Summary
ダニ hemolymph の分析は、いくつかの病原体が病気を引き起こす方法と、ダニ免疫学的がこの感染症にどのように反応するかに関する重要な情報源を表しています。本研究は、真菌 propagules を接種し、 Rhipicephalus microplusうっ積の雌から hemolymph を採取する方法を示す。
Abstract
ダニは、吸血シソとRhipicephalus microplusは、貧血、体重減少、動物の革の減価償却を引き起こし、またいくつかの病原体のベクターとして作用することができるので、獣医学の非常に重要な義務があります。これらの寄生虫を防除するための法外な費用のために、化学殺ダニ剤の不適切な使用によって引き起こされる環境への損傷、および伝統的な parasiticides に対する抵抗の増加、ダニの代替制御、の使用によるentomopathogenic 菌類は、例えば、興味深いアプローチと考えられてきました。それにもかかわらず, ダニの免疫システムは、これらの entomopathogens と戦うために動作する方法を示しているいくつかの研究.従って、この議定書はうっ積の女性への entomopathogen 接種のために使用される2つの方法および hemolymph のコレクションおよび hemocytes 収穫のために使用される2つの技術を示す。ダニの女性の体の脚の挿入で病原体の接種は、頻繁に Gené's 器官を損傷する恒星と capitulum の間の接種とは異なり、女性の生物学的パラメータの評価を可能にする。背 hemolymph のコレクションは、脚を介したコレクションよりも高いボリュームの回復をもたらした。ダニ hemolymph の収集と処理のいくつかの制限は、i) hemocytes 「破壊」の高いレート、ii) hemolymph 破壊 midgut、および iii) 低 hemolymph ボリュームの回復が含まれます。Hemolymph が足の切断を通して集められるとき、hemolymph は凝固プロセスを支持する足の入り口で集まるために時間を取る。さらに、最初の方法は実行が容易であると考えられるにもかかわらず、背のコレクションと比較して、脚を通してコレクションで得られる hemocytes は少なくなります。Entomopathogenic 剤によって媒介されるマダニにおける免疫応答を理解することは、その病因を明らかにし、ティック制御のための新しい標的を開発するのに役立つ。ここに記載されている接種プロセスは、非常に低い技術資源を必要とし、病原性微生物にダニを暴露するだけでなく使用することができる。同様に、ダニ hemolymph の収集は、多くの生理学的研究のための最初のステップを表すことができる。
Introduction
牛のダニ、 Rhipicephalus microplusは、熱帯地域の家畜に巨大な負の影響を与える hematophagus ectoparasite です。このダニは、バベシアボビス、バベシア Bigemina、およびAnaplasma marginaleなどの病原性薬剤のベクターであり、直接 hemofeeding 損傷と組み合わせることにより、乳および食肉生産量を減少させることができ、貧血および究極的には死を引き起こす。この ectoparasite による損失は、ブラジル1年間で32億4000万ドルと見積もられた。持続可能な方法が求められており、entomopathogenic 剤の使用は、化学殺ダニ薬2,3,4の使用を減らすための有望な代替と考えられています。
Metarhizium属などの Entomopathogenic 菌類は、ダニを含む節足動物の天敵であり、biocontrollers として使用することができます。これらの病原体は、表皮を通して宿主に積極的に感染し、彼らの体2、5、6を植民地化する。感染が進行するにつれて、細胞および体液性応答はダニ免疫系によって媒介される。ダニ hemolymph の分析は、病原体7,8に挑戦した後の免疫応答を評価するのに有用なツールとして報告されている。
節足動物の免疫応答は、体液性応答および細胞反応に分けられる。体液性応答には、赤血球凝集反応プロセスおよび抗菌タンパク質/ペプチドの産生が含まれ、一方、細胞性免疫応答は hemocytes を介して行われる。これらの細胞は、すべての節足動物から hemolymph に存在し、それが直接貪食とカプセル化プロセスに関連しているように、先天性免疫応答9を含む研究で表現力豊かな役割を開発するために報告されています。したがって、hemocytes に関する研究は、死の経路を調査し、オートファジー、アポトーシス、壊死などのプロセスを理解するのに役立ちます。一部の無脊椎動物は二枚貝類として、hemocytes のコレクションは、細胞破壊、低 hemolymph 量、および低濃度の回収細胞10のような制限に直面する。非常に頻繁に、適用される方法論に応じて、細胞の減少した濃度が得られ、細胞の定量化および分析に直接影響を与える。
Hemolymph で循環する hemocytes の数は、異なる節足動物の間で変動し、性別、年齢、および節足動物の発達段階11などの異なる生理的段階により同じ種で変化することができる。Hemocytes はまた、いくつかの臓器に付着し、感染プロセス11の直後に循環に放出されることが見出され得る。それにもかかわらず、ほとんどの研究では昆虫の使用が報告され、ダニは生理学や病理に関する調査が少ない。ダニの病原の接種および hemolymph のコレクションはより少なく使用された技術であるにもかかわらず、標準的な方法を確立することはより正確な研究の開発を助ける。
本研究の目的は、hemolymph の収集と病原体の接種のための最も使用された方法をmicroplusティックに比較し、hemolymph 獲得および hemocytes 濃度における有効性を評価することであった。
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Protocol
本研究で使用されたダニは人工コロニーから得たもので、活発はリオデジャネイロの連邦農村大学で、脊椎動物の使用に関する倫理委員会によって承認されている (CEUA/UFRRJ #037/2014)。
1. ダニうっ積メス
- ダニの収集後、水道水を使用して女性うっ積を洗浄し、0.5% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム溶液に 500 mL ガラスビーカーに3分間、キューティクル衛生のために (図 1)、次に滅菌ペーパータオルを使用してすべてのメスを乾かします (図2)。
- 均質な加重グループでメスを割る (女性20人ずつ): 1 群の治療を伴わず、5μ l の 0.1% のポリオキシエチレンソルビタン monooleate 水溶液 (v/v) を接種した1つの対照群と、感染群1個を 1.0 x 10 で5μ l を接種した。7 blastospores-1.
