Summary
الولادة المعززة بالحمل الحراري (CED) هي طريقة تمكن من الولادة الفعالة للعلاجات في الدماغ عن طريق التسريب المباشر لأحجام الأنسجة الكبيرة. يتطلب الإجراء استخدام القسطرة وإجراء حقن مُحسَّن. يصف هذا البروتوكول منهجية CED لجسم مضاد في دماغ الماوس.
Abstract
الولادة المعززة بالحمل الحراري (CED) هي تقنية جراحة عصبية تمكن من التسريب الفعال لأحجام الدماغ الكبيرة باستخدام نظام القسطرة. ويوفر هذا النهج طريقة آمنة للتسليم عن طريق اجتياز حاجز الدم في الدماغ ، مما يسمح بالعلاج بالعلاجات ذات نفاذية BBB الضعيفة أو تلك التي لا يُطلب التعرض المنهجي لها، على سبيل المثال، بسبب السمية. يتطلب CED تحسين تصميم القسطرة، وبروتوكول الحقن، وخصائص الإنفتوسات. مع هذا البروتوكول ونحن نصف كيفية تنفيذ CED من حل يحتوي على ما يصل إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة في putamen caudate من الفئران. وهو يصف إعداد القسطرة خطوة، واختبارها في المختبر وإجراء CED في الفئران باستخدام برنامج حقن منحدر. ويمكن تعديل البروتوكول بسهولة لأحجام التسريب الأخرى، ويمكن استخدامه لحقن مختلف التتبعأو المواد النشطة أو غير النشطة من الناحية الدوائية، بما في ذلك العلاج الكيميائي، السيتوكينات، والجسيمات الفيروسية، وliposomes.
Introduction
يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) حدودًا شبه قابلة للنفاذ تفصل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن الدورة الدموية. الوصول إلى الجهاز العصبي الوطني مع العلاجات هو ضروري ولكن في سياق أمراض مختلفة، مثل أورام الدماغ، مرض الزهايمر (AD) أو مرض باركنسون (PD) من بين أمور أخرى1. وهذا يصبح مهما في تطوير علاجات جديدة، وخاصة إذا كان الدواء اختبار معارض ضعف نفاذية BBB أو التعرض المنهجي يمكن أن يؤدي إلى سمية خطيرة1،2. تعرض بعض الأجسام المضادة المستخدمة سريرياً كلا من هذه الميزات. والحل لهذه المشكلة هو تقديم العلاجات مباشرة وراء BBB.
الولادة المعززة بالحمل الحراري (CED) هي تقنية جراحة عصبية تمكن من التسريب الفعال لأحجام الدماغ الكبيرة. ويتحقق ذلك عن طريق تركيب قسطرة واحدة أو أكثر جراحيًا في المنطقة المستهدفة. أثناء تطبيق الدواء ، يتم تشكيل تدرج ضغط عند فتح القسطرة ، والذي يصبح القوة الدافعة لتشتت الإنفطن في الأنسجة3،4. وبالتالي فإن مدة التسريب وليس معاملات الانتشار هي التي تحدد نطاق التسريب2و4و5 . وهذا يوفر تسليم موحد من infusate على حجم الدماغ أكبر بكثير بالمقارنة مع التقليدية, انتشار على أساس أساليب الحقن داخل الدماغ2,6. في الوقت نفسه، هذه الطريقة التسليم لديه خطر أقل من تلف الأنسجة2. وبناء على ذلك، يمكن أن تمكن CED الإدارة الآمنة والفعالة من العلاج الكيميائي التقليدي لعلاج أورام الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن تسليم العوامل المناعية أو الأجسام المضادة المؤلمة والعدائية في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي الأخرى2 ،7،8،9. يتم اختبار CED حاليا في علاجات مرض باركنسون، مرض الزهايمر، فضلا عن الورم الدبقي عالية الجودة2،7،8،10،11.
تصميم القسطرة ونظام الحقن هي من أهم العوامل التي تؤثر على نتيجة CED 10،12،13،14،15،16. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب خصائص فيزيائية كيميائية محددة من إينفوسات، بما في ذلك حجم معتدل من الجسيمات، وتهمة الأنيونية، وانخفاض تقارب الأنسجة 10،17. كل من هذه المعلمات يجب أن تكون قابلة للتكيف وفقا للسمات النسيجية لمنطقة الدماغ لتكون مستهدفة2،10،17.
