Summary
Le protocole détaille un modèle in vitro de carcinome murine de l'allongement défectueux non génétique de transcription. Ici, l'inhibition chronique de CDK9 est employée pour réprimer l'allongement productif de l'ARN Pol II le long des gènes pro-inflammatoires de réponse pour imiter et étudier le phénomène cliniquement surdes tecertainement, présent dans environ 20% de tous les types de cancer.
Abstract
Nous avons précédemment rapporté qu'un sous-ensemble de cancers est défini par des déréglementations transcriptionnelles globales avec des insuffisances répandues dans l'allongement de transcription d'ARNm (TE)-nous appelons tels cancers comme TEcertainement. Notamment, les cancers de TE sontcertainement caractérisés par la transcription fausse et le traitement défectueux d'ARNm dans un grand ensemble de gènes, tels que l'interféron/JAK/STAT et les voies de TNF/NF-B, menant à leur suppression. Lesous-type te des tumeurs dans le carcinome rénal de cellules et les patients métastatiques de mélanome sensiblement corrélés avec la réponse et les résultats pauvres dans l'immunothérapie. Compte tenu de l'importance d'étudier les cancers DE l'TE, car il laisse présager un obstacle important contre l'immunothérapie, l'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro TEdéfinitivement souris pour étudier ces répandues, non-génétique anomalies transcriptionnelles dans les cancers et d'acquérir de nouvelles idées, de nouvelles utilisations pour les médicaments existants, ou de trouver de nouvelles stratégies contre ces cancers. Nous détaillons l'utilisation de l'inhibition chronique de CDK9 de flavopiridol négociée pour abroger la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de la polymérase II d'ARN (RNA Pol II), supprimant la libération de l'ARN Pol II dans la transcription productive Allongement. Étant donné que les cancers TE ne sontcertainement pas classés sous une mutation somatique spécifique, un modèle pharmacologique est avantageux, et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. L'utilisation d'une dose sublétale optimisée de flavopiridol est la seule stratégie efficace dans la création d'un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l'allongement de la transcription et les défauts de traitement de l'ARNm, imitant étroitement l'ETe observé cliniquement certainement des caractéristiques. Par conséquent, ce modèle de TE peutcertainement être exploité pour disséquer, les facteurs cellulaires autonomes leur permettant de résister à l'attaque cellulaire à médiation immunitaire.
Introduction
Une étape de limitation de taux clé dans l'expression de presque tous les gènes actifs est la transition de la polymérase D'ARN II (ARN Pol II) de la pause promoteur-proximale à l'allongement productif1,2. Étant donné que la dysrégulation épigénétique de l'allongement transcriptionnel aide à la progression de multiples malignités humaines définies comme TEdéfinitivement, conduisant à la signalisation sous-optimale dans les voies de réponse pro-inflammatoires équivalant à une mauvaise réponse et les résultats à l'immunothérapie3, l'objectif global de ce protocole est d'établir un modèle in vitro utile pour étudier ces anomalies transcriptionnelles non génétiques répandues dans les cancers. Dans cette optique, l'utilisation de l'inhibition pharmacologique chronique du CDK9 est une stratégie efficace pour créer un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l'allongement de la transcription et les défauts de traitement de l'ARNm. La raison d'être de l'utilisation chronique de l'inhibition du CDK9 est qu'elle abroge la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de l'ARN Pol II, réprimant ainsi la libération de l'ARN Pol II dans l'allongement productif de transcription. En outre, TEcertainement cancers, décritprécédemments par notre groupe3,ne sont pas classifiés sous n'importe quelle mutation somatique spécifique. Par conséquent, un modèle non génétique (pharmacologique) est avantageux et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. La méthode ici détaille la génération et la caractérisation du modèle chronique de traitement de flavopiridol des cellules cancéreuses de murine. Cette méthode perturbe manifestement l'allongement de la transcription le long des gènes caractérisés par des longueurs génomiques plus longues, avec des promoteurs en équilibre et des expressions inductibles telles que le TNF/NF-B et la signalisation interféron/STAT, profondément contrôlée au niveau de transcription elongation3,4,5. Dans l'ensemble, ce modèle optimisé de ligne cellulaire murine des défauts d'allongement transcriptionnel-le seul modèle à notre connaissance pour étudier les tumeurs nouvellement décrites de TEcertainement-conduit la résistance à l'attaque immunitaire anti-tumorale, rendant un système utile pour exploiter et examiner les vulnérabilités des défauts non génétiques dans les machines de transcription de base dans les cancers vis-à-vis de l'attaque cellulaire à médiation immunitaire.
