둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

지난 수십 년 동안, 메타조안 모델 유기체 인 Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 뉴런, 신경 회로 및 생리 및 행동 반응에서의 역할 및 노화 관련 신경 퇴행성 연구에 엄청난 자산이었습니다. 질병. C. elegans의 유일한 특징은 동물이 투명하다는 것입니다, 모든 성인 체세포의 혈통이매핑될 수 있도록 1. C. 예쁜꼬마선충은 또한 신경의 관리 가능한 양을 항구, 잘 이해되는 신경계의 형태와 연결로 이끌어 내는^2. 불변 세포 혈통, 짧은 수명, 그리고 C. elegans에 사용할 수 있는 높은 처리량 유전 도구의 풍부는 다른 신경 인구 내의 노화의 연구를 위한 이상적인 모형 유기체합니다.

뉴런과 신경 퇴행성 질환의 노화는 복잡하며 각 장애에는 독특한 병리학 적 서명이 있습니다. 그러나, 파킨슨병및 알츠하이머병과 같은 이러한 장애의 많은 경우, 일반적인 특징은 잘못 접힌단백질의 점진적 하중3,^4,5이다. 이 두 질병 에서, 단백질잘못 접고 세포 내에서 집합 독성을 일으킬,궁극적으로 세포 죽음으로 이어지는 4,^5. 뉴런의 적절한 노화를 위해, 미토콘드리아의 항상성, 보다 구체적으로 는 단백질 항상성, 관동 및 dyshomeostasis신경변성으로 이어질 수 있기 때문에, 중요하다 6,^7,8. 세포는 단백질 항상성을 유지하기 위해 다양한 메커니즘을 갖추고 있습니다, 하나는 전개 된 단백질 반응 (UPR)-세포 내 망상 (ER)에서 신호가 세포 내 신호 캐스케이드를 활성화하는 고전적인 통로인, 전사로 이끌어 냅니다 응답⁹. 이러한 UPR^ER과유사하게, 메타조안은 미토콘드리아 단백질 항상성의 손실에 유사한 반응을 나타내며, 소위 미토콘드리아 UPR(UPR mt)7,^8. C. 예쁜꼬마선충은 확인되고 잘 정의된 UPR^mt 통로7을가지는 가장 기초유기체인 것으로 보인다.

더 큰 네트워크 내의 특정 뉴런 집단의 기능/기능 장애는 본질적인 연결성과 복잡성으로 인해 평가하기 어려울 수 있습니다³. 그러나, 수시로 손상된 세포 단백질 항상성과 관련되었던 것과 같은 복잡한 병리학을 가진 세포 모형 특정 질병 때문에 명백한 신경 인구를 공부하는 필요가 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서,특정 신경 인구는 생체 내에서 허구 관찰을 허용하는 유전으로 조작될 수 있습니다. C. elegans의 신경계는 주로 신경교세포의 작은 비율로 뉴런으로 구성됩니다. 성인 헤르마로디테 웜에는 약 302개의 뉴런이 있으며, 100개이상의 서로 다른 클래스 2,^10으로세분화되어 있다. 해 신경 세포와 같은 뉴런은 신경 근육 접합부에서 우세한 반면, 도파민성 뉴런은 주로 감각^10,11에관여합니다. 운동 활동과 감각 능력이 나이가 들면서 감소함에 따라, 이러한 개별 뉴런의 결함에 대한 기계적 통찰력을 자세히 설명하는 것이 중요합니다^11,12. 이와 같이, 후속 생체 내 연구에 대한 관심 있는 세포를 온전한 세포를 분리하는 간단하고 강력한 방법에 대한 필요성이 있다.

여기서, 우리는 C. elegans에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 특정 신경 세포의 신속한 격리를위한 최적화 된 효과적인 방법을 설명합니다. 이 격리 방법은 애벌레, 청소년 또는 성인 웜에서 수행 할 수 있습니다. 애벌레 벌레로부터 세포의 격리는 이전에 장 외^13에 의해 간행되었으며 여기에서 논의되지 않을 것이다. 여기서 중요한 참고는 모든 벌레가 다른 삶의 단계에서 동물의 과잉 소화 또는 오염을 방지하기 위해 동일한 삶의 단계에 있어야한다는 것입니다. 선충 표피의 효소 및 기계적 중단을 통해, 콜라겐 및 기타 구조 단백질이 높은 외골격, 다양한 세포를^13,14로분리할 수 있다. 세포는 그 때 유동 세포 측정 또는 자기 비드표지된 항체를 통해 분리될 수 있습니다. 전형적으로, RNA는 원하는 세포 집단(15)의 농축을 보장하기 위해 페놀 및구아니딘 이소티오차네이트 방법을 통해 단리된다. 많은 주의를 기울여 이러한 단리된 세포는 배양 플라스크 또는 다중 웰 접시에서 유지될 수 있다. 이 방법은 특정 뉴런의 연구에서 독특하고 강력한 도구를 나타내며 추가 배양을 위해 살아있는 세포와 기능성 세포를 분리할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.