هنا نقوم بوصف منهجية لأداء CED من محلول الأجسام المضادة في putamen caudate (striatum) من الفئران. وعلاوة على ذلك، يتضمن البروتوكول إعداد قسطرة الخطوة في إعداد المختبر، واختبارها في المختبر وإجراء CED.
هناك العديد من تصاميم القسطرة المتاحة في الأدب، وتختلف على شكل قنية، والمواد المستخدمة وعدد فتحات القسطرة12،15،18،19،20 ،21،22. نحن نستخدم قسطرة خطوة مصنوعة من السيليكا الشعيرات الدموية المنصهرة جاحظ 1 ملم من إبرة معدنية نهاية حادة. هذا التصميم القسطرة يمكن تصنيعها بسهولة في مختبر البحوث وreproducibly يعطي نتائج جيدة CED عند اختبارها في المختبر مع كتل أغاروز مع المعلمات المادية تشبه parenchyma الدماغ في الجسم الحي23.
وعلاوة على ذلك، نقوم بتنفيذ نظام منحدر لتقديم 5 ميكرولتر من الإنفتوسات في الجسم الحي. في مثل هذا البروتوكول يتم زيادة معدل الحقن من 0.2 ميكرولتر / دقيقة إلى حد أقصى قدره 0.8 ميكرولتر / دقيقة، وبالتالي تقليل فرص الجزر الإنفذي على طول القسطرة وكذلك خطر تلف الأنسجة16. باستخدام هذا البروتوكول، قمنا بإدارة الفئران بنجاح مع ما يصل إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة في 5 ميكرولتر من PBS على مدى 11 دقيقة 30 ثانية.
ويمكن تعديل البروتوكول بسهولة لأحجام التسريب الأخرى أو لحقن مواد أخرى مختلفة، مثل العلاج الكيميائي، السيتوكينات،الجسيمات الفيروسية أو liposomes 2،10،14،18 ،22. في حالة استخدام الإنفتوسات مع خصائص كيميائية نباتية مختلفة بشكل كبير مقارنة بمحلول ملحي مُسحَرَّص بالفوسفات (PBS) أو السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF)، يوصى بخطوات إضافية للتحقق من صحة الأجسام. لتجميع القسطرة، والتحقق من الصحة وCED، ونحن نصف جميع الخطوات باستخدام الروبوت مجسمة مع وحدة الحفر والحقن شنت على إطار مجسم منتظم. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا الإجراء مع إطار مجسم يدوي متصل بمضخة التسريب الصغير القابلة للبرمجة التي يمكن أن تدفع المحاقن الدقيقة الزجاج الموصوفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل المكتب البيطري الكانتوني السويسري تحت رقم الترخيص ZH246/15.
1. إعداد قسطرة الخطوة
- إعداد أنابيب السيليكا المنصهرة لخطوة القسطرة
- قطع الشعيرات الدموية السيليكا تنصهر مع القطر الداخلي من 0.1 ملم وسمك الجدار من 0.0325 ملم الأنابيب إلى طول 30 ملم.
- فحص الأنابيب للشقوق والحرارة تلميع نهايات باستخدام microforge لضمان فتحات الأنابيب يكون لها سطح أملس.
- تثبيت الأنبوب الداخلي في إبرة معدنية
- جبل إبرة 27 G على حقنة 10 درجة مئوية ووضع الحقنة في الروبوت مجسمة.
- باستخدام الروبوت، حرك الحقنة فوق سطح صلب والمسها بطرف الإبرة. وينبغي ملاحظة هذا الموقف أو حفظه في البرنامج لأنه سيكون بمثابة سطح مرجعي لتحديد طول خطوة القسطرة.
- رفع الإبرة لتمكين وضع الشعيرات الدموية السيليكا تنصهر داخل الإبرة
- ضع الشعيرات الدموية السيليكا تنصهر في إبرة بحيث 20 ملم من الشعرية هو جاحظ من الإبرة.
- باستخدام ماصة، تنتشر بالتساوي 2 ميكرولتر من لاصق سيانوكريلات عالية اللزوجة على الشعرية، بدءا من إبرة معدنية والانتهاء من 10 ملم فوق الطرف السفلي من الشعرية، كما هو موضح في الشكل 2.
- باستخدام الروبوت مجسمة، خفض الإبرة حتى غيض من إبرة معدنية هو 1 ملم على السطح المرجعي. وبهذه الطريقة سيتم إصلاح الشعرية السيليكا تنصهر في إبرة معدنية، وسوف تشكل خطوة 1 ملم من غيض من إبرة معدنية. إزالة أي فائض من الغراء تشكيل في نهاية إبرة معدنية لتجنب تحاد الخطوة.
