Summary
对滴虫血淋巴的分析是一个重要的信息来源, 说明一些病原体是如何引起疾病的, 以及滴答声对这种感染的免疫反应。本研究旨在说明如何接种真菌繁殖和从根茎微加高的雌性中采集血淋巴。
Abstract
滴答声是强制的血食性外寄生虫和犀牛微加子在兽医学中具有重要意义, 因为它导致贫血, 体重减轻, 动物的皮革贬值, 也可以作为几种病原体的载体。由于控制这些寄生虫的费用过高, 不当使用化学杀菌剂对环境造成损害, 以及对传统寄生虫的抵抗力增加, 对滴答声的替代控制, 使用昆虫病原真菌, 例如, 已被认为是一个有趣的方法。然而, 很少有研究表明, 滴答声的免疫系统是如何对抗这些致癌物质的。因此, 该协议演示了两种用于昆虫病原体接种充血的女性和两种技术用于血淋巴收集和血细胞采集。在腿部插入的病原体接种在雌性的身体允许评估女性的生物参数, 不像在阴囊和头状花序之间的接种, 这经常损害 Gené的器官。多侧血淋巴收集产生了更高的体积恢复比收集通过腿。滴虫血淋巴收集和处理的一些局限性包括: (i) 血细胞破坏率高; (二) 血淋巴污染与中肠紊乱; (三) 低血淋巴体积恢复。当血淋巴通过腿部切割收集时, 血淋巴在腿部开口处积累需要时间, 有利于凝血过程。此外, 与背侧收集相比, 通过腿部收集的血细胞较少, 尽管第一种方法被认为更容易实施。了解昆虫病原剂介导的滴答声中的免疫反应有助于揭示其发病机制, 并为滴答声控制制定新的目标。这里描述的接种过程需要非常低的技术资源, 不仅可以用来暴露在病原微生物面前的滴答声。同样, 血淋巴的收集可能是许多生理研究的第一步。
Introduction
牛是一种对热带地区牲畜有巨大负面影响的对牲畜产生了巨大的负面影响。这种滴答药是病原体的载体, 如巴贝西亚牛、巴贝西亚大代米纳和阿纳苏拉西翁, 再加上直接的血液喂养损伤, 可以减少牛奶和肉类的生产, 导致贫血, 并最终导致死亡。据估计, 这种外生寄生虫每年造成的损失为32.4亿美元.需要可持续的方法, 昆虫病原剂的使用被认为是减少使用化学杀菌剂2,3,4的一个有希望的替代品。
昆虫病原真菌, 如巨细胞病, 是节肢动物的天敌, 包括滴虫, 一些分离物可用作生物控制器。这些病原体通过角质层主动感染宿主, 并对它们的身体进行2,5,6的殖民。随着感染的发展, 细胞和体液反应是由滴虫免疫系统介导的。据报道, 在对病原体 7,8 具有挑战性的情况下, 对滴虫血淋巴的分析是评估免疫反应的有用工具.
关节的免疫反应分为体液和细胞反应。体液反应涉及血凝过程和抗菌蛋白肽的产生, 而细胞免疫反应是通过血细胞进行的。这些细胞存在于所有节肢动物的血淋巴中, 据报道, 它们在涉及先天免疫反应的研究中发展出表达作用, 因为它与吞噬和包封过程直接相关。因此, 对血细胞的研究有助于研究死亡途径和了解自体吞噬、凋亡和坏死等过程。在一些无脊椎动物作为双壳体, 血细胞的收集面临的限制, 如细胞破坏, 低血淋巴体积获得, 低浓度的恢复细胞10.根据所采用的方法, 通常会降低细胞浓度, 直接影响细胞的定量和分析。
血淋巴中循环的血细胞数量在不同节肢动物之间是可变的, 由于性别、年龄和节肢动物发育阶段11等生理阶段不同, 同一物种的血细胞数量可能发生变化。血细胞也可以被发现粘附在一些器官上, 并在感染过程1 1 后立即释放到循环中。然而, 大多数研究报告使用昆虫, 而滴答声仍然较少探索有关他们的生理和病理。尽管病原体接种和血淋巴收集在滴答声是较少使用的技术, 建立标准的方法有助于发展更准确的研究。
本研究的目的是比较最常用的血淋巴收集方法, 并将病原体接种成r. 微 + 滴答声, 评价血淋巴采集和血细胞浓度的有效性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究中使用的滴答声来自里约热内卢联邦农村大学的一个人工群体, 这些方法已得到使用脊椎动物伦理委员会 (CEUA-IV任何 #037) 的批准。
1. 被打勾的女性
- 在滴度收集后, 用自来水清洗被吞没的雌性, 并将它们浸泡在 0.5% (v/v) 次氯酸钠溶液中 3分钟, 在500毫升玻璃烧杯接受者中保持 3分钟, 以保持角质层卫生 (图 1), 然后用无菌纸巾将所有雌性水浸泡 (图2)。
- 将雌性分成均匀加权组 (每个有20名女性): 一组没有任何处理, 一个对照组接种 5μl 0.1% 聚氧乙烯基单油酸盐水溶液 (v/v), 一个感染组接种 5μl, 1.0 x 107囊胚 ml-1.