1. 세포 격리를위한 세 벌레의 준비 및 수집

참고: 아래에 설명된 것은 미네소타 대학의 케노하브디티스 유전학 센터(CGC) 균주 저장소에서 얻은 형질전환 unc-17:GFP균주(OH13083)에서 콜린성 뉴런의 분리입니다. 곰팡이 나 박테리아의 오염을 방지하기 위해 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.

1. T. Stiernagle^16에의해 설명된 바와 같이 표백 방법을 통해 벌레를 준비하고 동기화합니다. 노화 실험을 위해, 난자 생성을 줄이고 계란 부화를 체포하기 위해 25 μM 의 플루오로데옥시우리딘 (FuDR)을 함유한 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에 판 벌레를 함유하고 있습니다. 한천 판을 정기적으로 검사하여 오염이나 달걀 부화로 인해 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있으므로 이를 방지합니다.
   참고: unc-17:GFP세포의 경우, 전형적으로 3개의 100 mm x 15 mm NGM 플레이트는 충분한 양의 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용된다^16.
2. 웜을 수집하고 셀 격리를 위한 버퍼를 준비합니다.
   1. 15 mL 원엽 튜브에 벌레를 수집합니다. M9 버퍼의 1.5 mL (1mM MgSO_4,85 mM NaCl, 42 mM Na2 HPO₄·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0)와 1,600 x g에서 5 분 동안 원심 분리기로 접시에서 웜을씻으하십시오. 상급을 버리고 M9 버퍼 1 mL로 웜을 씻으십시오. 원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 대장균 오염을 최대한 제거합니다.
      참고: 이 단계에서 암피실린과 같은 항생제(50 μg/mL)를 추가하면 세균 오염을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
   2. 두 샘플의 경우, 나트륨 도데실 황산염-디티오트레이톨 (SDS-DTT) 용해 완충제 2 mL을 준비하십시오 : 200 mM DTT, 0.25 % (w / v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0), 3 % (w / v) 자당.
   3. 15 mL의 절연 버퍼 (118 mM NaCl, 48 mMKCl, 2 mM CaCl 2, 2mM MgCl_2,25 mM HEPES [pH 7.3])를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
      참고: SDS-DTT 용해 버퍼와 격리 버퍼는 각 실험 전에 새로 만들어야 합니다.
3. 큐티클 중단 및 단세포 분리
   1. 1,600 x g에서 5 분 동안 1.2.1 단계로 수집 된 원심 분리기 동물. 모든 상급체를 제거하고 M9 용지 의 1 mL에서 웜을 중단하고 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브로 옮김을 옮김.
   2. 1,600 x g에서 원심분리를 가진 펠릿 웜을 5 분 동안.
   3. 200 μL의 SDS-DTT 용해 버퍼를 웜에 넣고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 가벼운 현미경으로 볼 경우 몸을 따라 "윙클"로 나타납니다.
      참고: SDS-DTT 용해 버퍼에 장기간 노출되면 웜이 사망할 수 있으며, 웜을 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 죽은 벌레는 길게 하고 말리지 않습니다.
   4. 800 μL의 얼음-차가운 절연 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 가볍게 두드려 섞습니다.
   5. 4 °C에서 13,000 x g에서 1 분 동안 펠릿 웜을 제거하고 상류를 제거하고 1 mL의 절연 버퍼로 씻으십시오.
   6. 단계 1.3.5를 총 5회 반복하여 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
   7. 스트렙토미스 글리세스 (15 mg/mL)에서 프로테아제 혼합물 100 μL을 첨가하고 (재료표)격리 완충제에 용해된 후 RT에서 10-15분 동안 배양합니다.
      참고: SDS-DTT 용해 완충제와 마찬가지로, 확장된 프로테아제 소화는 혈장 막을 따라 단백질의 과도한 분열을 초래하여 자기 구슬을 통해 표면 노출 GFP의 분리를 방지할 수 있습니다.
   8. 프로테아제 혼합물로 인큐베이션하는 동안, ~60-70회 동안 200 μL 마이크로파이펫 팁으로 1.5 mL 미세원원지 튜브의 바닥에 샘플을 위아래로 파이펫팅하여 기계적 중단을 적용합니다. 피펫 팁을 미세 원심 분리튜브의 벽에 일정한 압력으로 유지하여 세포를 적절하게 분리합니다.
   9. 소화 단계를 결정하려면 소화 혼합물의 작은 부피 (~ 1-5 μL)를 제거하고 유리 슬라이드에 떨어 뜨리고 조직 배양 현미경을 사용하여 검사하십시오. 배양 후 5-7 분, 벌레 조각은 눈에 띄게 표피를 감소해야하고 세포의 슬러리는 쉽게 볼 수 있습니다.
   10. 시판되는 차가운 라이보비츠의 L-15 배지 900 μL로 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(50 U/mL 페니실린 최종 농도 및 50 μg/mL 스트렙토마이신)으로 반응을 중단하십시오.
   11. 펠릿은 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 단편 및 세포를 분리하였다. 차가운 L-15 보충 매체의 1 mL로 펠릿 세포를 두 번 더 씻어 여분의 파편과 표피를 제거하십시오.
   12. L-15 보충 매체 1 mL에 펠릿 세포를 다시 일시 중단하고 30 분 동안 얼음에 둡니다. 최상층인 약 700-800 μL을 미세원심지 튜브로 가져가십시오. 이 층은 세포 파편이없는 세포를 포함하고 관심있는 세포의 후속 격리에 사용됩니다.
   13. 제조업체의 지침에 따라 자동화된 셀 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 단리된 세포의 10-25 μL의 세포 밀도를 측정합니다.