- انتظر 15 دقيقة حتى تصلب الغراء وإزالة الحقنة مع القسطرة من الروبوت المجسمة. تأكد من أنه في الخطوة تمت إزالة جميع الغراء الزائد عن طريق التحقق من طرف القسطرة تحت المجهر.
- اختبار قسطرة الخطوة باستخدام كتلة من الأجاروز
- إعداد 0.6٪ محلول أغاروز في PBS في علبة هلام التقليدية والانتظار حتى البلمرة. قطع أغاروز في ما يقرب من 20 مم × 20 مم كتل. حتى الاستخدام، والحفاظ على كتل مغمورة في PBS.
- ملء يدويا حقنة القسطرة خطوة مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل من الأزرق trypan المصفاة.
- باستخدام الروبوت المجسم، الاستغناء عن 1 ميكرولتر في 0.2 ميكرولتر / دقيقة من أجل تقييم ختم خطوة القسطرة أثناء إجراء التثبيت. يجب أن يكون الحل الأزرق تريبان مرئية فقط على طرف القسطرة. امسحه بنسيج ورقي
- وضع كتلة أغاروز في الروبوت مجسمة ومعايرة الروبوت حتى يتم الإشارة إلى غيض من القسطرة ضد سطح كتلة أغاروز.
- برنامج معلمات الحقن لCED.
- وبالنسبة لحجم الحقن الذي تبلغ 5 ميكرولتر، استخدم الخطوات التالية: 1 ميكرولتر عند 0.2 ميكرولتر/دقيقة، ثم 2 ميكرولتر عند 0.5 ميكرولتر/دقيقة و2 ميكرولتر عند 0.8 ميكرولتر/دقيقة.
- من أجل حقن الحل في البوتامن الماوين caudate (striatum)، إجراء مثل هذا الحقن في موقف 1 مم أمامي و 1.5-2 مم الجانبية من بريما على عمق 3.5 ملم.
- بعد الحقن، اترك القسطرة في مكانها لمدة دقيقتين ثم تراجع عند 1 مم/دقيقة لضمان التشتت السليم للسائل في الدماغ وختم مسار الحقن أثناء إزالة القسطرة.
ملاحظة: اعتمادا على الروبوت مجسمة محددة المستخدمة، يمكن برمجة جميع المعلمات في سيناريو واحد. يتوفر نص مكتوب على سبيل المثال كمادة تكميلية.. .
- بدء إجراء CED وحقن 5 ميكرولتر من الحل الأزرق تريبان في كتلة أغاروز.
- تقييم شكل سحابة من الأزرق تريبان في أغاروز والتسرب المحتمل على طول القسطرة. يجب أن تشكل الأزرق تريبان القطع الناقص أو سحابة مستديرة مع مركز حول طرف القسطرة وقطرها لا يقل عن 1 ملم. لا ينبغي أن يكون هناك تدفق خلفي كبير على طرف الإبرة المعدنية مرئية.
- وضع كتلة أجاروز جديدة والبدء في حقن الثانية من 1 ميكرولتر في 0.2 ميكرولتر / دقيقة من أجل تقييم انسداد القسطرة مع أغاروز. يجب أن تبدأ Trypan الأزرق مرة أخرى في تشكيل سحابة من طرف القسطرة مباشرة بعد بدء الحقن.
- تقييم ما إذا كان حجم المتبقية في المحاقن يتوافق مع 3 ميكرولتر. قد تشير أي اختلافات إلى تسرب السوائل من خلال تركيب القسطرة أو مغطس الحقنة.
- إذا كانت جميع حقن الاختبار ناجحة، يتم إغلاق القسطرة بشكل جيد، مستقيم، ولا يلاحظ أي حل أزرق من بقع أخرى غير طرف القسطرة، واغسل القسطرة مع H2O منزوع الأيونات (dH2O) حتى لا تظهر أي آثار للأزرق التربان ثم يغسل عشر مرات على النحو التالي: 70٪ الإيثانول و 100٪ الإيثانول تليها بيغ مرة أخرى مع الإيثانول 70٪ والمياه منزوعة الأيونات نظيفة.
- تخزين القسطرة في ظروف جافة.