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Protocol
Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et le Comité institutionnel de biosécurité de la Cincinnati Children's Research Foundation ont approuvé toutes les procédures expérimentales pour animaux (protocole de l'IACUC #2017-0061 et protocole du BAC #IBC2016-0016), et ces des expériences ont été menées conformément aux normes décrites dans le Guide des NIH sur les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Inhibition chronique de l'ARN Pol II par traitement flavopiridol—stratégie de base
- Cellules de mélanome de souris de graine B16/F10 dans la basse densité (0.2 x 106) dans une plaque de culture de 10 cm dans leur milieu correspondant (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10% sérum bovin foetal [FBS], 1% pénicilline et streptomycine [Pen/Strep]) et incuber du jour au lendemain dans un incubateur humidifié co2 de 37 oC, 5 %.
- Le lendemain, lavez les cellules avec de la saline tamponnée par phosphate 1x (PBS) et ajoutez un nouveau lot de milieux de culture avec une dose sublétale (estimée à 25 nM) de flavopiridol, un inhibiteur du facteur d'allongement de l'ARN Pol II p-TEFb (cyclin T/CDK9) pendant une semaine sans plus de sous-creturing.
- Après une semaine de traitement flavopiridol, effectuer des essais de confirmation pour évaluer la capacité du modèle à récapituler divers attributs des défauts d'allongement transcriptionnel vu dans les cancers TEcertainement.
2. Analyse immunoblot confirmatoire pour évaluer la fonction défectueuse de Pol II d'ARN et l'affaiblissement de la voie d'interféron (IFN) et de la signalisation de voie de nécrose de tumeur (TNF) de dans le modèle produit de TE de sourisdéfinissant
- Nombre égal de culture (105) de flavopiridol traité B16/F10 cellules de mélanome de souris et les cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans deux ensembles différents de 12 plaques de puits (un ensemble pour la caractérisation fonctionnelle de l'ARN Pol II et l'autre ensemble pour cytokine stimulation) à 37 oC dans un incubateur humidifié co2 de 5 % pendant la nuit.
- Le lendemain, traitez les cellules dans la stimulation cytokine fixée avec la souris IFN-, IFN-ML (5 ng/mL), ou TNF-ML (5 ng/mL) pendant 45 min à 37 oC.
- Maintenant, extraire la protéine des cellules dans les ensembles fonctionnels de caractérisation de cytokine et d'ARN Pol II utilisant un tampon d'analyse de lyse de radioimmunoprecipitation (RIPA) de la manière suivante :
- Laver les cellules avec 1x PBS et le lyser avec 50 l de la mémoire tampon de lyse par puits. Gratter, puis granuler les cellules lysées à 4 oC, 21 130 x g.
- Mesurer la protéine dans les supernatants de lysate cellulaire à l'aide d'un analyse colorimétrique standard pour la concentration de protéines après la solubilité du détergent (Bradford ou un résultat similaire).
- Chargez une quantité égale de protéines mesurées (15 g) de chaque échantillon pour qu'elles s'exécutent dans un gel de polyacrylamide de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) de 4 % à 18 %, et transférez-les sur des membranes de polyvinylidede difluorure (PVDF).
- Bloquer les membranes PVDF dans du lait sec à 5 % dans le tris tamponné saline-polysorbate 20 (TBST) pendant 1 h, suivie d'une incubation de nuit à 4 oC avec des anticorps primaires (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; total H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NF-B 1:1000; p-NF-B 1:1000; -Actin 1:5000) en 5% d'albumine de sérum bovin.
- Le lendemain, lavez les membranes PVDF avec 1x TBST pendant 15 min à température ambiante (RT), et incubez-les avec des anticorps secondaires appropriés (anti-rat [1:5000] pour l'ARN Pol II, p-SER2 RNA Pol II, et p-SER5 RNA Pol II; anti-lapin (1:5000) pour H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NF-B et p-NF-B) pendant 50 min à RT. Détectez les signaux protéiques à l'aide du substrat de peroxidase de raifort (HRP) disponible dans le commerce avec une chimiluminescence améliorée.
REMARQUE : L'utilisation primaire d'Actin est HRP-conjuguée, donc elle peut être développée sans secondaire.
3. Essai de confirmation pour évaluer les défauts de traitement de l'ARNm dans le modèle DE souris généréTE définitivement
- Nombre égal de graines (0,2 x 106) de cellules de mélanome de souris traitées par flavopiridol et de cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans des plaques de 6 puits à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Extraire l'ARN total des cellules cultivées à 60% de confluence à l'aide d'un réactif d'extraction d'ARN ou d'un kit (Tableau des matériaux).
