Summary
Protokollen detaljer en in vitro murine kreft modell av ikke-genetisk defekt transkripsjon forlengelse. Her, kronisk hemming av CDK9 brukes til å undertrykke produktive forlengelse av RNA Pol II langs Pro-inflammatorisk respons gener å etterligne og studere klinisk overserved TEdefinitivt fenomen, til stede i ca 20% av alle krefttyper.
Abstract
Vi har tidligere rapportert at en undergruppe av kreft er definert av global transcriptional deregulations med utbredt mangler i mRNA transkripsjon forlengelse (TE)-vi kaller slike kreftformer som TEdefinitivt. Spesielt, TEdefinitivt kreft er preget av falsk transkripsjon og feil mRNA behandling i et stort sett av gener, som INTERFERON/jak/stat og TNF/NF-KB trasé, fører til deres undertrykkelse. TEdefinitivt under type av svulster i renal celle kreft og metastatisk melanom pasienter signifikant relateres til dårlig respons og utfall i immunterapi. Gitt viktigheten av å undersøke TEdefinitivt kreft-som det portends en betydelig veisperring mot immunterapi-målet med denne protokollen er å etablere en in vitro tedefinitivt mus modell for å studere disse utbredt, ikke-genetiske transcriptional unormalt i kreft og få ny innsikt, romanen bruker for eksisterende rusmidler, eller finne nye strategier mot slike kreftformer. Vi detalj bruk av kroniske flavopiridol mediert CDK9 hemming til oppheve fosforylering av Serine 2 rester på C-terminal gjenta domenet (CTD) av RNA polymerase II (RNA Pol II), undertrykke utgivelsen av RNA Pol II i produktiv transkripsjon forlengelse. Gitt at TEdefinitivt kreft ikke er klassifisert under noen bestemt somatiske mutasjon, en farmakologisk modell er fordelaktig, og best etterligner den utbredte transcriptional og epigenetic defekter observert i dem. Bruken av en optimalisert subletale dose av flavopiridol er den eneste effektiv strategien for å skape en generaliserings modell av ikke-genetisk utbredt forstyrrelse i transkripsjon forlengelse og mRNA behandling defekter, nøye etterligne klinisk observert TE absolutt egenskaper. Derfor denne modellen av TEdefinitivt kan utnyttes til å analysere, celle-autonome faktorer som gjør dem i motstå uimottakelig-mediert celle angrep.
Introduction
En nøkkel rate-begrenser skritt i uttrykket av nesten alle aktive gener er overgangen av RNA polymerase II (RNA Pol II) fra promoter-proksimale pause til produktiv forlengelse1,2. Gitt at epigenetic feilregulering av transcriptional forlengelse bistår i utviklingen av flere menneskelige ondartet definert som TEdefinitivt, fører til suboptimal signalering i Pro-inflammatorisk respons trasé som beløper til en dårlig respons og utfallet til immunterapi3, det overordnede målet med denne protokollen er å etablere en nyttig in vitro-modell for å studere disse utbredte ikke-genetiske transcriptional unormalt i kreft. I dette lys, bruk av kronisk farmakologisk hemming av CDK9 er en effektiv strategi for å skape en generaliserings modell av ikke-genetisk utbredt avbrudd i transkripsjon forlengelse og mRNA behandling defekter. Begrunnelsen for å bruke kronisk CDK9 hemming er at det opphever fosforylering av Serine 2 rester på C-terminal gjenta domenet (CTD) av RNA Pol II, og dermed repressing utgivelsen av RNA Pol II i produktiv transkripsjon forlengelse. Også, TEdefinitivt kreftformer, beskrevet tidligere av vår gruppe3, er ikke klassifisert under noen bestemt somatiske mutasjon. Derfor, en ikke-genetisk (farmakologisk) modell er fordelaktig og best etterligner utbredt transcriptional og epigenetic defekter observert i dem. Metoden her detaljer generering og karakterisering av kronisk flavopiridol behandling modell av murine kreftceller. Denne metoden påviselig forstyrrer transkripsjon forlengelse langs gener preget av lengre genomisk lengder, med klar arrangører og induserbart uttrykk som TNF/NF-KB og interferon/STAT signalering, dypt kontrollert på nivå med transkripsjon forlengelse3,4,5. Samlet sett er dette optimalisert murine cellelinje modell av transcriptional forlengelse defekter-den eneste modellen til vår kunnskap til å studere den nylig beskrevne TEdefinitivt svulster-stasjoner motstand mot anti-tumor immun angrep, rendering et nyttig system for å utnytte og undersøke sårbarheter av ikke-genetiske defekter i kjernen transkripsjon maskiner i kreft Vis-à-vis immune-mediert celle angrep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institusjonelle Animal Care og bruk komité og institusjonelle biosafety Committee of the Cincinnati Children ' s Research Foundation godkjent alle dyr eksperimentelle prosedyrer (IACUC protokollen #2017-0061 og IBC-protokollen #IBC2016-0016), og disse eksperimenter ble utført i samsvar med standarder som beskrevet i NIH guide til Stell og bruk av Laboratoriedyr.