2. الحمل الحراري تعزيز تسليم محلول الأجسام المضادة في الدماغ مورين
ملاحظة: اعتمادا على لوائح رعاية الحيوان المحلية ، يمكن تنفيذ أنواع مختلفة من التخدير والمسكنات والمضادات الحيوية لهذا الإجراء. يصف هذا البروتوكول استخدام التخدير بالحقن. يمكن أيضا استخدام التخدير الاستنشاقمثل isoflurane عن طريق تركيب قناع الأنف على الإطار المجسم. وبالإضافة إلى ذلك، نوصي بإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب للوقاية من العدوى.
- الإعداد الجراحي
- إعداد التخدير وحلول الترياق. يمكن تخدير الفئران بأمان باستخدام تخدير مكون من ثلاثة مكونات يحتوي على الفنتانيل (0.05 مغ/كغ)، ميدازولام (5 ملغ/كغ) وميديتوميدين(0.5 مغ/كغ) المخفف في dH 2 O المعقمة. نقوم بإجراء الاستيقاظ بخطوتين باستخدام حلين مضادين، أحدهما يحتوي على فلومازينيل (0.5 مغ/كغ) وبوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) في dH2O المعقمة (محلول الترياق الأول). والثاني يحتوي على atipamezole (2.5 ملغ / كغ) في dH معقمة2O (حل الترياق الثاني).
- إعداد محلول التسكين الذي يحتوي على كاربروفين (5.667 مغ/كغ) المخفف بـ dH2O المعقمة.
- تنظيف الإطار المجسم، وسادة التدفئة وعناصر الروبوت مجسمة. نضع في اعتبارنا أنه لا يمكن تنظيف جميع أجزاء الروبوت دون خطر الضرر. الرجوع إلى دليل الروبوت للحصول على تفاصيل حول التنظيف والاستعداد للاستخدام.
- تجميع الحقنة مع القسطرة الخطوة ودافق عدة مرات مع dH2O، 70٪ الإيثانول و الإيثانول 100٪ تليها مسح مرة أخرى مع الإيثانول 70٪ وdH2O. وأخيرا، اغسل الحقنة باستخدام PBS أو غيرها من المخازن المؤقتة لاستخدامها في إعداد الحل للحقن داخل الجمجمة، على سبيل المثال السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. يجب أن المغطس من المحاقن تتحرك بسلاسة وبحرية خلال الإجراء كله.
- معايرة برنامج الروبوت مجسمة مع الإطار المجسم.
- اختبار برنامج الروبوت مجسمة عن طريق ضمان أن الأسلحة الروبوت تتحرك بحرية وأن مضخة حقن متصلة بشكل صحيح ويمكن تنفيذ إجراء CED دون أي اضطرابات. وهذا يشمل اختبار حركة الروبوت، وحقن المنحدرة، والتحقق من خطوة الانتظار 2 دقيقة وسرعة التراجع القسطرة. وينبغي أن تتلاءم جميع البارامترات مع إجراء CED المبرمج مسبقاً الوارد وصفه في النقطة 1-3-5.
- أدخل بت الحفر في الحفر. من المستحسن تعقيم بت الحفر قبل الاستخدام.
- إعداد حل الأجسام المضادة باستخدام PBS أو حلول المخزن المؤقت الأخرى مثل aCSF. يمكن حقن 1 إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة في 5 ميكرولتر في إجراء CED واحد. وينبغي اختبار كميات أخرى وكميات البروتين قبل إجراء التجربة. يجب أن تدرك أن استخدام حلول اللزوجة العالية قد يؤدي إلى انسداد القسطرة.
- تحميل الحقنة يدويا مع الجسم المضاد المخفف.
- حقن الأجسام المضادة عن طريق CED في striatum
- وزن الماوس وحقن حل التخدير المكون من ثلاثة مكونات في الصفاق وفقا لوزن الجسم. لاحظ وقت الحقن. نقل الماوس إلى قفص منفصل ساخنة مع وسادة التدفئة.
- مراقبة الماوس لتحديد متى يبدأ التخدير. بمجرد توقف الماوس عن الحركة، ضع مرهم العيون على العينين لحماية القرنية من الجفاف أثناء الجراحة. التخدير الكامل يبدأ عادة 10-15 دقيقة من حقن محلول التخدير المكون من ثلاثة مكونات.
- تحقق من ردود الفعل الألم باستخدام اختبار قرصة منعكس لضمان التخدير الكامل للحيواني.
- حلاقة الرأس باستخدام الانتهازي الشعر.
- تطهير الجلد مع مسحات القطن غارقة في محلول اليود. فرك الجلد ثلاث مرات في حركة دائرية.
