 혼합합니다. 1.25 mL의 DPE를 추가하고 0.08 mL의 DL-α-토코페롤로 보충하십시오.
- 광학적으로 투명해질 때까지 클리어링 솔루션에서 샘플을 지웁니다(2-6시간).
- 시료는 BABB-D15의 4°C에서 보관할 수 있으며, 장착 및 이미징까지 빛으로부터 보호됩니다.
6. 샘플 장착
- 3D 프린터를 사용하여, 이미징 챔버 및 뚜껑을 인쇄 (재료 : copolyester [CPE], 노즐 : 0.25 mm, 층 높이 : 0.06 mm, 벽 두께 : 0.88 mm, 벽 수 : 4, 채우기 : 100 %, 지지 체 구조 없음; STL 파일은 이 프로토콜의 보충 자료에서 찾을 수 있습니다.
- 이미징 챔버를 조립합니다(그림 2).
- RTV-1(한 성분실온-가황) 실리콘 고무로 이미징 챔버에 둥근 커버슬립(직경: 30mm)을 장착합니다. 물에 젖은 면봉으로 여분의 실리콘 고무를 제거하고 밤새 치료하십시오.
- RTV-1 실리콘 고무로 뚜껑에 둥근 커버 슬립(직경: 22mm)을 장착합니다. 물에 젖은 면봉으로 여분의 실리콘 고무를 제거하고 밤새 치료하십시오.
- 샘플을 이미징 챔버에 넣고 BABB-D15의 소량을 추가하고 뚜껑을 삽입합니다. 피하 주사바늘 (27 G x 3/4 인치 [0.40 mm x 20mm])을 사용하여 입구를 통해 BABB-D15로 챔버를 채웁니다.
- 입구를 연결하고 RTV-1 실리콘 고무로 이미징 챔버를 밀봉합니다. 어둠 속에서 하룻밤 치료.
7. 이미징 및 이미지 처리
- 사용되는 형광단에 맞게 각각의 레이저 라인을 선택하여 이미지 수집을 설정한다. 각 검출기의 검출 범위를 조정하여 채널 간에 신호가 겹치지 않도록 합니다.
참고: 알렉사 플루어 488, 알렉사 플루어 568 및 TO-PRO-3의 예시적 검출 범위는 각각 500-550 nm, 590-620 nm 및 645-700 nm입니다. - 수집 매개변수를 선택하고 z 스택의 위쪽 및 아래쪽 테두리를 정의하고 이미지 스택을 수집합니다.
참고: 예시적 수집 매개변수는 픽셀 크기가 60-90nm, z-스텝 크기가 0.5 μm, 선 평균 1, 스캔 속도 400Hz 및 핀홀 크기가 1 Airy 단위의 순차 적 스캔입니다. - 적절한 이미지 분석 소프트웨어(예: Fiji)를 사용하여 이미지 스택을 처리하여 3D 프로젝션을 생성하거나 심층 분석을 수행합니다.
참고: 수집된 이미지 파일의 크기가 크기 때문에 일반적으로 워크스테이션을 사용해야 합니다.- 피지에서 획득 또는 이미지 파일 열기 | 오픈 | 파일선택).
- 예를 들어 를 사용하는 경우 . Bio-Formats 대화 상자 창에서 원하는 옵션을 선택하거나 선택 취소합니다. 하이퍼스택으로스택 보기. 그 외에는 특정 선택이나 틱이 필요하지 않습니다. 확인을누릅니다.
- 파일에 여러 이미지 스택이 포함되어 있는 경우 분석할 스택을 선택하고 확인을눌러 확인합니다.
- 병합된 이미지를 개별 채널로 분할하여 표백제 보정 수행 (이미지 | 색상 | 채널도구, 다음 선택 더 | 분할채널). 각 채널에 대해 표백보정(이미지 | 조정 | 표백보정) 단순 비율(배경 강도: 0.0)을 선택합니다.
참고: 예를 들어 신호의 선형 감쇠가 없거나 신호가 전체적으로 너무 약한 경우 단순 비율이 실패할 수 있습니다. 또는 지수 맞춤을 시도하거나 표백제 보정을 건너뜁니다. - 슬라이더를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다(이미지 | 조정 | 밝기 | 대비)를 참조하십시오.
- 채널 병합(이미지 | 색상 | 채널병합), 합성(이미지 | 색상 | 채널도구, 다음 선택 더 | 합성만들기) 및 RGB 형식으로 변환 (이미지 | 색상 | 채널도구, 다음 선택 더 | RGB로변환).
- 필요한 경우 이미지 스택의 크기를 조정하여 계산 시간과 파일 크기를 줄입니다(이미지 | 조정 | 크기,두 옵션 모두 선택및 쌍선형 보간)을 선택했습니다.