1. kronisk hemming av RNA Pol II ved flavopiridol behandling-grunnleggende strategi
- Seed b16/F10 mus melanom celler i lav tetthet (0,2 x 106) i en 10 cm kultur plate i tilsvarende medium (Dulbecco ' s modifisert Eagle medium [DMEM], 10% fosterets storfe serum [FBS], 1% penicillin og Streptomycin [pen/strep]) og ruge over natten i en 37 ° c, 5% CO2 fuktet inkubator.
- Etter dag, vask cellene med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og legge til en ny gruppe med kultur medier med en subletale dose (anslått til 25 nM) av flavopiridol-en hemmer av RNA Pol II forlengelse faktor p-TEFb (cyclin T/CDK9)-for en uke uten videre sub-dyrking.
- Etter en uke med flavopiridol behandling, utføre bekreftende analyser for å evaluere modellens evne til å recapitulate ulike attributter for transcriptional forlengelse defekter sett i TEdefinitivt kreft.
2. bekreftende immunoblot analysen for å vurdere defekte RNA Pol II funksjon og svekkelse av interferon (IFN) veien og tumor nekrose faktor (TNF) veien signalering av i den genererte musen TEdefinitivt modell
- Kultur like mange (105) av Flavopiridol behandlet b16/F10 mus melanom celler og foreldre b16/F10 mus melanom celler i to forskjellige sett med 12 brønn plater (ett sett for RNA Pol II funksjonell karakterisering og det andre settet for cytokin stimulering) ved 37 ° c i en 5% CO2 fuktet inkubator over natten.
- Neste dag, behandle cellene i cytokin stimulering satt med musen IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL), eller TNF-α (5 ng/mL) for 45 min ved 37 ° c.
- Nå kan du trekke ut proteiner fra celler i både cytokin og RNA Pol II-funksjonelle karakterisering ved hjelp av en radioimmunoprecipitation-analyse (RIPA) lyseringsbuffer på følgende måte:
- Vask celler med 1x PBS og lyse med 50 μL av lyseringsbuffer per brønn. Skrap, og deretter pellet de lysert cellene ved 4 ° c, 21 130 x g.
- Mål proteinet i celle lysat supernatanter ved hjelp av en standard fargemetrisk analyse for proteinkonsentrasjon etter vaskemiddel oppløseliggjøringen (Bradford eller en lignende analyse).
- Last like mye målt protein (15 μg) fra hver prøve til å kjøre i en 4% − 18% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) polyakrylamid gel, og overføre dem til Polyvinylidene polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner.
- Blokker PVDF-membraner i 5% tørr melk i Tris saltvann-polysorbat 20 (TBST) for 1 h, etterfulgt av en overnatting inkubasjons ved 4 ° c med primære antistoffer (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; Totalt H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-utgangen 1:5000) i 5% av storfe serum albumin.
- Etter dag, vask PVDF membraner med 1x TBST i 15 min ved romtemperatur (RT), og ruge dem med egnede sekundære antistoffer (anti-rotte [1:5000] for RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II, og p-SER5 RNA Pol II; anti-kanin (1:5000) for H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NFκB og p-NFκB) for 50 min ved RT. oppdage protein signaler ved hjelp kommersielt tilgjengelig pepperrot peroksidase (HRP) substrat med forbedret kjemiluminescens.
Merk: β-utgangen primære brukes er HRP-bøyd, derfor kan det utvikles uten en sekundær.
3. bekreftende analysen for å vurdere mRNA behandling defekter i den genererte musen TEdefinitivt modell
- Seed lik nummer (0,2 x 106) av Flavopiridol behandlet b16/F10 mus melanom celler og foreldre b16/F10 mus melanom celler i 6-brønn plater ved 37 ° c i en 5% co2 fuktet inkubator over natten.