- باستخدام مشرط، قم بعمل شق جلد 10 مم على طول خط الوسط القحفي على مستوى العين.
- إصلاح الماوس في الإطار المجسم باستخدام مشبك الأنف وقضبان الأذن. تأكد من أن سطح الجمجمة أفقي وآمن بإحكام. وبصرف النظر عن الملاحة التشريحية الصحيحة وهذا أمر بالغ الأهمية أيضا لتجنب إمالة الجمجمة أثناء الحفر وإجراء CED.
- ضع الحقنة في الروبوت المجسم.
- مزامنة بت الحفر مع طرف القسطرة على نقطة مرجعية. من الأهمية بمكان أن يتم تحديد العلاقة بين موقف الحفر والمحاقن بدقة في البرنامج، بحيث يمكن إجراء الحقن في المنطقة التشريحية المطلوبة من الدماغ.
- سحب الجلد باستخدام ملقط وتوطين بريغا على سطح الجمجمة.
- مرجع bregma في البرنامج باستخدام غيض من بت الحفر.
- نقل الحفر إلى موقف 1 مم أمامي و 2 مم الجانبية من بريغا وحفر حفرة لدغ. يجب الحرص على عدم الإضرار الأم دورا.
- حرك الحقنة فوق حفرة البور
- صرف 0.5-1 ميكرولتر من الحقنة لضمان عدم ترك فقاعات الهواء في القسطرة.
- بدء تشغيل برنامج CED الموضح في النقطة 1.3.5. مراقبة سطح الجمجمة عن أي آثار من التدفق الخلفي السائل من بقعة الحقن. مراقبة معدل التنفس للحيواني.
- بمجرد انتهاء برنامج CED وسحب القسطرة من الدماغ، ابدأ مضخة الحقن عند 0.2 ميكرولتر/دقيقة من أجل التحقق من انسداد القسطرة أثناء CED. إذا لم يحدث انسداد، يجب أن ترى على الفور قطرة من مزيج الحقن القادمة من طرف القسطرة.
- قبل إعادة استخدام القسطرة أو تخزينها، قم بفحص خطوة القسطرة بصرياً بحثاً عن أي علامات تلف أو تآكل تحت المجهر وتنظيفها كما هو الحال في الخطوة 1.3.10.
- إجراء الاستيقاظ
- قم بإزالة الماوس برفق من الإطار المجسم.
- غسل موقع الجراحة مع محلول ملحي معقم.
- باستخدام ملقط، وملء حفرة لدغ مع شمع العظام.
- أغلق الجلد بملقط رفيع الرأس وطبق الغراء الجراحي مع ماصة 10 ميكرولتر على القطع. انتظر 15-30 ق للغراء للبلمرة.
- تطبيق حل التسكين عن طريق الحقن تحت الجلد. لاحظ وقت الحقن.
- تطبيق الحل الترياق الأول. لاحظ وقت الحقن.
- نقل الماوس إلى قفص منفصل مع وسادة التدفئة ومراقبة الحيوان لردود الفعل الدهشة.
- إذا لم يكتسب الماوس وعيه الكامل بعد 15 دقيقة من إعطاء محلول الترياق الأول، قم بتطبيق الحل الترياق الثاني عن طريق الحقن تحت الجلد.
- مراقبة الحيوانات خلال مرحلة الانتعاش.
- تحقق من 1-2 ساعة في وقت لاحق وكذلك في اليوم التالي للمضاعفات بعد العملية الجراحية. إذا لزم الأمر، إعادة تطبيق التسكين.
- للوقاية من العدوى، إضافة سلفادوكسين (التركيز النهائي 0.08٪ ث / الخامس) وتريميثوبريم (التركيز النهائي 0.016٪ ث / الخامس) إلى مياه الشرب التي الحيوانات لديها الوصول إلى الليبتوم لمدة أسبوع واحد بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح هذا البروتوكول إعداد قسطرة الخطوة (الشكل 1) لاستخدامها في إجراء CED في بيئة مختبرية. من أجل السيطرة على القسطرة للتسرب، الجزر على طول الجهاز إبرة وانسداد، ونحن نوصي بإجراء حقن صبغة، على سبيل المثال، trypan الحل الأزرق، في كتلة أغاروز. يصور الشكل 3 سحابة من التربان الأزرق الذي يتشكل بعد حقن 1 ميكرولتر عند 0.5 ميكرولتر/دقيقة باستخدام قسطرة CED (الشكل3A). لم يكن هناك ارتداد على طول الجهاز الإبرة مرئية خلال بداية خطوة القسطرة. وعلاوة على ذلك، شكلت سحابة مشتتة شكل كروي المطلوب. وهذا على النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام إبرة نهاية حادة 27 G التقليدية (الشكل 3B)، حيث يمكن ملاحظة الجزر كبيرة.