注: 体積および hemocyte 濃度には、未処理のティックのみが使用されていました。各群の3回の反復が行われた。
2. 恒星と capitulum の間の病原体の接種
注: 本研究では、例として entomopathogenic 真菌懸濁液を使用した。
- 0.1% ポリオキシエチレンソルビタン monooleate 水溶液 (v/v) の 1 mL で真菌 blastospores を懸濁し、1.0 x 107 blastospores mL-1の最終濃度に調整します。プラスチック製のパラフィンフィルムの表面に5μ l のMetarhizium Blastospores (図 3) の懸濁液をアリコートを加えます。
注: Metarhizium blastospores 懸濁液は、·ノイバウアーのチャンバを使用して調整しました。接種プロセスを迅速化するために、複数の気泡をプラスチック製のパラフィンフィルム表面に添加することができ、各気泡は5μ l に対応する。 - 1 mL の超微細なインスリン注射器と 0.3 mm 針を使用して、懸濁液を引っ張り、ダニに接種します。シリンジを使用する前に、必ずすべての空気を取り出してください。
- 恒星と capitulum の間のダニメスに5μ l の真菌懸濁液を接種する。真菌なしの 0.1% ポリオキシエチレンソルビタン monooleate 水溶液 (v/v) の5μ l の対照群から雌を接種する。
注: 針を挿入した後、円孔開に少量の hemolymph が存在することがあります。空気を接種しないように注意してください。
3. 脚の大腿とダニの女性の体の間の entomopathogenic 菌類の接種
- ソウルとメスのボディの間に真菌懸濁液 (5 μ l、1.0 x 107 blastospores mL-1) で雌を接種し、0.3 mm 針に結合した 1 mL の超微細なインスリンシリンジを用いた。5μ l の 0.1% ポリオキシエチレンソルビタン monooleate 水溶液 (v/v) で対照群から雌を接種する。
注: 脚ソウルとダニメスの体との間にMetarhizium blastospores 接種が行われると、針挿入後のソウルに少量の hemolymph が存在する可能性があります。空気を接種しないように注意してください。
4. 背 hemolymph コレクション
- Hemolymph のコレクションを実行するために、翼のある輸液セットのゴム部分、0.3 mm の毛管管、およびろ過された先端を使用してください。
- 0.3 mm の針を使用して女性の背部キューティクルを混乱させる。
- 破砕後、ダニ本体の前部に緩やかな圧力をかけます。破壊部位からのほぼ透明な液体の引き抜きを観察します。Hemolymph は、翼を持つ輸液セットのゴム部分に結合されたフィルター先端を通って液体を吸引することによって、および 0.3 mm の毛管管を集める。
注: これは midgut を破壊し、hemolymph を汚染する可能性があるため、その固定化中にダニの体を押さないでください。穏やかな圧力が汚染なしで液体を追い出すことができるまで待って下さい。
5. ティックレッグからの Hemolymph コレクション
- 目盛りを固定し、1足のはさみで前脚の部分を切り取ります。
注: 1 つまたは複数の脚を切断することができ、同様に、同じ脚を複数回カットすることができます。 - ダニの後部の体の部分に穏やかな圧力を適用します。.ステップ4.3 で説明されているように、切断部位に現れ、毛管管でそれを集める透明な液体の泡を観察してください。
注: これは midgut を破壊し、hemolymph を汚染する可能性があるため、その固定化中にダニの体を押さないでください。穏やかな圧力が汚染なしで液体を追い出すことができるまで待って下さい。
6. Hemolymph 処理
- Hemolymph の収集後、30μ l のプロテアーゼカクテルと82μ l の生理食塩水を充填した 1.5 mL 試験管にそれを堆積させる。Hemolymph コレクション全体を通して氷の上に試験管を保ちます。
- サンプルを遠心分離します (4 ° c で3分間 500 x g )。Hemocytes の柔らかいペレットは hemolymph 遠心分離後に形成されます。
注: hemolymph 定量については、混和内部の総体積を計数し、プロテアーゼのカクテル量と生理食塩水バッファーの体積を割り引いて得られた hemolymph 量を定量化します。 - 慎重に上澄みを取り除きます (無細胞 hemolymph)。細胞を優しく再懸濁、例えば・リーボヴィッツの L-15 培養液を pH 7.0 ~ 7.2 に調整した。再懸濁 hemocytes を·ノイバウアーチャンバ内に10μ l 入れることによって hemocytes を定量する。
7. Hemocyte サンプリングスライドの準備
- ダニの前脚をはさみで切ります。
- ダニの後部の体の部分に穏やかな圧力を適用します。.切断部位に現れる透明な液体の泡を観察してください。
- Hemolymph 滴を清潔な顕微鏡スライドに直接塗布し、その後、細胞を染色するために充当された方法を使用します。