- Pakk total RNA fra de dyrkede cellene ved 60% confluency ved hjelp av en RNA-ekstraksjon eller et sett (tabell med materialer).
- Tømme rRNA fra den totale utpakkede RNA-en på følgende måte:
Merk: en protokoll med lav inngang har blitt valgt ut fra et kommersielt tilgjengelig sett for å tømme rRNA- Sett ett vannbad eller varme blokk til 70 − 75 ° c, og et annet vannbad eller varme blokk ved 37 ° c.
- Tilsett total RNA (100 − 500 ng i 2 μL av nuklease vann) med 1 μL av selektiv rRNA og 30 μL av hybridisering buffer i et mikrosentrifugen rør, bland forsiktig ved å virvlingen og ruge dem ved 70 − 75 ° c i 5 minutter.
- Nå, overføre rørene til en 37 ° c vannbad/varme blokk, og la prøven avkjøles til 37 ° c over en periode på 30 min.
- Resuspend den selektive rRNA med virvlingen, og alikvot 75 μL av perler i et 1,5 mL RNase-fritt mikrosentrifugen rør.
- Plasser perle fjæringen på et magnetisk skilletegn i 1 min. la perlene bosette seg. Forsiktig aspirer og kast supernatanten. Gjenta vask av perlene igjen ved å tilsette 75 μL av nuklease vann og kaste supernatanten etter magnetisk separasjon.
- Resuspend de vasket perlene i 75 μL av hybridisering buffer, og alikvot 25 μL av den til et annet rør og vedlikeholde den ved 37 ° c for senere bruk.
- Plasser de resterende 50 μL-perlene på et magnetisk skilletegn i 1 min og kast supernatanten. Resuspend perlene i 20 μL av hybridisering buffer og vedlikeholde den ved 37 ° c for senere bruk.
- Etter avkjøling av den RNA/selektive rRNA-væske-og-ned-proben-blandingen til 37 ° c i 30 minutter, må du kort sentrifuge slangen for å samle prøven til bunnen av slangen.
- Overføring 33 μL av RNA/selektiv rRNA-sonde blandingen til de tilberedte magnetiske perlene fra trinn 3.3.7. Bland med lav hastighet virvlingen.
- Ruge røret ved 37 ° c i 15 min. Under inkubasjons kan du forsiktig blande innholdet av og til. Etterfulgt av korte sentrifugering for å samle prøven til bunnen av røret.
- Plasser røret på et magnetisk skilletegn for 1 min til pellet rRNA-probe kompleks. Denne gangen ikke forkaste supernatanten. Supernatanten inneholder rRNA-utarmet RNA.
- Plasser røret på 25 μL av perler fra trinn 3.3.6 på et magnetisk skilletegn i 1 min. aspirer og kast supernatanten. Legg supernatanten fra trinn 3.3.11 til den nye rør av perler. Bland med lav hastighet virvlingen.
- Ruge røret ved 37 ° c i 15 min. Under inkubasjons kan du forsiktig blande innholdet av og til. Sentrifuger kort på røret for å samle prøven til bunnen av røret.
- Plasser røret på et magnetisk skilletegn for 1 min til pellet rRNA-probe kompleks. Ikke kast supernatanten. Overfør supernatanten (ca. 53 μL) som inneholder rRNA-utarmet RNA til et nytt rør.
- Mål konsentrasjonen av RNA-utbyttet med en spektrofotometer.
- Bruk halvparten av rRNA-utarmet prøver som input til magnetiske perler som inneholder oligo (dT) 25 for å trekke ut polyA+ RNA på følgende måte:
Merk: denne protokollen for å isolere polyA hale Messenger RNA bruker oligo dT sekvenser bundet til overflaten av magnetiske perler har vært co-valgt fra en kommersielt tilgjengelig Kit (tabell av materialer).- Resuspend oligo dT i hetteglasset med en kort virvlingen for > 30 s og overføring 200 μL av oligo dT perler til et rør. Legg til det samme volumet (200 μL) av bindings bufferen, og resuspend.
- Plasser røret i en magnet i 1 min og kast supernatanten. Nå, Fjern slangen fra magneten og resuspend de vasket oligo dT perler i 100 μL av bindende buffer.