وعلاوة على ذلك، يتطلب CED إجراء حقن الأمثل. ويبين الشكل 4 نتائج حقن 2 ميكرولتر من التربان الأزرق في كتلة أغاروز باستخدام إجراء التجشؤ الموصوف في البروتوكول (A) مقارنة بحقن بمعدل ثابت قدره 2 ميكرولتر/دقيقة (B). وأجبرت سرعة الحقن العالية الجزر على طول القسطرة حتى عندما كان يتم استخدام قسطرة CED.
وأخيرا، كما هو مبين في الشكل5، CED تمكن التسريب من كميات كبيرة من الدماغ المورين. تم حقن الفئران مع الأجسام المضادة للفأر TNFα TNFα جنبا إلى جنب مع FITC-dextran في 5 ميكرولتر من PBS بواسطة CED (اللوحة العليا) أو عن طريق حقن بولوس التقليدية (لوحة أسفل). وكان ملف التسريب من CED أكثر اتساقا من الحقن التقليدية ويمكن ملاحظة ضرر أقل من الأنسجة. في كلتا الحالتين كان هناك ملف تعريف توزيع نموذجي للأجسام المضادة والجسيمات dextran على الجسم كالوسوم. ومع ذلك، كان ملف تشتت الأجسام المضادة عن طريق الحقن أكثر انتشارا من dextran الوزن الجزيئي العالي، مما يدل على الاختلافات في التوزيع بين الإنفوسات المختلفة.
الشكل 1: رسم تخطيطي يظهر طرف قسطرة خطوة CED. أمامي(A) والجانب (B) وجهات النظر. المخطط ليس على نطاق واسع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي يصور منطقة التطبيق من لاصقة. يتم إدراج العلوي 10 ملم من أنابيب السيليكا تنصهر في إبرة معدنية. تطبيق لاصقة على 10 ملم من الأنابيب بدءا من غيض من إبرة معدنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة نتائج التسريب باستخدام قسطرة CED أو إبرة نهاية حادة. حقن 1 ميكرولتر من 0.4٪ التربان الأزرق في كتلة أغروس 0.6٪ في 0.5 ميكرولتر / دقيقة باستخدام قسطرة CED (A) وإبرة 27G نهاية حادة(B). الصور التي تم التقاطها مباشرة بعد سحب القسطرة أو الإبرة. الصليب علامات غيض من القسطرة أو إبرة. شريط مقياس = 5 ملم.
الشكل 4: مقارنة نتائج التسريب لبروتوكول التكثيف مع بروتوكول المعدل الثابت. حقن 2 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق في 0.6٪ كتلة أغاروز باستخدام بروتوكول CED منحدر (0.4 ميكرولتر في 0.2 ميكرولتر / دقيقة، ثم 0.8 ميكرولترفي 0.5 ميكرولتر / دقيقة و 0.8 ميكرولتر في 0.8 ميكرولتر / دقيقة (A) أو 2 ميكرولتر / دقيقة بروتوكول حقن معدل ثابت (B). في كلتا الحالتين تم استخدام قسطرة CED. الصور التي تم التقاطها مباشرة بعد سحب القسطرة. الصليب علامات طرف القسطرة. شريط مقياس = 5 ملم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لتدفق المورين ستراياتوم بواسطة CED أو عن طريق حقن البولوس التقليدي. تم حقن الفئران في السترياتوم (موقف 1 مم أمامي و2 مم جانبي من بريما، عمق 3.5 مم) مع 1 ميكروغرام من الفئران المضادة للماوس TNFα جنبا إلى جنب مع 1 ميكروغرام من FITC-Dextran مع الوزن الجزيئي 2000 كيلودا في 5 ميكرولتر من PBS. تم إجراء بروتوكول CED (اللوحة العليا) أو حقن بولس التقليدية (27 إبرة G، معدل الحقن 1 ميكرولتر / دقيقة) (أسفل). تم التضحية الفئران مباشرة بعد إجراء CED عن طريق خنق CO2 الخاضعة للرقابة وperfused مع 4٪ الفورمالديهايد في PBS. تم تشريح العقول وبالإضافة إلى ذلك ثابتة مع 4٪ الفورمالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في وقت لاحق، تم غسل العقول مع السكروز 15٪ لمدة 60 دقيقة ونقلها إلى 30٪ السكروز في 4 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، تم تجميد العقول على الجليد الجاف. تم تلوين المقاطع العائمة الحرة (25 درجة مئوية) باستخدام الأجسام المضادة للماعز متعدد الكلونات IgG (H+L) إلى جانب Alexa Fluor 647 وملطخة بـ DAPI. وقد تمت معالجة الصور باستخدام توزيع فيجي لـ ImageJ. 