- ギムザを使用して hemocytes を染色するには、スライド上の hemolymph を30分間乾燥させ、室温で3分間メタノールで固定し、室温で30分間ギムザ溶液 (ソレンセンの緩衝液、pH 7.2 の1:9 の比率) で染色します。スライドを流水で洗い、染料の過剰分を除去し、スライドを空気乾燥させ、光学顕微鏡で400x で細胞を評価する。
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Representative Results
本稿はティックに適用された接種と hemolymph の収集方法にアプローチします。脚の大腿とダニの女性の身体の間の接種の後、いくつかの体液 (hemolymph) がプロセス中に分泌される。しかし、接種が終了すると、針の先端または接種部位に液体や組織が存在しなかったため、真菌懸濁液が完全に接種されたことを確認することが重要です。接種プロセスが正しく行われたとき、針の挿入はダニのメスの死を引き起こさなかった。一方、entomopathogenic 菌の接種後、ダニは約 48 h で死亡した。脚の大腿部とダニの女性の体の間の接種は、midgut やマルピーギ尿細管などのダニのインターンの器官に損傷を与えることができます, 遺伝子の器官への損傷は、恒星と capitulum の間の接種中に発生する可能性があります.
ダニ midgut が背 hemolymph 収集時に針によって破壊されると、得られる流体は赤色であり、無色ではない。これは、誤った hemolymph コレクションを示します。これらの場合において、hemolymph は腸内含有量で汚染されているため廃棄されなければならない。
正しい hemolymph コレクションは、実験を適切に行い、信頼性の高い結果を得るために重要です。切断された hemolymph から採取したとき (n = 20 ティック homogenously 秤量)、得られた体積は、背部コレクションから得られる総 hemolymph (n = 20 ティック homogenously 計量) よりも低かった (図 4)。これは、切断された脚から引き出す各滴の少量のために、hemolymph 凝固は、hemolymph 収集のこのプロセスの間に頻繁に存在することが示唆される。これは、hemocytes の取得と分類に悪影響を及ぼす可能性があります (図 5および図 6)。Hemolymph のより高い容積の達成にもかかわらず、背部コレクションは実行されることより困難であると考えられる。
図 1: ティック 'キューティクル hygienization。Rhipicephalus microplus完全うっ積メスを水道水で洗浄し、0.5% の次亜塩素酸ナトリウム溶液 (v/v) を 500 mL ガラスビーカーに3分間浸漬した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ティック 'キューティクル乾燥。Rhipicephalus microplus完全にうっ積メスは、滅菌紙タオルを用いて乾燥させた。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:Metarhiziumblastosporesダニ接種に使用される真菌 propaluges。スケールバー = 50 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 各 collecton 法で得られた hemolymph 体積を示す代表的なグラフ。背部または足のコレクションの後で得られるRhipicephalus microplus hemolymph の容積。各方法には、20 homogenously 計量されたティックのプールを使用しました。これらのティックは以前に接種されませんでした。同じ文字について続く平均値±標準偏差は、分散分析 (ANOVA) 検定(P ≥ 0.05) の後に統計学的に異なるものではない。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 各 hemolymph 収集法で得られた Hemocytes 濃度。背部または脚のコレクションの後の・リーボヴィッツの L-15 培地で再懸濁後に得られたRhipicephalus microplus hemocytes 濃度。同じ文字に対する平均値±標準偏差は、クルスカイ・ウォリス検定(P ≥ 0.05) の後で統計的に異なるわけではありません。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:で発見さ HemocytesRhipicephalus microplushemolymph スミアR. microplus hemocytes は、ギムザによって染色された。黒い矢印は、ティック hemolymph 内の異なるセルを示します。スケールバー = 100 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