- Juster volumet på input rRNA-utarmet totalt RNA-prøve til 100 μL med 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Nå, tilsett 100 μL av bindende buffer.
- Varmes opp til 65 ° c i 2 minutter for å forstyrre sekundære RNA-strukturer. Nå, umiddelbart plass på isen.
- Tilsett 200 μL av total RNA på 100 μL vasket perler. Bland godt og la bindingen ved å rotere kontinuerlig på en rotor i 5 min ved RT.
- Plasser røret på magneten i 1-2 min og Fjern alle supernatanten forsiktig og Fjern alle supernatanten forsiktig.
- Fjern slangen fra magneten og tilsett 200 μL vaske buffer.
- Mål renheten og konsentrasjonen av den utpakkede polyA+ RNA ved a spektrofotometer.
Merk: et 260/280-forhold på 1.90 − 2.00 og et 260/230-forhold på 2,00 − 2.20 for alle RNA-prøver anses som akseptabelt. - Bruk gjenværende halvdel av rRNA-utarmet prøver fra avsnitt 3,3 som innspill til protein A kolonner (gitt i RNA immunutfelling [RIP] Kit, tabell over materialer) for å immunoprecipitate fem-Prime avkortet RNAs bruker monoklonale 7-methylguanosine antistoff på følgende måte:
Merk: denne protokollen for å isolere m7G avkortet Messenger RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA immunutfelling sett har blitt co-valgt og videre modifisert.- Vask proteinet en magnetisk perler Hentet fra RIP Kit i henhold til produsentens protokoll for å pre-binde antistoffer mot perlene.
- Overføring 3 μg av 7-methylguanosine antistoff (kanin IgG gitt i settet kan brukes den negative kontrollen) til perlene i et mikrosentrifugen rør suspendert i 100 μL vaskebuffer fra settet.
- Ruge med lav hastighet rotasjon i 30 min ved RT. sentrifuger rør kort og deretter plassere rørene på en magnetisk separator, fjerne og forkaste supernatanten.
- Fjern rørene og tilsett 500 μL av vaskebuffer fra settet og Vortex kort. Sentrifuger rørene kort etterfulgt av magnetisk separasjon igjen, fjern og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 3.6.4 igjen.
- Legg rundt 120 ng av rRNA utarmet (fra § 3,3) til Forvasket 7-methylguanosine antistoff bundet perler. Tilsett 1 μL av RNase-hemmer. Ruge ved RT for 1 − 1.5 t med mild agitasjon.
- Snurr ned perlene på 300 x g for 10 s og fjern supernatanten som inneholder uncapped (ikke-7-Methylguanosine) mRNA til et nytt mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 100 μL vaskebuffer og vask den to ganger til på samme måte. Pool de innsamlede supernatanten i samme mikrosentrifugen rør merket uncapped (ikke-7-methylguanosine) mRNA. Oppbevares på is.
- Eluere den avkortet (7-methylguanosine) mRNA fra perlene med 300 μL av urea lyse buffer (ULB) inneholdende 7 M urea, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA og 10 mM Tris, pH 7,5 ved å varme opp perlene ved 65 ° c for 2 − 3 min.
- Bland 300 μL av eluert prøver (avkortet og uncapped mRNA) med 300 μL av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1; kommersielt tilgjengelig) (oppbevares ved 4 ° c). Bland godt av invertere og la stå i ca 10 min og bland igjen forsiktig.
- Sentrifuger på 18 928 x g for 2 min og nøye pipette det øverste laget til fersk tube og forkaste nederste laget.
- Tilsett 300 μL av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1; oppbevares ved 4 ° c) til prøvene. Bland godt av invertere og deretter sentrifuger på 18 928 x g i 1 min. forsiktig, Pipetter det øverste laget til et friskt rør og kast nederste lag.
- Tilsett 300 μL av 2-porpanol og 30 μL av 3 M natrium acetate (pH 5,2) til avkortet og uncapped RNA. Vend prøven et par ganger og legg den på-20 ° c i 20 timer.
- Nå, sentrifuger prøvene ved 18 928 x g i 10 min ved 4 ° c. Fjern forsiktig supernatanten og tilsett 500 μL av 70% etanol.
- Sentrifuger igjen ved 18 928 x g i 10 min ved 4 ° c. Kast forsiktig supernatanten og tørk pellet ved RT for mindre enn 5 min. Resuspend pellet i nuklease vann.