- Épuisez l'ARN du total extrait de l'ARN de la manière suivante :
REMARQUE : Un protocole à faible entrée a été coopté à partir d'un kit disponible dans le commerce pour épuiser l'ARNr- Fixez un bain d'eau ou un bloc de chaleur à 70 à 75 oC, et un autre bain d'eau ou bloc de chaleur à 37 oC.
- Ajouter l'ARN total (100 à 500 ng dans 2 l d'eau sans nucléane) avec 1 l de sonde sélective d'épuisement de l'ARNr et 30 l de tampon d'hybridation dans un tube de microcentrifuge, mélanger doucement par vortex et les incuber à 70 à 75 oC pendant 5 min.
- Maintenant, transférez les tubes dans un bain d'eau/bloc de chaleur de 37 oC, et laissez l'échantillon refroidir à 37 oC sur une période de 30 min.
- Resuspendre les perles magnétiques sélectives de la sonde d'épuisement de rRNA par vortexing, et aliquot 75 l de perles dans un tube microcentrifuge sans RNase de 1,5 mL.
- Placez la suspension de perles sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Laissez les perles s'installer. Aspirez et jetez délicatement le supernatant. Répétez le lavage des perles une fois de plus en ajoutant 75 L d'eau sans nucléane et en jetant le supernatant après la séparation magnétique.
- Resuspendre les perles lavées dans 75 l de tampon d'hybridation, et aliquot 25 l à un autre tube et le maintenir à 37 oC pour une utilisation ultérieure.
- Placer les 50 perles restantes sur un séparateur magnétique pendant 1 min et jeter le supernatant. Resuspendre les perles dans 20 l de tampon d'hybridation et les maintenir à 37 oC pour une utilisation ultérieure.
- Après le refroidissement du mélange de sonde d'épuisement de l'ARN/arner sélectif à 37 oC pendant 30 min, brièvement centrifuger le tube pour recueillir l'échantillon au fond du tube.
- Transférer 33 L du mélange de sonde d'épuisement de l'ARN/ARN sélectif aux perles magnétiques préparées à partir de l'étape 3.3.7. Mélanger par un vortex à basse vitesse.
- Incuber le tube à 37 oC pendant 15 min. Pendant l'incubation, mélanger délicatement le contenu à l'occasion. Suivi d'une brève centrifugation pour prélever l'échantillon au fond du tube.
- Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min pour granuler le complexe de sonde d'ARNr. Cette fois, ne jetez pas le supernatant. Le supernatant contient de l'ARN appauvri par l'ARN.
- Placez le tube de 25 l de perles à partir de l'étape 3.3.6 sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Aspirate et jetez le supernatant. Ajoutez le supernatant de l'étape 3.3.11 au nouveau tube de perles. Mélanger par un vortex à basse vitesse.
- Incuber le tube à 37 oC pendant 15 min. Pendant l'incubation, mélanger délicatement le contenu à l'occasion. Brièvement centrifuger le tube pour recueillir l'échantillon au fond du tube.
- Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min pour granuler le complexe de sonde d'ARNr. Ne jetez pas le supernatant. Transférer le supernatant (environ 53 l) contenant de l'ARN appauvri par l'ARN dans un nouveau tube.
- Mesurer la concentration du rendement de l'ARN par un spectrophotomètre.
- Utilisez la moitié des échantillons appauvris par l'ARNre comme entrée dans les perles magnétiques contenant de l'oligo (dT)25 pour extraire l'ARN polyA de la manière suivante :
REMARQUE : Ce protocole d'isoler l'ARN de messager de queue de polyA utilisant des séquences de dT dT dtliés à la surface des perles magnétiques a été coopté à partir d'un kit disponible dans le commerce (tableau des matériaux).- Resuspendre les perles oligo dT dans le flacon en vortexant brièvement pour 'gt;30 s et transférer 200 'L de perles oligo dT à un tube. Ajouter le même volume (200 l) de tampon de liaison et suspendre à nouveau.
- Placer le tube dans un aimant pendant 1 min et jeter le supernatant. Maintenant, retirez le tube de l'aimant et suspendez à nouveau les perles oligo dT lavées dans 100 l'un de tampon de liaison.
- Ajuster le volume de l'échantillon total d'ARN appauvri par l'ARN à 100 l avec 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Maintenant, ajoutez 100 l de tampon de liaison.
- Chauffer jusqu'à 65 oC pendant 2 min pour perturber les structures secondaires de l'ARN. Maintenant, placez-le immédiatement sur la glace.