2. 유세포 분석 또는 반대로 GFP 자기 구슬을 통해 GFP 양성 세포의 격리

참고: 특정 셀 유형을 격리하기 위해 배포할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 형광 활성화 세포 선별 (FACS)을 사용하는 반면, 두 번째 방법은 항체 공액 자기 비드를 사용하여 뚜렷한 혈장 막 국부적 인 단백질을 발현하는 풀 세포를 사용하는 것입니다. 후자의 방법은 혈장 막에 GFP의 국소화를 요구하므로 항체 결합 자기 비드와의 상호 작용에 사용할 수 있습니다.

1. 유세포측정에 의한 GFP 양성 세포의 분리
   1. 1.3.12단계에서 수집된 단리세포 현탁액으로부터, 원심분리세포는 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안. 상급을 버리고 유세포계의 과부하를 피하기 위해 L-15 보충 배지에서 6 x 10⁶ 셀/mL 이하의 세포 밀도로 펠릿 세포를 일시 중단합니다.
   2. 샘플을 정렬할 수 있는 유량 세포계를 사용하여 GFP 양성 발현에 의해 셀을 정렬합니다. GFP 음성 세포는 비 세포 유형 특이적 분석을 위한 대조군으로서 사용될 수 있다.
      참고: 위에서 언급한 바와 같이, 관심 있는 GFP 태그단백질이 세포의 혈장막에 국한된 경우 GFP 양성 세포를 분리하는 대체 접근법이 사용될 수 있다. 이 경우, 섹션 2.2에 기재된 프로토콜이 사용될 수 있다.
2. 반대로 GFP 자기 구슬을 통해 GFP 양성 세포의 격리
   1. 1.3.12단계에서 수집된 단리세포 현탁액으로부터, 원심분리세포는 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안. L-15 보충 배지의 485 μL에서 상류를 버리고 세포를 일시 중단시다. 용액에 15 μL의 ddH₂O 미리 세척된 α-GFP 항체 결합 자기 비드를 첨가한다.
   2. 매우 부드러운 선삭 1 시간 동안 4 °C에서 자기 비드 슬러리와 세포를 인큐베이팅. 과도하게 선회하면 세포가 손상됩니다.
   3. 배양 후, 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리기 샘플을 채취한 다음, 펠릿 2x를 L-15 보충 배지 1 mL로 세척하여 GFP 음성 세포를 제거합니다.
3. 분리 된 세포의 배양
   1. 플레이트는 멸균 6 웰 멀티 웰 플레이트로 세포를 분리.
      참고 : 이 플레이트는 세포 부착을 증가시키기 위해 땅콩 렉틴으로 코팅 될 수있다; 그러나 세포를 즉시 사용해야 하는 경우 이 단계는 무시될 수 있습니다.
   2. 젖은 물티슈 또는 연조직 용지(50 μg/mL ampicillin를 ddH 2O에 50 μg/mL ampicillin를 추가하여 닦아세균이 증가하지 않도록)를 플라스틱 용기에 넣고 20°C에서 세포를 배양하여 세포에 수분을 더합니다. CO2 수치가 높아세포를 손상시킬 수 있기 때문에_CO2 인큐베이터에서 배양하지 마십시오.