10x التكبير، مقياس بار = 5 مم 4 الفئران لكل مجموعة؛ يتم عرض صورة تمثيلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الولادة المعززة الحمل الحراري، أو ضخ المخدرات بوساطة الضغط في الدماغ، واقترح لأول مرة في أوائل عام 19903. هذا النهج وعود التسريب من كميات كبيرة من الدماغ وراء حاجز الدم في الدماغ بطريقة تسيطر عليها2. ومع ذلك، حتى الآن، تم إجراء عدد قليل فقط من التجارب السريرية باستخدام هذا النهج، ويرجع ذلك جزئيا إلى CED في الإعداد السريري قد أظهرت أن تتطلب من الناحية الفنية24،25. ويبدو أن التطورات الأخيرة في تصميم القسطرة وبرامج التسريب قد تغلبت على هذه الصعوبات التقنية8،19. التقدم المحرز في التنفيذ السريري للأجسام المضادة العلاجية، بما في ذلك ظهور وكلاء حجب نقاط التفتيش المناعية، ينتظر التطبيق في علاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي10. ويمكن زيادة هذا التطور إلى حد كبير عن طريق استخدام CED في الإعداد التجريبي، مثل استخدام نماذج القوارض الصغيرة.
تتوفر نماذج مختلفة من مرض الجهاز العصبي الوطني في الفئران. وتشمل هذه التجريبية التهاب الدماغ المناعي الذاتي (EAE) للتصلب المتعدد (MS) ونماذج هندسية وراثيا لمرض الزهايمر (AD)، مرض باركنسون (PD)، أو لسرطان الدماغ. العديد من نماذج أورام الدماغ تعتمد أيضا على تلقيح الورم التقويمي من خطوط الخلايا الدبقي ة المورين أو زرع xenografts المستمدة من المريض. يتيح هذا البروتوكول تسليم حلول الأجسام المضادة مباشرة إلى مواقع تشريحية محددة، وبالتالي تشبه الإجراءات العلاجية. ويمكن تنفيذه في مختلف التخطيطات التجريبية حيث تسليم الأجسام المضادة في منطقة الدماغ دقيقة يلعب دورا محوريا.
العامل الحاسم في إجراء الانسداد الكلى في الفئران هو توافر القسطرة. يحتوي هذا البروتوكول على وصف دقيق لكيفية تجميع قسطرة الخطوة واختبارها في سلسلة من التجارب المختبرية. يجب أن نضع في اعتبارنا أن السيليكا المنصهرة التي يتم إجراء أنابيب الخطوة هي مادة هشة ونوعية CED مع قسطرة معينة قد تنخفض مع مرور الوقت. من المستحسن التحكم في معلمات القسطرة الخطوة بين التجارب في الجسم الحي عن طريق تكرار الاختبارات في المختبر الموصوفة في القسم البروتوكول 1.3.
ويمكن تعديل البروتوكول لأحجام حقن مختلفة، وأنواع من إينفوسات ومناطق الدماغ. يمكن التلاعب حجم الحقن عن طريق تغيير نسبي لمدة خطوات الحقن. هنا نقوم بوصف ضخ 5 ميكرولتر، ولكن تم الإبلاغ عن CED مع 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في الأدب باستخدام نهج مماثل في نماذج أورام الدماغ مورين، وتحقيق توزيع الأنسجة ممتازة وأحجام التسريب تتجاوز إلى حد كبير حقن بولس7 . وعلاوة على ذلك، تم الإبلاغ عن ما يصل إلى 28 ميكرولتر من أحجام إينفوسات باستخدام CED لتطبيق السوائل في دماغ الفئران22،26. كما يمكن حقن المواد غير البروتينية بواسطة CED، مع الأخذ في الاعتبار أن infusate لا ينبغي أن تكون عالية اللزوجة لتجنب انسداد طرف القسطرة الضيقة. باستخدام liposomes، وقد ثبت أن تهمة الجزيئات المشبعة يمكن أن تؤثر إلى حد كبير على اختراق الأنسجة، مع جزيئات محايدة أو مشحونة سلبا تكون قادرة على توزيعها على أكبر كميات22. كما هو موضح في الشكل 5، فيتك-dextran والأجسام المضادة تفريق بشكل مختلف: على الرغم من أن كلا من الأجسام المضادة وFITC-dextran توزيع بالمثل على طول الجسم كالوسوم، واختراق الأجسام المضادة من parenchyma الدماغ هو أكثر انتشارا من لFITC-dextran، الذي يظهر دائرة نصف قطرها أصغر ونمط توزيع أكثر بقعة. وهذا يبرز الاختلافات في ملف تعريف CED بين الإنفوسات ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المختلفة.