- Ajouter les 200 L d'ARN total aux 100 perles lavées de 100 L. Bien mélanger et laisser la fixation en tournant continuellement sur un rotor pendant 5 min à RT.
- Placez le tube sur l'aimant pendant 1-2 min et retirez soigneusement tout le supernatant et retirez soigneusement tout le supernatant.
- Retirer le tube de l'aimant et ajouter 200 l de tampon de lavage.
- Mesurer la pureté et la concentration de l'ARN polyAextrait par un spectrophotomètre.
REMARQUE : Un ratio de 260/280 de 1,90 à 2,00, et un rapport 260/230 de 2,00 à 2,20 pour tous les échantillons d'ARN sont jugés acceptables. - Utiliser la moitié restante des échantillons appauvris en ARNr de la section 3.3 comme entrée dans les colonnes de protéines A (fournies dans le kit d'immunoprécipitation de l'ARN [RIP], Tableau des matériaux) pour immunoprécipiter les ARN à cinq primes à l'aide d'un monoclonal 7-méthylguanosine anticorps de la manière suivante :
REMARQUE : Ce protocole d'isoler l'ARN de messager plafonné de m7G utilisant un kit d'immunoprécipitation d'ARN disponible dans le commerce a été coopté et davantage modifié.- Laver les perles magnétiques de protéines A obtenues à partir du kit RIP selon le protocole du fabricant pour pré-lier l'anticorps aux perles.
- Transférer 3 g d'anticorps 7-méthylguanosine (le lapin IgG fourni dans le kit peut être utilisé le contrôle négatif) aux perles dans un tube de microcentrifuge suspendu dans un tampon de lavage de 100 l du kit.
- Incuber avec une rotation à basse vitesse pendant 30 min à RT. Tubes Centrifuge brièvement, puis placer les tubes sur un séparateur magnétique, enlever et jeter le supernatant.
- Retirez brièvement les tubes et ajoutez 500 l de tampon de lavage du kit et vortex. Centrifuger les tubes brièvement suivi d'une séparation magnétique une fois de plus, enlever et jeter le supernatant.
- Répétez l'étape 3.6.4 une fois de plus.
- Ajoutez environ 120 ng de rRNA appauvri (de la section 3.3) aux perles liées à l'anticorps 7-méthylguanosine prélavées. Ajouter 1 l d'inhibiteur de la RNase. Incuber à RT pendant 1 h à 1,5 h avec une légère agitation.
- Faites tourner les perles à 300 x g pour 10 s et retirez le supernatant contenant l'ARNm non plafonné (non-7-méthylguanosine) à un nouveau tube de microcentrifugeur.
- Ajouter 100 l de tampon de lavage et laver deux fois de plus de la même façon. Mettre en commun le supernatant recueilli dans le même tube microcentrifuge étiqueté non plafonné (non-7-méthylguanosine) ARNm. Conserver sur la glace.
- Éluter l'ARNm plafonné (7-méthylguanosine) des perles avec 300 l de tampon de lyse d'urée (ULB) contenant 7 M d'urée, 2 % de SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA et 10 mM Tris, pH 7,5 en chauffant les perles à 65 oC pour 2 à 3 min.
- Mélanger 300 l d'échantillons élifiés (ARNm plafonné et non plafonné) avec 300 l de phénol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; disponible dans le commerce) (stocké à 4 oC). Bien mélanger en inversant et laisser reposer environ 10 min puis mélanger à nouveau délicatement.
- Centrifugeuse à 18 928 x g pendant 2 min et soigneusement pipette la couche supérieure au tube frais et jeter la couche inférieure.
- Ajouter 300 ll de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1; stocké à 4 oC) aux échantillons. Bien mélanger en inversant puis en centrifugeuse à 18 928 x g pendant 1 min. Soigneusement, pipette la couche supérieure à un tube frais et jeter la couche inférieure.
- Ajouter 300 oL de 2 porpanol et 30 l d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) à l'ARN plafonné et non plafonné. Inverser l'échantillon à quelques reprises et le mettre à -20 oC pendant 20 h.
- Maintenant, centrifuger les échantillons à 18 928 x g pendant 10 min à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 500 L d'éthanol à 70 %.
- Centrifugeuse à nouveau à 18 928 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez soigneusement le supernatant et séchez la pastille à RT pendant moins de 5 min. Resuspendre la pastille dans de l'eau sans nucléaris.
- Mesurer la pureté et la concentration du rendement de l'ARN à l'un spectrophotomètre. Le ratio 260/280 devrait être de l'ordre de 1,90 à 2,00, et le ratio 260/230 de l'ordre de 2,00 à 2,20 pour tous les échantillons d'ARN.