3. 분리된 GFP 양성 세포의 형광 화상 진찰

1. 형광 부착이있는 반전 된 현미경의 형광 전구를 켜고 약 10 분 동안 따뜻하게하십시오.
2. 인큐베이터에서 세포 배양을 제거하고 플로레스션 부착과 반전 현미경의 무대에 설정합니다. GFP 필터를 현미경의 단계 아래 홈에 밀어 넣습니다.
3. 배율이 50배인 셀을 봅니다. 성공적으로 분리 된 GFP 양성 세포는 쉽게 볼 수 있습니다. 현미경의 카메라 부착물을 사용하여 사진을 찍습니다.

4. 분리 된 세포에서 RNA 추출

참고 : RNA 추출은 높은 품질의 물질을 보장하기 위해 세포 분리 직후에 수행되어야합니다. 단리된 RNA는 정량적 PCR(qPCR)에 의한 cDNA 및 전사체 수준의 후속 측정을 생성하는데 사용될 수 있다. 모든 튜브, 팁 및 시약은 RNase가 없어야 하며, 작업 공간은 RNA 추출 전에 에탄올 세척을 해야 합니다.

1. 단계 2.1.2에서 수집된 단리세포로부터, 1.5 mL 멸균된 원심분리세포, RNase-free 미세원원지 튜브5분에서 10,000 x g에서 4°C. 세포가 자기 구슬을 통해 분리되는 경우에, 위에 명시된 세포 수집을 따르십시오.
2. 마이크로파이펫을 사용하여 원심분리기 튜브에서 상급제를 제거하고 M9 배지 100 μL을 추가하여 L-15 보충 배지를 씻어냅니다. 원심 분리기 세포는 4 °C에서 10,000 x g에서 5 분 동안 상류를 제거합니다. 모든 용지가 제거되도록 하려면 매번 상급을 조심스럽게 제거한 총 3번의 세차기를 반복합니다.
3. 페놀과 구아니딘 이소티오피야네이트 용액 1mL(재료 표)를 세포에 넣고 서스펜션을 위아래로 조심스럽게 피펫에 넣습니다. 혼합물을 RT에서 5 분 동안 배양합니다.
4. 배양 후, 페놀과 구니딘 이소티오차네이트 용액 250개 추가
5. 25 °C에서 10,000 x g에서 5 분 동안 용액을 원심 분리합니다.
6. 바닥 유기 층을 방해하지 않고 가능한 한 미세 파이프로 상단 수성 층을 최대한 제거하고 바닥 층을 새로운 1.5 mL RNase없는 미세 원심 분리 튜브로 옮김하십시오. 새로운 튜브에 이소프로판올 500 μL을 넣고 튜브를 뒤집어 섞는다. 이 솔루션을 RT에서 5분 동안 배양합니다.
7. 25 °C에서 20 분 동안 14,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
8. 샘플을 얼음 위에 유지하면서 마이크로파이펫으로 가능한 한 많은 이소프로판올을 제거하고 RNase 가없는 ddH₂O에 70 % (v / v) 에탄올 1 mL을 튜브에 부드럽게 추가하십시오. 튜브의 바닥에 직접 용액을 배출하지 않도록하십시오. 에탄올/물 혼합물을 튜브 측면에 도포합니다.
9. 10,000 x g에서 25 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
10. 에탄올의 대부분을 제거하고 3-5 분 동안 얼음에 공기 건조.
    참고: 이 단계 이후에 에탄올을 제거해야 합니다. 그러나 에탄올이 남지 않도록 튜브 바닥을 주의 깊게 검사하는 것이 중요합니다.
11. 튜브가 공기 건조 된 후, RNase-free ddH₂O의 15-20 μL을 추가하고 260 nm 파장에서 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다. 시료의 순도는 260 nm/280 nm 비로 측정되어야 합니다. 이 비율은 대략 >2여야 합니다.
    참고: 분리된 RNA는 -20°C에서 동결및 보관할 수 있습니다. 그러나 고품질 cDNA 생산을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 cDNA 합성 키트를 사용하는 것이 매우 우선적입니다. 정량적 PCR은 실험실에서 사용되는 열자전거 제조업체에서 제공하는 지침을 사용하여 따를 수 있습니다.