وعلاوة على ذلك، أجريت تجربة CED الموصوفة هنا والموضحة في الشكل 5 عن طريق الحقن بجسم مضاد للفأرة TNFα في فئران صحية، بافتراض الحد الأدنى من الكمية المستهدفة في السترياتوم. وجود مستضد كونيات سيغير نمط توزيع الأنسجة. ويمكن أن تتأثر أكثر من ذلك بالأنسجة غير المتجانسة في موقع تشريحي، كما هو موضح في الشكل 5 عن طريق توزيع الإنفوسوم على طول الجسم.
وأخيرا، يتأثر CED بتدفق السائل الخلالي، والتي في حالة حقن السترياتوم، يمكن أن تتدفق انفة نحو البطينين الجانبي27. في الواقع، حتى عندما يتم إصلاح الأنسجة مباشرة بعد الانتهاء من CED، يمكننا أن نلاحظالتصاق ملحوظ من الأجسام المضادة حقن إلى جدار البطين (الشكل 5). ويمكن أن يتأثر ذلك أكثر بالظروف المرضية للإصابة بالجهاز العصبي الوطني، على سبيل المثال في سياق أورام الدماغ. نخر بؤري، لوحظ في كثير من الأحيان في أورام الدماغ عالية الجودة28،يمكن أن تؤثر على تدفق السائل الخلالي وبالتالي تغيير نمط توزيع infusate29. وتشمل الحالات المرضية الأخرى التي يمكن أن تؤدي إلى تغيير توزيع الأنسجة من إينفوسات بالمقارنة مع parenchyma صحية السكتة الدماغية أو إصابات الدماغ الصادمة30. وباختصار، يجب التحقق بعناية من كل سلسلة من تجارب CED لضمان التسريب الناجح لمنطقة الدماغ المستهدفة.
حاليا، يستخدم الباحثون في كثير من الأحيان مضخات التناضح القابلة للزرع لتسليم المواد إلى CSF أو الدماغ (الورم) parenchyma31،32،33. في بعض الحالات يمكن استخدام CED كما هو موضح هنا كبديل. ويمكن أن يتم ذلك عدة مرات مع الترددات اعتمادا على منطقة الدماغ، ونوع من infusate، وحجم وبروتوكول التخدير المستخدمة. يمكن أن يكون التسليم المتقطع للأدوية ذا أهمية خاصة عندما يؤدي التعرض المطول للإنفذيسات إلى تحمل أو آثار جانبية نظامية. ومن المتصور أنه في الحالات التي يتم فيها تسليم نسبة عالية من الاحتفاظ بنصف العمر وinfusates نصف العمر، فإن هذا النهج يمثل صقلا وفقا لمبدأ 3R لأنه لن يكون من الضروري زرع مضخة. في الختام، يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لغرس كميات كبيرة من محلول الأجسام المضادة في striatum murine ويمكن تعديلها لمناطق الدماغ الأخرى وأنواع الإنفتوسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يذكر يوهانس فوم بيرغ كمخترع في طلب البراءة (PCT/EP2012/070088) من جامعة زيوريخ. [ميشل] [بففينجر], [ليندا] [سكهلّمر] و يوهانس [فوم] [برغ] ذكرت كمخترعات على براءة اختراع طلب ([إب19166231]) من الجامعة زوريخ. وليس لصاحبي البلاغ مصالح مالية إضافية.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من جامعة زيوريخ (FK-15-057)، ومؤسسة نوفارتيس للبحوث الطبية والبيولوجية (16C231) وأبحاث السرطان السويسرية (KFS-3852-02-2016، KFS-4146-02-2017) إلى يوهانس فوم بيرغ وبريدج بروف للمفهوم (20B1-1) _177300) إلى ليندا شيلهامر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