4. Essai de confirmation pour évaluer la réponse de la souris TEcertainement modèle à la mort cellulaire médiée FasL
- Nombre égal de graines (30 000 cellules) de cellules de mélanome de souris traitées par flavopiridol B16/F10 et cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans une plaque de culture de 96 puits dans leur milieu correspondant (DMEM), et incuber pendant la nuit dans un 37 oC, 5 % CO2 humidifié couveuse.
- Traiter les cellules dans une hotte de culture avec différentes concentrations de hson6FasL (0.1-1000 ng/mL) en présence de 10 'g/mL anti-His anticorps et incuber pendant 24 h à 37 oC, 5% CO2 incubateur humidifié.
- Enlever les cellules mortes en les lavant avec un tampon PBS 1x. Fixez les cellules attachées dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min à RT. Jetez le paraformaldéhyde de 4 % (pas besoin de se laver) et tachez-les avec une solution violette cristalline (20 % de méthanol, 0,5 % de violette cristalline en 1x PBS) pendant 30 min.
- Enlever l'excès de taches en rinçant doucement les assiettes dans l'eau du robinet. Gardez les assiettes à sécher à RT.
- Redissoudrez la violette cristalline en 100 oL de surfactant nonionique 1x dissous en 1x PBS, et mesurez la densité cellulaire en mesurant l'absorption à 570 nm dans un lecteur de microplaques.
5. Analyse exploratoire pour évaluer la réponse de la souris TEcertainement modèle à l'attaque cytotoxique spécifique d'antigène de cellule T
- Isolement et activation de l'attaque à cellule T cytotoxique OT-I CD8MD (CTL)
- Purifez les cellules CD8MD à partir de la rate des souris OT-I TCR Tg RAG-1MD par séparation des cellules magnétiques à l'aide d'un kit d'isolement cellulaire T CD8 de souris comme suit :
- Récoltez deux rates de deux souris OT-I TCR Tg RAG-1MD/MD dans des milieux COMPLETs de RPMI.
- Écraser les rates dans un filtre de 70 m conservé sur un tube de 50 ml rempli de 20 ml de RPMI, en utilisant le dos d'une seringue jusqu'à ce que seule la graisse reste dans le filtre.
- Centrifuger le flux à travers à 220 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
- Ajouter 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (RBC) à la granule de rate de l'étape de centrifugation précédente et pipette le mélange pendant 1 min.
- Neutraliser la solution en ajoutant jusqu'à 10 ml de RPMI.
- Centrifugeuse à 220 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le supernatant et le suspendre dans 10 ml de RPMI.
- Prenez un petit aliquot pour le comptage. Centrifuger le reste à 220 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Pour chaque million de cellules comptées, resuspendre le granule dans 1 ml de tampon de système de séparation magnétique disponible dans le commerce (tampon Mojo ou tampon similaire).
- Préparer un cocktail d'anticorps de volume 100 l pour chaque 1 ml de cellules granulées à l'étape 5.1.1.8. Le cocktail d'anticorps comprend : biotine anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR MD/MD et CD44.
- Ajouter ce cocktail aux cellules granulées de 1 ml et conserver sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter 100 l de perles magnétiques (streptavidine) à chaque 100 l du cocktail d'anticorps ajoutés aux cellules de rate à granulés resuspensionnés de 1 ml. Garder sur la glace pendant 15 min.
- Ajouter 7 mL de tampon de système de séparation magnétique disponible dans le commerce. Maintenant, aliquot environ 3 -4 ml du mélange à un tube frais. Bien mélanger et le fixer à l'aimant pendant 5 min.
- Décantlez le liquide (contient des cellules CD8MD) dans un tube frais sur la glace. Maintenant, aliquot les 3-4 ml restants de mélange de l'étape 5.1.1.12 au tube et le fixer à l'aimant pendant 5 min. Decant le liquide (deuxième lot de cellules CD8 'isolés) au même tube contenant le premier lot de cellules CD8 'conservés sur la glace.
- Seed aisté le fibroblaste adhérent APC-(MEC. Le B7. SigOVA) ligne pour exprimer une ovalbumine spécifique (OVA) dérivée, H-2Kb-restricted peptide epitope OVA257-264 (SIINFEKL), avec la molécule co-stimulatoire B7.1, à 75 000 cellules par puits dans des plaques de 24 puits, à 37 oC, 5% CO2ified incubateur humide.