- 3D 프로젝션 생성(이미지 | 스택 | 3D프로젝트). 가장 밝은 점을 투영 방법으로 선택하고 획득한 이미지 스택의 z 단계 크기와 일치하도록 슬라이스 간격을 설정합니다. 품질을 최대화하려면 회전 각도 증분을 1로 설정하고 보간을 사용하도록 설정합니다. 필요에 따라 총 회전, 투명도 임계값 및 불투명도를 수정합니다.
- 필요한 경우 3D 프로젝션을 8비트 형식으로 변환하여 콘트라스트와 밝기를 다시 조정합니다(이미지 | 유형 | 8비트). 각 슬라이더 사용(이미지 | 조정 | 밝기 | 대비) 7.3.4 단계에서 설명한 대로 이미지 스택을 RGB 형식으로 다시 변환합니다.
- 3D 프로젝션을 로 저장합니다. TIF 파일(이미지 파일 형식) 및 . AVI 파일(비디오 파일 형식).
- 피지에서 획득 또는 이미지 파일 열기 | 오픈 | 파일선택).
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Representative Results
iDISCO14와 uDISCO13의 고해상도 CLSM 조합은 뇌 조직의 RABV 감염과 주변 세포 맥락의 시공간적 분해능과 가소성에 대한 깊은 통찰력을 제공합니다.
RABV 인단백질(P)의 면역염색을 사용하여, 감염된 뉴런 세포의 복잡한 층은 마우스 뇌의 두꺼운단면에서 가시화될 수 있다(그림 3). 이어서, 획득한 이미지 스택의 원활한 3D 프로젝션을 재구성할 수 있다(도3A, B,우측 패널; 애니메이션 그림1). 기관 물자에서 유래한 종에 대하여 1 차적인 항체 및 이차 항체를 사용할 때 주의가 취해져야 합니다. 마우스 뇌 조직에 항 마우스 IgG 항체의 사용은 혈관 시스템의 뚜렷한 염색을 초래했다 (그림3B,왼쪽 패널). 고해상도 이미지 스택으로 인해, 감염은 단일 세포 수준까지 평가될 수있다(그림 4), 세포 내 항원의 풍부하고 분포에 대한 주장을 허용하는 것(그림4C) ).
마우스 뇌 조직 이외에도, 프로토콜은 또한 다른 동물 종 (예를 들어, 페렛)에서 뇌 조직에 적용 될 수있다 (그림5; 애니메이션 그림2). 감염된 페렛 뇌의 상이한 구획에서 채취한 절편은 다양한 정도의 RABV 감염을 밝혀냈다(그림5A-D).
두뇌는 많은 다른 세포 하위 집단을 포함하기 때문에, 이 인구 사이 분화는 생명입니다. 세포 마커에 대하여 지시된 항체를 사용하여, 감염되고 인접한 세포의 세포 정체성의 평가는 가능합니다. 예를 들어, 성상 세포는 신경교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)의 발현을 통해 분화 될 수있다 (그림6A,C; 애니메이션 도 3은,신경질이 미세투과성 단백질 2(MAP2)에 대해 특이상으로 염색될 수 있는 반면(도6B,D; 애니메이션 그림4). 동시에, 바이러스 성 단백질, 이 경우, RABV 핵 단백질 (N), 감염된 세포와 강조 된 세포 하위 집단 사이의 관계를 평가하기 위해 코스타인 될 수있다.
그림 1 : 프로토콜의 기본 원칙 및 워크플로우. (A) 레니에 외14 및 Pan 외13의프로토콜에 기초하여 워크플로우의 그래픽 표현 . (B) 두 개의 예시적인 페렛 브레인 슬라이스, 1회 전(왼쪽 패널) 및 유기 용매로 처리 한 후(오른쪽 패널). 지우기는 다음 읽을 수있는 텍스트에 의해 관찰 으로 광학적으로 투명 조직을 집니다. 클리어된 브레인 슬라이스는 3D 프린팅 이미징 챔버(오른쪽 패널)에 내장되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 3D 프린팅 이미징 챔버의 기술적 일러스트레이션. (A) 이미징 챔버의 분해 뷰 드로잉. 점선 선은 RTV-1 실리콘 고무를 사용하여 서로 장착해야 하는 구성 요소를 강조 표시합니다. 파선은 챔버의 후속 조립에 대한 지침을 나타냅니다. (B) 이미징 챔버의 CAD (컴퓨터 지원 설계) 파일. 해당 . 이미징 챔버를 인쇄하는 STL 파일은 보충 자료에서찾을 수 있습니다. (C) 완전히 조립된 이미징 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : RABV 에 감염된 마우스 뇌 조직의 심부 조직 이미징. (A 및 B)마우스는 재조합 외음부 거리 바이러스에 감염되었다. RABV P 염색 (녹색) 클리어 된 뇌 조직 내부큰, 얽힌 neurite 돌기감염 감염된 신경 층을 밝혀. 핵은 TO-PRO-3(파란색)으로 반화되었다. (B) 마우스 조직에 형광표지된 항마우스 IgG 이차 항체(적색)를 사용하면 혈관 계통의 뚜렷한 라벨링이 생성된다. 획득한 이미지 스택의 3D 재구성을 통해 다양한 시야각(A 및 B,오른쪽 패널)을 관찰할 수 있습니다. 배율 막대 = 60 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 고해상도 이미지 수집을 통해 단일 셀 수준까지 복잡한 평가를 수행할 수 있습니다. 