- Mål renheten og konsentrasjonen av RNA-utbyttet med en spektrofotometer. 260/280-forholdet bør være i størrelses 1.90 − 2.00 og 260/230-forholdet i området 2,00 − 2.20 for alle RNA-prøver.
4. bekreftende analysen å vurdere responsen av musen TEdefinitivt modell til FasL mediert celle død
- Seed like mange (30 000 celler) av flavopiridol behandlet b16/F10 mus melanom celler og foreldre b16/F10 mus melanom celler i en 96-brønn kultur plate i tilsvarende medium (DMEM), og ruge over natten i en 37 ° c, 5% CO2 fuktet Inkubator.
- Behandle cellene i en kultur hette med ulike konsentrasjoner av hhans6FasL (0,1 − 1000 ng/ml) i nærvær av 10 μg/ml anti-His antistoff og ruge for 24 h ved 37 ° c, 5% co2 fuktet inkubator.
- Fjern døde celler ved å vaske med 1x PBS buffer. Fest de vedlagte cellene i 4% paraformaldehyde i 20 min ved RT. kast de 4% paraformaldehyde (ikke nødvendig å vaske), og beis med krystall fiolett oppløsning (20% metanol, 0,5% krystall fiolett i 1x PBS) i 30 min.
- Fjern overflødig beis ved å skylle platene forsiktig i vann fra springen. Hold platene tørke ved RT.
- Re-oppløse krystall fiolett i 100 μL av 1x ioniske overflateaktivt middel oppløst i 1x PBS, og måle celle tetthet ved å måle absorbansen på 570 NM i en mikroplate leser.
5. undersøkende analysen for å vurdere responsen av musen TEdefinitivt modell til antigen spesifikke cytotoksisk T-celle angrep
- Isolering og aktivering av OT-I CD8 + cytotoksisk T-celle angrep (CTL)
- Rens CD8 + celler fra spleens av OT-I TCR TG RAG-1 −/-mus ved magnetisk celle separasjon ved hjelp av en mus CD8 T celle isolasjons sett som følger:
- Harvest to spleens fra to OT-I TCR TG RAG-1 −/-mus i komplette RPMI-medier.
- MOS spleens i et 70 μm-filter holdt på et 50 mL rør fylt med 20 mL RPMI, ved hjelp av baksiden av en sprøyte til bare fett blir etterlatt i filteret.
- Sentrifuger strømmen gjennom ved 220 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.
- Tilsett 1 mL røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer til milt pellet fra forrige sentrifugering trinn og Pipetter blandingen i 1 min.
- Nøytralisere løsningen ved å legge til opptil 10 mL RPMI.
- Sentrifuger ved 220 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend i 10 mL RPMI.
- Ta en liten alikvot for telling. Sentrifuger de resterende på 220 x g i 5 min ved 4 ° c.
- For hver million celler telles, resuspend pellet i 1 mL kommersielt tilgjengelig magnetiske separasjon SystemBuffer (Mojo buffer eller en lignende buffer).
- Forbered en antistoff cocktail av volum 100 μL for hver 1 mL av pelleted celler i trinn 5.1.1.8. Den antistoff cocktail inkluderer: biotin anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ, og CD44.
- Legg denne cocktail til 1 mL pelleted celler og holde på isen i 15 min.
- Tilsett 100 μL av magnetiske (streptavidin) perler til hver 100 μL av antistoff cocktail lagt til 1 mL resuspendert pelleted milt celler. Hold på isen i 15 min.
- Tilsett 7 mL kommersielt tilgjengelig magnet skille SystemBuffer. Nå, alikvot om lag 3 − 4 mL av blandingen til en fersk tube. Bland godt og fest den til magneten i 5 min.
- Dekanter væsken (inneholder CD8 + celler) til et friskt rør på isen. Nå, alikvot de resterende 3 − 4 mL av blandingen fra trinn 5.1.1.12 til røret og fest den til magneten i 5 min. Dekanter væsken (andre batch av CD8 + celler isolert) til samme rør som inneholder den første gruppen med CD8 + celler holdt på isen.
- Seed utviklet tilhenger Fibroblast APC-(MEC. B7. SigOVA) linje for å uttrykke en bestemt ovalbumin (OVA)-avledet, H-2Kb-begrenset peptid epitope OVA257-264 (SIINFEKL), sammen med co-stimulerende molekyl B 7.1, ved 75 000 celler per brønn i 24-brønn plater, ved 37 ° c, 5% CO2 fuktet inkubator.