REMARQUE : Le fibroblaste adhérent utilisé est un cadeau du laboratoire du Dr Edith Janssen au CCHMC. La ligne a été créée à l'origine dans le laboratoire du Dr Stephen P. Schoenberger à la Jolla Institute for Allergy and Immunology6. - Après 24 h, lavez la monocouche d'APC une fois avec le milieu modifié de Dulbecco (IMDM) modifié d'Iscove disponible dans le commerce avec le tampon HEPES, le pyruvate de sodium, la L-glutamine et le glucose élevé), et ajoutez 0,5 x 106 cellules naïves ot-I CD8MD (à partir de l'étape 5.1.1.13) dans 2 mL d'IMDM complété par 50 mM-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamine et HEPES et 10% FBS.
- Après 20 h, récoltez délicatement les cellules OT-I non adhérentes (en recueillant les supports dans le plat de culture avec des cellules OT-I flottantes et en pelletant les cellules à 191 x g pendant 2 min; comptez les cellules OT-I viables) et transférez-les pour la co-culture.
- Purifez les cellules CD8MD à partir de la rate des souris OT-I TCR Tg RAG-1MD par séparation des cellules magnétiques à l'aide d'un kit d'isolement cellulaire T CD8 de souris comme suit :
- Co-culture des cellules CD8MD avec des cellules B16/F10-OVA
- Seed OT-I-derived CD8 MD cellules à un rapport de 1:1 (300 000 cellules chacune) dans une co-culture avec B16/F10 (manquant d'ovalbumine antigène), B16/F10-OVA non traitée, et cellules B16/F10-OVA prétraitées avec flavopiridol (25 nM) pendant 1 semaine, dans des plats de 6 puits avec DME complet médias pendant 20 h à 37 oC dans un incubateur humidifié CO2 de 5 %.
- Après 20 h, retirez les cellules CD8D dérivées de l'OT-I (en recueillant les médias dans le plat de culture avec des cellules CD8 MD d'OT-I flottantes). Laver les cellules adhérentes B16/F10-OVA en 1x PBS.
- Trypsiniser les trois groupes de cellules B16/F10-OVA jointes dans 0,05% EDTA contenant de la trypsine pendant 5 min. Pellet les cellules trypsinisées à 191 x g pendant 5 min.
- Tainr les cellules B16/F10-OVA récoltées en les incubant dans du PBS froid (contenant 0,5 % de FBS et 0,05 % d'azide de sodium) avec un colorant de viabilité et des anticorps étiquetés pertinents (colorant de viabilité réparable e780, souris conjuguées AF647 CD8 et souris vBV421-conjuguées CD45 ).
- Analyser la viabilité des trois groupes de cellules B16/F10-OVA par cytométrie de flux.
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Representative Results
Ici, nous fournissons un schéma détaillé (Figure 1) pour établir un modèle TEdéfinitivement cellulaire obtenu par le traitement sous-étalon-léjon chronique (figure 2) avec flavopiridol à 25 nM. Dans la figure 3, sur 3 jours de traitement avec flavopiridol, B16 ova cellules montrent des caractéristiques partielles de TEcertainement, mais après une semaine de traitement, B16/F10 ova cellules montrent une perte profonde de phosphorylation à la position sérine 2 sur le CTD de l'ARN Pol II le long avec une diminution significative de H3K36me3-une modification d'histone impliquée dans la définition des limites d'exon et un inhibiteur des transcriptions cryptiques délabrées. En conséquence, TEcertainement modèle cellulaire montre des défauts critiques de traitement de l'ARNm avec des ratios manifestement augmentés de mRNAs mal plafonnés et non-poly-adenylated (Figure 4A, B). En outre, la répression spécifique des gènes clés de la voie de réponse inflammatoire et de la voie de mort cellulaire médiée par FasL est observée dans la figure 5 et la figure 6. La résistance imposée à l'interféron (IFN-MD, IFNMD) et à la phosphorylation stimulée par le TNF-MD de STAT1 et de NF-B, et la résistance à la mort cellulaire par le récepteur de la mort ligand FasL réduit considérablement la cytotoxicité d'une attaque de cellules immunitaires contrete Tumeurs. Ces techniques de confirmation sont conçues pour tester l'étendue