病原体が宿主の内部にあることを保証するので、研究が実験節足動物モデルにおける微生物の生体内作用を調査することを目的とする場合に、病原菌の接種が有用である。この技術はまた、RNA 干渉 (RNAi) などの接種分子にも適用することができる。恒星と capitulum の間の接種は、実行が容易であると考えられるが、しばしば臓器 Gené's 損傷を与えるが、卵の生存率12,13を損なう。Gené's 器官は capitum の前部の近くに解剖学的に位置しており、ダニ産卵14にとって重要な器官である。したがって、Gené's 器官が負傷しないので、研究が女性の生物学的パラメータの観察を必要とするならば、脚ソウルと女性の身体の間の接種はより適切です。脚の大腿部とダニの体との間の接種方法はより困難であると考えられているにもかかわらず、midgut およびマルピーギ尿細管のようなダニ内部器官を容易に損傷または暴露させるが、よく行われると、これらの器官を破壊しないであろう。
Hemolymph 分析は、病因15、16を理解するだけでなく、節足動物免疫系を理解するために不可欠です。したがってダニ hemolymph は、ダニ生理学を発表するために使用することができます, ダニの感染性を確保, ダニ・病原体相互作用を理解します, 細胞および体液性免疫応答9,17,18.
足切断を介してダニ hemolymph コレクションは、いくつかの研究19,20,21で報告されています。この方法は、hemolymph 汚染のないまたは非常に低いので簡単であるにもかかわらず、高濃度の hemocytes または大量の hemolymph を必要とする研究にとっては非生産的であると考えられる。一方、うっ積雌の背領域を介した hemolymph 収集の正しい実行は、腸がほぼティック本体を占有し、針で破裂するので hemolymph 汚染を引き起こすため、達成するのは容易ではありません。ダニが自然に hemoparasites (すなわち、バベシア属の spp) の高負荷に感染している場合、または entomopathogens8によって引き起こされる死過程の最終段階において、腸の破壊による汚染も観察することができる。これらの場合には、hemocytes および血漿分析が影響を受ける可能性があるため、hemolymph は廃棄されなければならない。
Hemocytes 収穫用の hemolymph サンプルの遠心分離速度も重要であり、hemocytes 濃度に直接影響を与え、高相対遠心磁界 (RCF) 速度は以下に寄与するため、i) 細胞ペレットを再懸濁、ii) 細胞中断、iii) hemocytes 脱顆粒。理想的な細胞ペレットは、再懸濁しやすい柔らかいペレットです。このため、4° c8で3分間 500 x gで遠心分離を用いた。本研究では、培養培地がより良好な細胞生存率をサポートしているため、hemocytes を培養培地に再懸濁し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ではない。
ここに提示された方法は、ダニや unfed 大人の immatures のステージ (幼虫とニンフ) に適用する場合の制限に直面する可能性があります。例えば、接種方法は、針のサイズが未熟な段階を損傷し、おそらく成人ダニを unfed するので、成人うっ積の女性にのみ適用される。これらの段階を接種するために、microinjector を使用しなければならない。同様に、背部領域を介した hemolymph 収集は、うっ積ダニに適用した場合により効果的であり、脚部を切断することによって hemolymph 収集は unfed 成人ダニまたは未熟段階の研究に使用することができる。それにもかかわらず、ここでの私たちの目標は、非常に低い技術リソースを必要とする方法を示すことでした。加えて、遠心分離技術は、高い力または延長されたスピン時間が細胞に損傷を与える可能性があるため、低遠心分離力で実行される必要がある。
ここに開示された方法は、entomopathogens の接種および hemolymph/hemocytes 採取に関する研究のためのガイドラインとして使用することができる。ここで提示される技術は、非常に低い技術資源を必要とし、ダニの生理学、病理学、およびダニの免疫応答についての研究のための古典的なステップである。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この研究は、ブラジル、金融コード001から Coordenacão ・デ・ Aperfeiçoamento ・デ・ Pessoal ・デ・ Nível ・スーペリア (ケープ) によって部分的に資金を調達しました。ケープは A.F. マルシアノ愛用のための博士奨学金を提供しました。我々は、j. Fiorotti のための博士課程奨学金を提供するブラジルの科学技術開発協議会 (CNPq) に感謝した。この研究は、カルロス・シャーガスフィーリョ国際財団のリオデジャネイロ州 (FAPERJ) および CNPq V.R.E.P. の研究助成金によっても支援されました。ビッテンコートは CNPq の研究者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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