Merk: tilhenger Fibroblast som brukes er en gave fra Dr. Edith Janssen ' s Lab på CCHMC. Linjen ble opprettet opprinnelig i Dr. Stephen P. Schoenberger ' s Lab i La Jolla Institute for allergi og immunologi6. - Etter 24 h, vaske monolag av APC en gang med Iscove ' s modifiserte Dulbecco ' s medium (IMDM) kommersielt tilgjengelig med HEPES buffer, natrium pyruvat, L-glutamin og høy glukose), og tilsett 0,5 x 106 naiv OT-i CD8 + celler (fra trinn 5.1.1.13) i 2 ml av IMDM supplert med 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamin og HEPES og 10% FBS.
- Etter 20 h, forsiktig høste de ikke-tilhenger OT-I-celler (ved å samle inn Media i kulturen parabolen med flytende OT-I celler og pelleting cellene på 191 x g for 2 min; TELLE levedyktig OT-i celler) og overføre dem for co-kultur.
- Rens CD8 + celler fra spleens av OT-I TCR TG RAG-1 −/-mus ved magnetisk celle separasjon ved hjelp av en mus CD8 T celle isolasjons sett som følger:
- Co-kulturen i CD8 + celler med b16/F10-OVA celler
- Seed OT-I-avledet CD8 + celler i forholdet 1:1 (300 000 celler hver) i en co-kultur med b16/F10 (mangler antigen ovalbumin), ubehandlet b16/F10-OVA, og b16/F10-OVA celler pre-behandlet med flavopiridol (25 nM) for 1 uke, i 6-brønn retter med komplett DMEM 20 timer ved 37 ° c i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Etter 20 h, fjerne OT-I-avledet CD8 + celler (ved å samle inn Media i kulturen parabolen med flytende OT-jeg avledet CD8 + celler). Vask tilhenger b16/F10-OVA celler i 1x PBS.
- Trypsinize de tre gruppene av vedlagte b16/F10-OVA celler i 0,05% EDTA inneholder Trypsin i 5 min. pellet de trypsinized cellene ved 191 x g i 5 min.
- Stain høstes b16/F10-OVA celler ved incubating dem i kaldt PBS (inneholder 0,5% FBS og 0,05% natrium Natriumazid) med levedyktighet fargestoff og relevant merket antistoffer (fixable levedyktighet farging Dye e780, AF647-bøyd mus CD8 og BV421-bøyd mus CD45 ).
- Analysere levedyktigheten til de tre gruppene av b16/F10-OVA celler ved flyt flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her gir vi en detaljert ordning (figur 1) for å etablere en tedefinitivt celle modell innhentet av kroniske sub-dødelige (figur 2) behandling med flavopiridol på 25 nM. I Figur 3, på 3 dager med behandling med Flavopiridol, b16 OVA celler viser delvise KARAKTERISTIKKER av tedefinitivt , men etter en uke med behandling, b16/F10 OVA celler viser en dyp tap av fosforylering på SERINE 2 posisjon på CTD av RNA Pol II langs med en betydelig nedgang i H3K36me3-en histone modifikasjon innblandet i å definere ekson grenser og en hemmer av kjøre-away kryptiske transkripsjoner. Som en konsekvens, TEdefinitivt celle modell viser kritiske mRNA behandling defekter med åpenbart økte prosenter av feil avkortet og ikke-Poly-adenylated MRNAs (figur 4a, B). Også bestemt undertrykkelse av nøkkel inflammatorisk respons sti gener og FasL mediert celle død veien er sett i figur 5 og figur 6. Pålagt motstand mot interferon (IFN-α, IFNγ) og TNF-α stimulert fosforylering av STAT1 og NFκB, og motstand mot celle død av døds reseptoren ligand FasL drastisk reduserer cytotoksisitet av en immun celle angrep mot TEdefinitivt Svulster. Disse bekreftende teknikkene er utformet for å teste