de l'influence de la perturbation chronique de l'allongement de la transcription a sur un large éventail de gènes de stimulus-sensibles, et si une telle perturbation dans un modèle donné de ligne de cellules de souris est assez adéquate pour inciter une pénurie aigue de l'ARNm fonctionnel dans les gènes de signalisation de réponse inflammatoire, imitant les essentialités de base des cancers de TEcertainement médicalement. Basé sur notre étude du traitement de flavopiridol, la suppression de la phosphorylation au deuxième résidu de serine (pSER2) de l'ARN Pol II CTD est critique, car elle marque l'allongement de transcription. Une dose sublétale pour n'importe quelle lignée cellulaire de carcinome de souris donnée doit réaliser une réduction des niveaux de pSER2 en plus d'avoir un effet insignifiant sur le taux de croissance et la viabilité de la lignée cellulaire. Bien que nous assistions constamment à une réduction des niveaux de pSER2 et de H3K36me3 sur les traitements flavopiridol de 25 nM, cela ne garantit pas une répression des niveaux de pSTAT1 et de pNFB (sur les stimulations IFN- , IFNMD et TNF-MD, respectivement). Chaque lignée cellulaire de carcinome de souris est unique (B16/F10 ova ou CT26 cellules cultivées dans différents laboratoires sur une période de temps peuvent avoir des effets légèrement modifiés) et ils peuvent avoir soit JAK1 ou CCNT1 sauvant partiellement les effets de la flavopiridol en supprimant le gènes de voie de réponse inflammatoire. Dans de tels cas, la cinétique des niveaux de pSTAT1 et de pNF-B peut devoir être vérifiée à différents points de temps (5-70 min) pour comprendre la temporalité des effets médiévaires de flavopiridol et son sauvetage par JAK1 ou CCNT1. Par conséquent, JAK1 et/ou CCNT1 peuvent devoir être renversés pour établir ce modèle.
Une fois que le modèle flavopiridol est établi et caractérisé à l'aide des essais susmentionnés, nous fournissons un essai exploratoire pour tester si le modèle TEdéfinitivement cellulaire confère une résistance à l'attaque cytotoxique des lymphocytes T (CTL). Sur la base de notre protocole optimisé, flavopiridol a traité les cellules B16/F10 surexprimant de façon stable le gène OVA (B16 OVA) co-incubé avec les CTL activés (spécifiques pour l'épitope OVA257-264) ayant une toxicité sélective pour les cellules ova-exprimant (un cadeau du Dr. Le laboratoire de Stephen P. Schoenberger6) n'étaient pas sensibles à la lyse de tumeur OT-I CTL-négociée. Les cellules OVA B16/F10 (non prétraitées par flavopiridol) ont subi une mort cellulaire massive dans ce système, tandis que les cellules parentales B16/F10 ont survécu, car elles n'expriment pas d'antigène OVA (figure 7). Il est clair d'après les résultats de l'analyse exploratoire suggérée que la TE chronique induite par flavopiridol peutcertainement donner un moyen d'échapper à une attaque immunitaire antitumorale, même in vivo. Ceci peut être davantage testé dans les modèles de tumeur in vivo pour vérifier la propension des modèles de TEcertainement pour échapper aux réponses immunitaires innées et adaptatives d'anti-tumeur. Les traitements anti-asialo pourraient être employés pour réguler l'activité des cellules de NK in vivo dans les souris portant des tumeurs. En outre, la thérapie de point de contrôle immunitaire (anti-CTLA4 et anti-PD1) peut être administrée à TEcertainement tumeur portant des souris.
Dans la totalité, le TEdéfinitivement des essais confirmatoires avec l'essai exploratoire suggéré ensemble démontrer l'utilité d'intégrer ce modèle TEdéfinitivement cellulaire dans une foule d'autres conditions d'essai tumeur-immune. Ce modèle peut aider à analyser les détails moléculaires résultant de l'allongement transcriptionnel défectueux dans les cellules tumorales et leur réponse aux interactions cellulaires immunitaires.