注: 只有未经处理的滴答声才用于体积和血细胞浓度。对每个组进行了三次复制。
2. 阴囊和头状花序之间的病原体接种
注: 在本研究中, 昆虫病原真菌悬浮液被用作一个例子。
- 怀疑真菌囊胚在1毫升的0.1% 聚氧乙烯基山梨酸水溶液 (v/v), 并调整到最后浓度 1.0 x 10 7 囊胚 ml-1.在塑料石蜡膜表面加入 5Μl metarhizium 囊胚 (图 3) 悬浮液。
注:利用Neubauer 的腔体调整了金属化组织囊胚悬浮液.为了加快接种过程, 可以在塑料石蜡薄膜表面添加多个气泡, 每个气泡对应5Μl。 - 使用1毫升超细胰岛素注射器和0.3 毫米针将悬浮液拉入滴答声中。在使用注射器之前, 记得把所有的空气都取出来。
- 在阴囊和头状花序之间的滴虫中培养5Μl 真菌悬浮液。对照组的接种女性, 含有 5μl 0.1% 聚氧乙烯基山梨醇单油酸水溶液 (v/v), 无真菌。
注: 针插入后, 孔上可能会出现少量的血淋巴。注意不要给空气接种疫苗。
3. 腿大腿与虫女性身体之间昆虫病原真菌的接种
- 接种女性与真菌悬浮液 (5μl 在 1.0 x 10 x10 7 囊胚 ml-1) 之间的腿 tigh 和女性的身体, 使用1毫升超细胰岛素注射器结合到0.3 毫米针。从对照组中接种女性, 用 5μl 0.1% 聚氧乙烯基山梨醇单油酸水溶液 (v/v)。
注: 当在腿部和雌性的身体之间进行Metarhizium囊虫接种时, 插入针头后, 可在 tigh 上出现少量的血淋巴。注意不要给空气接种疫苗。
4. 背侧血淋巴收集
- 使用有翅膀的输液装置的橡胶部分, 0.3 毫米毛细管, 和过滤尖端进行血淋巴收集。
- 用0.3 毫米的针破坏女性背性角质层。
- 中断后, 对滴答声体的前部施加温和的压力。观察从破坏现场抽出的几乎透明的液体。通过将液体通过与有翅输液装置的橡胶部分和 0.3 mm 毛细管耦合的滤嘴吸走液体来收集血淋巴。
注: 不要按滴答声的身体在其固定过程中, 因为这可能会破坏中肠和污染血淋巴。等待, 直到温和的压力可以排出液体, 而不会受到污染。
5. 从腿收集血淋巴
- 固定滴答声, 用剪刀剪下一条前腿。
注: 一个或多个腿可以被切割, 以及, 同一条腿可以被削减一次以上。 - 对滴答声的后部身体部分施加温和的压力。观察一个透明的液体气泡, 该气泡出现在切割部位, 并将其与毛细管一起收集, 如步骤4.3 所述。
注: 不要按滴答声的身体在其固定过程中, 因为这可能会破坏中肠和污染血淋巴。等待, 直到温和的压力可以排出液体, 而不会受到污染。
6. 血淋巴加工
- 血淋巴采集后, 将其存放在 1.5 mL 微管中, 这些微管中含有30μl 蛋白酶鸡尾酒和82μl 盐水缓冲液。在整个血淋巴收集过程中, 将微管放在冰上。
- 离心机样品 (在 4°C 下, 每次 500xg 3分钟)。血淋巴离心后形成血细胞软颗粒。
注: 对于血淋巴定量, 通过计算微管内的总体积并扣除蛋白酶鸡尾酒和盐水缓冲液的体积来量化所获得的血淋巴体积。 - 小心去除上清液 (无细胞血淋巴)。轻轻地重新悬浮细胞, 例如, 莱博维茨的 L-15 培养调整为 pH 7.0-7.2。通过将10μl 的再悬浮血细胞放置在 Neubauer 腔中, 对血细胞进行定量。
7. 血细胞取样幻灯片的制备
- 用剪刀剪断滴答声的前腿。
- 对滴答声的后部身体部分施加温和的压力。观察在切割部位显示的透明液体气泡。
- 将血淋巴滴直接涂在干净的显微镜幻灯片上, 然后用适当的方法对细胞进行染色。