뇌는 SAD L16 감염 마우스로부터 해부되었다. (A) RABV P 염색(녹색)은 개별적으로 감염된 뉴런을 강조 표시한다. (B 및 C)세부 이미지와 프로젝션은 항원 풍부, 분포 및 국소화에 대한 심층 분석을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 핵은 TO-PRO-3(파란색)으로 반화되었다. 배율 막대 = 20 μm (A), 5 μm (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : RABV 에 감염된 페렛 뇌 조직의 심부 조직 이미징. 페렛은 개 거리 RABV에 감염되었다. (A–D) 뇌의 지정된 영역에서 슬라이스를 촬영하고, RABV P (녹색)에 대해 면역 염색을하고, 광학적으로 제거했습니다. 돌출부는 두뇌의 다른 부분에 있는 감염한 세포가 양 과 형태학에서 다르다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 그들은 마우스 유래 이외의 조직에 대한 프로토콜의 적용가능성을 강조한다. 핵은 TO-PRO-3(파란색)으로 반화되었다. 배율 막대 = 60 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 다색 면역형광으로 세포 마커의 유어닝이 가능합니다. 개 거리 RABV에 감염된 페렛으로부터의 뇌 조직 슬라이스를 RABV N(적색) 및 중 하나(A 및 C)GFAP(녹색) 또는 (B 및 D)MAP2(녹색)에 대해 coimmunostained를 사용하였다. GFAP는 성상 세포 마커인 반면 MAP2는 특히 신경세포를 강조합니다. 핵은 TO-PRO-3(파란색)으로 반화되었다. (C 및 D)하단에는 병합된 투영에서 수반되는 상세 뷰의 단일 슬라이스 추출이 표시됩니다. 배율 막대 = 15 μm(A 및 B)10 μm (C 및 D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 그림 1: RABV에 감염된 마우스 뇌의 이미지 스택의 3D 재구성 및 세부 프로젝션. 도3에 설명된 이미지 스택으로부터 프로젝션이 생성되었다. (A 및 C)전체 z 스택의 애니메이션입니다. (B) 비디오 의 시작 부분에 강조 표시된 영역의 z 스택 부분의 3D 재구성의 상세한 투영. (D) 비디오 의 시작 부분에 강조 표시된 영역의 z 스택 부분의 토모그램의 상세한 투영입니다. 녹색 = RABV P; 빨간색 = 마우스 IgG; 파란색 = 핵. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
애니메이션 그림 2: RABV에 감염된 페렛 뇌에서 획득한 이미지 스택의 3D 재구성. 도5에 설명된 이미지 스택으로부터 프로젝션이 생성되었다. (A–D) 주석은 동일한 그림을 참조하고 조각에서 가져온 뇌의 각 영역을 설명합니다. 녹색 = RABV P; 파란색 = 핵. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
애니메이션 그림 3: 성상 세포 마커 GFAP로 유타된 RABV 감염 페렛 뇌의 3D 재구성의 상이한 채널의 점진적 투영. 도 6A에설명된 이미지 스택으로부터 프로젝션이 생성되었다. 채널의 점진적인 첨가는 RABV N (빨강)으로 시작하여 세포 핵 (청색)을 따르고, 마지막으로 GFAP (녹색)를 따르고, 빼기는 먼저 RABV N, 다음 세포 핵을 제거하고, 결국 GFAP를 제거합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
애니메이션 그림 4: 뉴런 마커 MAP2로 유태된 RABV 감염 페렛 뇌의 3D 재구성의 상이한 채널의 점진적 투영. 도 6B에설명된 이미지 스택으로부터 프로젝션이 생성되었다. 채널의 점진적인 추가는 RABV N (빨강)으로 시작하고, 그 후 세포 핵 (파란색)을 따르고, 마지막으로 MAP2 (녹색)를 따르고, 빼기는 먼저 RABV N, 다음 세포 핵을 제거하고 결국 MAP2를 제거합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
최근 몇 년 동안 조직 정리 기술의부활과 추가 개발 2, 3,4,5,6,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14는 장기 조직의 대용량 이미지 스택을 얻기 위하여 많은 새로운 가능성을 열었습니다. 이것은 다른 많은 주제, 바이러스 감염 중, 공부하는 비교할 수없는 강력한 도구를 제공했다. 이러한 이미지 스택의 후속 3D 재구성은 예를 들어 바이러스 트로피즘, 풍부성 및 감염 시간 과정에 대한 정교한 주장을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 용매 제거 된 뇌 조직에서 RABV 감염의 면역 라벨 링 보조 시각화를 설명합니다.