Figure 1 : Représentation schématique du flux de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractéristiques de croissance cellulaire des cellules B16 OVA traitées de façon chronique par flavopiridol à faible dose : viabilité (mesurée par réactif de viabilité) des cellules témoins et traitées au flavopiridol B16 OVA à des jours indiqués après le traitement. Ce chiffre a été modifié à partir de Modur et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse confirmative pour évaluer le profil de l'ARN Pol II et de l'histone : Immunoblots de marques indiquées d'histone et d'ARN Pol II dans les cellules B16 OVA traitées avec le flavopiridol pendant 72 h ou 1 semaine. Ce chiffre a été modifié à partir de Modur et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Essai de confirmation pour évaluer les défauts graves dans le traitement de l'ARNm. Ratios de 5 -non plafonnéà à 5 'plafonné (A) et 3 'non-polyadenylated à 3 '-polyadenylated (B) concentrations d'ARNm après l'épuisement de rRNA dans les lignées cellulaires indiquées. Les barres d'erreur représentent l'écart type basé sur trois répliques techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse confirmative pour évaluer le profil de stimulation de la cytokine. Immunoblots de STAT1, pSTAT1, NF-B et p NF-B dans le contrôle et flavopiridol pré-traités B16 ova cellules stimulées avec IFN- , IFN ou TNF-min à (5 ng/mL). Ce chiffre a été modifié à partir de Modur et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Essai de confirmation pour évaluer la résistance à la mort cellulaire médiée par FasL in vitro. Contrôle et flavopiridol prétraités B16 OVA cellules traitées avec FasL pour 24 h de lecture mesurée par l'aspiration de viabilité. Ce chiffre a été modifié à partir de Modur et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Analyse exploratoire pour évaluer la résistance de l'TEmodèle définitivement à l'attaque à l'in vitro de cellules T cytotoxiques à restriction d'antigène. Gauche : schéma schéma diagrammatique de l'analyse exploratoire. Droite : viabilité relative des cellules B16/F10-OVA co-cultivées avec cD8 activée - CTLs (1:1 ratio) isolées des rates des souris OT-I. P: Welch t-testà deux échantillons. Ce chiffre a été modifié à partir de Modur et coll.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le contrôle de l'allongement de l'ARN Pol II est apparu comme un levier décisif pour réguler l'expression des gènes sensibles au stimulus au profit des cellules malignes5,7,8. Surmonter promoteur-proximal pause à l'allongement et la production d'ARNm ultérieure nécessite l'activité kinase de P-TEFb9,10,11. Notre modèle utilise le flavopiridol (25 nM), un inhibiteur de la kinase cDK9 essentielle à cyclin-dépendante, pour imiter les défauts observés pendant l'allongement de Pol II dans tecertainement cancers-un phénotype précédemment inconnu dans les cancers découverts par notre groupe précédemment3.
L'activité de kinase de CDK9 a longtemps été connue pour être essentielle pour la phosphorylation des résidus de sérine 2 dans le CTD de la grande sous-unité de Pol II. Critiquement, nous avons réussi à optimiser flavopiridol traité inhibition chronique de CDK9 (25 nM pendant 1 semaine) dans B16/F10 OVA de sorte que, en plus d'inhiber la phosphorylation CTD, 25 nM flavopiridol traitement pendant 1 semaine empêche correctement post-transcriptional modifications de l'ARNm d'une manière imprévue et abroge efficacement l'allongement productif p-TEFb-dépendant le long de longs gènes tels que les gènes de signalisation de réponse pro-inflammatoire, modifiant de manière significative leurs modèles d'expression à la fois à l'ARNm et protéines. Au meilleur de notre connaissance, il n'y a aucun autre modèle décrit dans la littérature qui réalise effectivement le même.
Ce modèle facile à établir et généralisable de TE peutcertainement être exploité pour disséquer, à la fois des modifications transcriptionnelles et épigénétiques permettant à TEdéfinitivement cancers de s'adapter à l'attaque cellulaire à médiation immunitaire. En outre, ce modèle murine conserve son TEcertainement-comme la réduction du total et phospho- RNA Pol II niveaux 21 jours après la libération de flavopiridol dans l'analyse de croissance in vivo3 (non mentionné dans le protocole ici), suggérant l'étendue de la stabilité de cette modèle non génétique pour d'autres expérimentations in vivo. Cependant, le soin doit être pris pour optimiser la dose sublétale exacte de flavopiridol pour d'autres lignes de murine (par exemple, environ 20 nM traitement de flavopiridol pendant 1 semaine est la dose sublétale pour la ligne de carcinome de murine MC38 ; non employé dans ce protocole), l'impact de la variation dans la cellule la densité de placage, les conditions de culture, et les conditions de stimulation de cytokine peuvent varier pour différentes lignes de murine. Le protocole décrit ici donne un cadre de base pour minimiser les variables connues pour être critiques pour la génération de TEcertainement-comme les caractéristiques par l'inhibition chronique CDK9. En outre, les lignées cellulaires de carcinome humain, telles que T47D et CAL51 ont été testées avec des traitements à court terme (3 jours) flavopiridol donnant lieu à des profils similaires TEcertainement-commel'ARN Pol II, indiquant l'utilité de l'inhibition chronique basée sur la flavopiridol de CDK9 médiation de transcription elongation dans la création de même modèle lignes humaines pour étudier TEcertainement.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été en partie soutenu par NCI (CA193549) et CCHMC Research Innovation Pilot Awards à Kakajan Komurov, et Department of Defense (BC150484) prix à Navneet Singh. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national du cancer ou le ministère de la Défense. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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