- 用 Giemsa 染色血细胞, 在滑块上风干 30分钟, 用甲醇在室温下固定 3分钟, 在 Giemsa 溶液中染色 30分钟, 在室温下染色 30分钟 (索伦森缓冲液的1:9 比, pH 7.2)。用自来水清洗幻灯片, 去除多余的染料, 风干滑块, 并在光学显微镜下评估400x 的细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本文探讨了接种和血淋巴收集方法应用于滴答声。在大腿和女性身体之间接种后, 在此过程中可以分泌一些液体 (血淋巴);但是, 需要注意的是, 当接种完成后, 针尖或接种部位不存在液体或组织, 以确保真菌悬浮液被完全接种。当接种过程正确进行时, 针头插入不会导致滴虫雌性死亡。另一方面, 滴答声在接种昆虫病原真菌约48小时后死亡。大腿与滴虫女性身体之间的接种会损害中肠、马尔皮吉安小管等滴答声实习器官, 而在阴囊和头状结肠之间的接种过程中, 会对基因器官造成损害。
当在背侧血淋巴收集过程中, 滴虫中肠被针头破坏时, 获得的液体是红色的, 而不是无色的。这表示不正确的血淋巴收集。在这种情况下, 由于血淋巴受到肠道内容的污染, 因此应丢弃。
正确的血淋巴收集是正确进行实验和获得可靠结果的关键。当从切割的滴答腿 (n = 20个滴答声均匀称重) 中收集血淋巴时, 获得的体积低于从背侧收集中获得的总血淋巴 (n = 20个滴答声均质称重) (图 4)。建议在血淋巴采集过程中, 由于从割腿中取出的每一滴滴量较低, 血淋巴凝血可以经常出现。这可能会对血细胞的获取和分类产生负面干扰 (图 5和图 6)。尽管血淋巴的体积成就较高, 但背侧收集被认为更难进行。
图 1: 滴答声 "角质层的生。用自来水清洗了半氯化银子, 并将0.5% 次氯酸钠溶液 (v/v) 浸入500毫升玻璃烧杯接受者中3分钟。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 滴答声 "角质层干燥。用无菌纸巾干燥完全充血的雌性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: Metarhizium囊胚.用于滴虫接种的真菌螺旋桨。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 用每一种收集方法获得的显示血淋巴体积的代表性图。背侧或腿部采集后获得的微血淋巴体积。每种方法都使用了20个均匀称重的刻度池。这些滴答声以前没有接种。在方差分析 (ANOVA) 测试 (p≥0.05) 后, 同一字母所遵循的平均值±标准偏差没有统计学差异。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 血细胞浓度是用每一种血淋巴收集方法获得的。在莱博维茨的 L-15 培养基中, 背侧或腿部采集后, 再悬浮后获得的红杉微血细胞浓度。在 Kruskal-Wallis 测试 (p≥0.05) 之后, 同一字母遵循的平均值±标准偏差没有统计学差异。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 血细胞发现雷皮卡鲁斯微 +血淋巴涂片.吉姆萨对 r . 微血管细胞进行了染色。黑色箭头表示滴答血淋巴中的不同细胞。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