여기에 기술된 프로토콜은 unc-17의특정 분리를 허용합니다 ::GFP 양성 콜린성 뉴런은 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링 및 최종과 같은 후속 생체 내 연구를 위해 둥근 벌레 C. elegans에서 패치 클램프 전기 생리학 측정을 위한 단기 배양.

그림 1은 unc-17::GFP양성 콜린성 뉴런을 정상 설정에서 나타낸다. unc-17 유전자는 C. elegans 바디 및 vesicular 아세틸콜린 막 횡단 수송기(17)를위한 부호를 통하여 발현된다. 이 유전자의 발현은 머리, 중체 및 꼬리 뉴런 및 뉴런 프로젝션에서 관찰될 수 있습니다.

도 2A는 방법 섹션에 설명된 뉴런 격리 절차의 그림 개요를 나타낸다. 첫 번째 단계는 웜을 동기화하고 배양하는 것입니다. 추가적으로, 도 2B는 unc-17::GFP양성 뉴런의 대표적인 형광 현미경 을 변형되지 않은 N2 야생형 동물로부터의 각각의 음성 대조군뿐만 아니라 격리 후 보여준다. 리보비츠의 L-15 배지와 10% FBS로 보충하면 분리된 세포는 최대 3일까지 살아남을 수 있습니다.

도 3은 GFP 발현 근육 세포뿐만 아니라 해 신경세포를 발현하는 GFP로부터의 qPCR의 대표적인 데이터를 나타낸다. 어느 방법에 의하여 세포의 성공적인 선별 후, RNA는 합성 키트를 사용하여 cDNA를 생산한 후 페놀 및 구아니딘 이소티오시야네이트 방법을 통해 분리하였다. 해 뉴런 특이적 유전자의 발현, tph-1 및 snb-1,트립토판 하이드록실라제 및 시냅스 소포 수송기는 각각 unc-17에서상승된다:: GFP 분리 세포는 myo-3에존재하지 않지만: GFP 분리 된 세포. 역은 myo-2의근육 특이적인 myosin 중대 사슬 전사체의 발현과 마찬가지입니다. 후자의 유전자의 발현은 단리된 근육 세포에 국한되지만, 단리된 콜린성 세포는 아니다.

그림 1: unc-17을발현하는 1일된 야생형 형질전환 동물의 콜린성 뉴런의 재구성 이미지::GFP 리포터. 이미지는 전체 동물의 길이를 포함하는 동일한 웜의 4 개의 별도의 공초점 형광 이미지로부터 조립되었다. 각 개별 이미지의 배율 막대는 50 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: unc-17::GFP 스트레인으로부터 분리된 세포 격리 및 대표적인 GFP 발현 세포의 워크플로우. (A) unc-17에서농축된 특정 세포 집단의 격리를 위한 회로도 워크플로우 묘사::GFP-발현 콜린성 뉴런각각으로부터 의 C. elegans 형질전환 균주. (B) 대표적인 형광 이미지는 단리된 unc-17에서GFP 신호의 존재를 나타내는::GFP 양성 세포. 이미지에 단일 초점 평면이 표시됩니다. 배율 막대 = 10 μm. 그림 2B는 세포 과학 저널의 허가를 받아 복제되며 독일 등12에의해 출판되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: unc-17-neuron 특이적 마커의 대표적인 qPCR 분석(tph-1, unc-47 및 snb-1)전체 동물 대 unc-17::GFP 리포터 세포 는 콜린성의 특정 농축을 확인 관심의 뉴런. 여기에서 사용된 추가 음성 통제는 myo-3::GFP 기자 발현 근육 세포, 동일 프로토콜에 따라 격리되었다. 데이터 표시 평균 값 ± SD (n = 3 생물학적 복제). * p < 0.05; ** p & 0.01; p < 0.001 쌍을 이루는 t 테스트에 의해. 이 수치는 독일 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.