omfanget av innflytelse kronisk forstyrrelsene av transkripsjon forlengelse har på et bredt spekter av stimulans-responsive gener, og om en slik forstyrrelsene i en gitt muse cellelinje modellen er tilstrekkelig nok til å be en akutt mangel av funksjonell mRNA i inflammatorisk respons signalering gener, etterligne den grunnleggende essentialities av TEdefinitivt kreftformer klinisk. Basert på vår studie av flavopiridol behandling, er undertrykkelse av fosforylering ved andre Serine rester (pSER2) av RNA Pol II CTD kritisk, som det markerer transkripsjon forlengelse. En subletale dose for en gitt mus kreftcelle linje må oppnå en reduksjon i pSER2 nivåer i tillegg til å ha en ubetydelig effekt på frekvensen av vekst og levedyktighet av cellelinjen. Selv om vi konsekvent ser en reduksjon i pSER2 og H3K36me3 nivåer på 25 nM flavopiridol behandlinger, garanterer det ikke en undertrykkelse av både pSTAT1 og pNFκB nivåer (på IFN-α, IFNγ og TNF-α stimuleringer, henholdsvis). Hver mus kreftcelle linje er unik (b16/F10 OVA eller CT26 celler kultivert i ulike laboratorier over en periode kan ha litt endret effekter), og de kan ha enten JAK1 eller CCNT1 delvis redde virkningene av flavopiridol i undertrykke inflammatorisk respons sti gener. I slike tilfeller kan Kinetics av pSTAT1 og pNFκB nivåer må sjekkes på ulike tidspunkt (5 − 70 min) for å forstå temporalitet av flavopiridol mediert effekter og dens redning av enten JAK1 eller CCNT1. Følgelig kan JAK1 og/eller CCNT1 må slås ned for å etablere denne modellen.
Når flavopiridol modellen er etablert og preget ved hjelp av nevnte analysene, gir vi en undersøkende analysen for å teste om TEdefinitivt celle modell tildeler motstand mot cytotoksisk T-Cell (CTL) angrep. Basert på vår optimalisert protokoll, flavopiridol behandlet b16/F10 celler stabilt overexpressing OVA genet (b16 OVA) co-inkubert med aktivert CD8 + CTLer (spesifikk for OVA257-264 epitope) har selektiv toksisitet for å OVA-uttrykker celler (en gave fra Dr. Stephen P. Schoenberger ' s Lab6) var ikke utsatt for OT-I CTL-mediert tumorlyse. B16/F10 OVA celler (ikke forbehandlet med flavopiridol) gjennomgikk massiv celle død i dette systemet, mens b16/F10 foreldrenes celler overlevde, som de ikke uttrykker OVA antigen (figur 7). Det er klart fra utfallet av den foreslåtte undersøkende analysen at kronisk flavopiridol-indusert TEdefinitivt kan skjenke et middel til å flykte fra anti-tumor immun angrep selv in vivo. Dette kan bli ytterligere testet i in vivo tumor modeller for å sjekke tilbøyelighet av TEdefinitivt modeller for å unnslippe medfødt og adaptive anti-tumor immunresponser. Anti-asialo behandlinger kan brukes til å regulere aktiviteten til NK celler in vivo i tumor bærende mus. Også, immun kontrollpunkt terapi (anti-CTLA4 og anti-PD1) kan administreres til TEdefinitivt svulst peiling mus.
I helheten, TEdefinitivt bekreftende analysene sammen med den foreslåtte undersøkende analysen sammen demonstrere nytten av å INNLEMME denne tedefinitivt celle modell i en hel rekke andre tumor-immune testing forhold. Denne modellen kan hjelpe analysere ut den molekylære detaljer som følge av defekte transcriptional forlengelse i tumorceller og deres svar på immun celle interaksjoner.
Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: cellevekst karakteristikker av b16 OVA celler kronisk behandlet med lav dose flavopiridol: levedyktighet (målt ved levedyktighet reagens) av kontroll og flavopiridol celler b16 OVA på angitte dager etter behandling. Dette tallet har blitt modifisert fra Modur et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bekreftende analysen for å vurdere RNA Pol II og histone profil: Immunoblots av indikerte histone og RNA Pol II-merker i b16 OVA celler behandlet med flavopiridol for 72 h eller 1 uke. Dette tallet har blitt modifisert fra Modur et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bekreftende-analysen for å vurdere alvorlige defekter i mRNA-behandlingen. Prosenter av 5 ′-uncapped til 5 '-avkortet (A) og 3 '-ikke-polyadenylated til 3 ′-Polyadenylated (B) mRNA konsentrasjoner etter rRNA forringelse i den indikerte cellelinjer. Feilfelt representerer standardavvik basert på tre tekniske replikeres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bekreftende analysen for å vurdere cytokin stimulering profil. Immunoblots av STAT1, pSTAT1, NFκB og p NFκB i kontroll og flavopiridol pre-behandlet b16 OVA celler stimulert med IFN-α, IFNγ eller TNF-α i 30 min ved (5 ng/mL). Dette tallet har blitt modifisert fra Modur et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: bekreftende analysen å vurdere motstand mot FasL mediert celle død in vitro. Kontroll og flavopiridol pre-behandlet b16 OVA celler behandlet med FasL for 24 h avlesning målt ved levedyktighet analysen. Dette tallet har blitt modifisert fra Modur et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: undersøkende analysen for å vurdere motstanden av TEdefinitivt modellen til antigen-begrenset cytotoksisk T celle mediert angrep in vitro. Venstre: diagrammatisk ordningen av undersøkende analysen. Høyre: relativ levedyktighet av b16/F10-OVA celler co-kultivert med aktivert CD8 + CTLer (1:1 ratio) isolert fra spleens av OT-jeg mus. P: Welch to-sample t-test. Dette tallet har blitt modifisert fra Modur et al.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA Pol II forlengelse Control har dukket opp som en avgjørende spak for å regulere stimulans-responsive genuttrykk til fordel for ondartede celler5,7,8. Overvinne promoter-proksimale pause til forlengelse og påfølgende mRNA produksjon krever kinase aktivitet av P-TEFb9,10,11. Vår modell benytter flavopiridol (25 nM), en hemmer av de essensielle cyclin-avhengige kinase CDK9, for å etterligne de defekter observert under Pol II forlengelse i TEdefinitivt kreft-en tidligere ukjent fenotype i kreft oppdaget av vår gruppe tidligere3.
CDK9 kinase aktivitet har lenge vært kjent for å være avgjørende for fosforylering av Serine 2 rester i CTD av den store delenhet av pol II. Kritisk, har vi lyktes i å optimalisere flavopiridol behandlet kronisk hemming av CDK9 (25 nM for 1 uke) i b16/F10 OVA slik at, i tillegg til å hemme CTD fosforylering, 25 nM flavopiridol behandling for 1 uke hindrer riktig post-transcriptional modifikasjoner av mRNA på en uforutsett måte og effektivt opphever p-TEFb-avhengige produktiv forlengelse langs lange gener som Pro-inflammatorisk respons signalering gener, vesentlig endre deres uttrykks mønstre både på mRNA og proteinnivåer. Til beste av vår kunnskap, er det ingen annen modell som er beskrevet i litteraturen som effektivt oppnår det samme.
Denne lett å opprette, generaliserings modell av TEabsolutt kanne derfor være utnyttes å analysere, begge to transcriptional og epigenetic modifiseringer muliggjør teabsolutt kreften å innrette å immun-mediert cellen angripe. Videre beholder denne murine modellen sin TEdefinitivt-som reduksjon av total og FOSFAT-RNA Pol II-nivåer 21 dager etter flavopiridol utgivelse i vivo vekst analysen3 (ikke nevnt i protokollen her), noe som tyder på omfanget av stabiliteten i denne ikke-genetisk modell for videre in vivo eksperimentering. Men, må forsiktighet tas for å optimalisere den nøyaktige subletale dosen av flavopiridol for andre murine linjer (for eksempel ca 20 nM flavopiridol behandling for 1 uke er subletale dose for MC38 murine kreft linje; ikke brukt i denne protokollen), virkningen av variasjon i celle av plating tetthet, kultur forhold, og cytokin stimulering forhold kan variere for ulike murine linjer. Protokollen er beskrevet her gir en grunnleggende rammeverk for å minimere variabler kjent for å være kritisk for generering av TEdefinitivt-lignende funksjoner ved kronisk CDK9 hemming. I tillegg har menneskelig kreftcelle linjer, slik som T47D og CAL51 blitt testet med kortsiktige (3 dager) flavopiridol behandlinger som gir opphav til lignende TEdefinitivt-som RNA Pol II profiler, som indikerer nytten av flavopiridol basert kronisk hemming av CDK9 mediert transkripsjon forlengelse i å skape enda modell menneskelige linjer for å studere TEdefinitivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NCI (CA193549) og CCHMC Research Innovation pilot Awards til Kakajan Komurov, og Department of Defense (BC150484) prisen til Navneet Singh. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Cancer Institute eller Department of Defense. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