当这项研究旨在研究微生物在实验节肢动物模型中的体内作用时, 病原体的接种是有用的, 因为它确保病原体在宿主体内。该技术也可用于接种 RNA 干扰 (RNAi) 等分子。在阴囊和头状花序之间的接种被认为更容易执行, 但经常损害吉内的器官, 损害鸡蛋的生存能力 12,13。Gené的器官在解剖上靠近头盖骨的前部, 它是病毒14的重要器官.因此, 如果研究需要观察女性的生物参数, 那么在腿部和女性身体之间接种疫苗更为合适, 因为吉内的器官不会受到伤害。尽管腿大腿和身体之间的接种方法被认为更困难, 更容易损坏或暴露的内脏, 如中肠和马尔皮根小管, 当它表现良好时, 它不会破坏这些器官。
血液淋巴分析对于了解节肢动物免疫系统以及了解其发病机制15、16 至关重要。因此, 滴虫血淋巴可用于揭示滴虫生理, 确保滴虫的传染性, 了解滴答菌的相互作用, 以及细胞和体液免疫反应9,17,18。
在 19、20、21的几项研究中, 通过腿部切割来收集血淋巴。尽管这种方法很简单, 没有或很低的血淋巴污染, 但对于需要高浓度血细胞或大量血淋巴的研究, 它被认为是反生产的。另一方面, 通过被吞没的女性背侧区域正确执行血淋巴收集并不容易, 因为肠道几乎占据了整个体, 并与针头破裂, 导致血淋巴污染。当滴虫自然感染高负荷的血鱼 (即巴贝西亚), 或在昆虫病原引起的死亡过程的最后阶段, 也可以观察到肠道破裂引起的污染 8.在这些情况下, 血淋巴应丢弃, 因为血细胞和血浆分析可能会受到影响。
血淋巴样本的离心速度对于血细胞的采集也很重要, 直接影响血细胞的浓度, 因为相对离心场 (RCF) 的高速度有助于: i) 细胞颗粒难以重新悬浮, ii) 细胞和 iii) 血细胞去粒化。理想的细胞颗粒是一种易于重新悬浮的软颗粒。为此, 在 4°c8下, 以 500 x g的速度进行3分钟的离心。在本研究中, 血细胞在培养基中重新悬浮, 而不是在磷酸盐缓冲的盐水 (PBS) 中, 因为培养基支持更好的细胞活力。
这里介绍的方法在应用于滴答声或无喂养的成年人的不成熟阶段 (幼虫和仙女) 时可能会面临限制。例如, 接种方法只适用于成人受伤的女性, 因为针头大小会损害不成熟的阶段, 并可能损害成人滴答声。为了接种这些阶段, 应使用微喷射器。同样, 通过背侧区域的血淋巴收集更有效, 当应用于充血的滴答声时, 而通过切割腿的血淋巴收集可用于未喂养的成人滴答声或不成熟阶段的研究。尽管如此, 我们在这里的目标是展示需要非常低的技术资源的方法。此外, 离心技术必须在低离心力下进行, 因为高力或延长自旋时间会损害细胞。
这里公开的方法可以作为研究的指导方针, 有关接种昆虫病原体到滴答声和血淋巴细胞收获。这里介绍的技术需要非常低的技术资源, 是关于滴答生理、病理和滴答声免疫反应研究的经典步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究的部分资金来自巴西的正是《财务法典》 001号, 由巴西的卫报公司资助。CAPES 为 a. f. Marciano 提供博士奖学金。我们感谢巴西国家科学和技术发展委员会为 J. Fiorotti 提供博士奖学金。这项研究还得到了 Carlos Chagas Filho 里约热内卢州研究基金会 (FAPERJ) 和 CNPq. v. r. e. p. Bittencourt 研究员的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