면역 표지된, 용매 제거 조직의 이미지 스택의 제조 및 획득에 몇 가지 중요한 단계가 있다. PFA에 장기간 노출되면 에피토프를 마스크할 수 있으며, 따라서 항원성20,21,22가감소합니다. 따라서 고정 시간을 필요한 최소로 제한하고 샘플을 적절한 용액으로 전송하는 것이 중요합니다(예: 장기 저장을 위해 0.02% NaN3으로 보충된 PBS). 그러나, 여기에 제공된 모든 대표적인 심상 및 프로젝션은 보관된 뇌 샘플에서 획득되었으며, 그 중 일부는 몇 주 동안 PFA에 저장되어 있었으며, PFA에 노출된 장기 물질에 대한 기술의 적용 가능성을 강조합니다. 장시간 연장될 수 있습니다. 인간의 뇌 샘플13에대해 유사한 결과가 나타났습니다. 또 다른, 가장 중요하지 않은 경우, 중요한 단계는 항체 배양이다. 항체 농도는 신중하게 선택해야합니다. 대부분의 경우, 표준 IHC 농도는 심부 조직 항체 라벨링을 위한 좋은 출발점이지만, 일부 항원들은 항체 농도의 추가적인 최적화를 요구할 수 있다. 이 프로토콜은 RABV N 및 P 둘 다 사용된 항체에 의해 용이하게 검출될 수 있음을 보여준다. MeOH 전처리는 일반적으로 면역 표지를 향상하는 동안, 몇몇 항원은 이 처리와 양립할 수 없습니다. 이들을 위해, 르니에 및동료(14)는 대안적인 MeOH-free 샘플 전처리를 제공했다. 획득한 이미지 스택을 분석하려면 적절한 계산 능력이 필요합니다. 스택당 최대 수기가바이트의 파일 크기가 크기 때문에 이미지를 처리하려면 강력한 컴퓨터가 필요합니다. 후처리에는 종종 배경 잡음의 빼기와 수집 관련 표백 효과를 보상하기 위한 표백 보정이 포함됩니다. 거리를 측정 할 때, 부작용으로, 조직이 청산 과정에서 축소된다는 것을 명심해야합니다.
빛 시트 형광 현미경 검사법 (LSFM) 또는 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법 (2PLSM)과 같은 다른 현미경 플랫폼과 비교하여 CLSM은 가장 제한된 작업 거리를 가지고 있습니다. 따라서 이미징을 위해 장기를 두께가 1mm로 미리 분할해야합니다. 또한 CLSM은 높은 이미징 해상도로 수집 속도가 가장 빠름입니다. 가벼운 시트 현미경의 사용은 동시에 이미지 해상도를 희생하면서, 전체 뇌 이미징까지 더 큰 볼륨의 빠른 이미징을 허용할 것입니다. 또 다른 한계는 감소파장 조직 자가형광의 고유 증가입니다. 이는 Hoechst 염료를 포함하여 405 nm에서 레이저 라인에 의해 흥분된 형광및 염료의 사용을 불가능하게 한다.
다른 조직 정리 기술과 관련하여 iDISCO14와 uDISCO13의 하이브리드는 가장 긍정적 인 특성을 결합합니다 : 면역 염색과 매우 호환되며 다재 다능하고 비교적 빠르며 저렴합니다. 우수한 클리어링 기능, 그리고 표준 공초점 현미경으로 실현 가능합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 뇌 조직의 면역 염색 및 제거에 제한되지 않지만, 또한 신경침습적 및 비신경적 침습적 모두의 다양한 다른 연조직 및 병원체에도 적용될 수 있다. 결론적으로, 여기에 기술된 프로토콜은 RABV 감염된 뇌 조직의 고해상도 3D 이미징을 위한 파이프라인을 나타낸다. 감염된 뇌 조직의 3D 재건은 RABV 질병 진행, 병인 및 신경 침입과 관련된 다양한 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 토마스 C. 메텐라이터와 베레나 테 캄프가 원고를 비판적으로 읽어 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 메클렌부르크 서부 포메라니아의 연방 우수 이니셔티브와 유럽 사회 기금 (ESF) 그랜트 KoInfekt (ESF/ 14-BM-A55-0002/16)와 에서 Lyssaviruses에 대한 교내 공동 연구 보조금에 의해 지원되었다 프리드리히 로플러 연구소 (리-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
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