Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/60145
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

Abstract

במהלך תהליך ההזדקנות, תאים רבים מצטברים רמות גבוהות של נזק המוביל לתפקוד לקוי של הסלולר, אשר ביסוד הרבה מצבים גריאטרי ופתולוגי. הנוירונים פוסט-mitotic מייצגים סוג תא ראשי המושפע על ידי הזדקנות. למרות שדגמים מרובים של הזדקנות עצבית קיימים, הם מאתגרים ויקרים להקמת. האלגיה העגולה של התולעים העגולות היא מודל רב-עוצמה לחקר הזדקנות עצבית, מאחר שלחיות אלה יש תוחלת חיים קצרה, כתיבת כלים גנטית חזקה ומערכת עצבים מקוטלקת היטב. השיטה המוצגת בזאת מאפשרת בידוד חלק של תאים ספציפיים בהתבסס על הביטוי של חלבון פלורסנט ירוק טרנסגניים (GFP). קווי בעלי חיים טרנסגניים המבטא GFP תחת נבדל, סוג תא ספציפי היזמים מתעכלים כדי להסיר את הקוטיקולה החיצונית בעדינות שיבש מכני כדי לייצר שובלים המכילים סוגי תאים שונים. תאי העניין מופרדים לאחר מכן מתאים שאינם יעד באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות פלואורסצנטית, או באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-GFP בשילוב. התאים המבודדים לאחר מכן יכול להיות מתורבת לזמן מוגבל או באופן מיידי משמש לניתוח ספציפי לתא לשעבר vivo כגון ניתוח ההמרה על ידי PCR בזמן אמת כמותי. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר ויציב של תגובות לתאים ספציפיים בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות בג.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, האורגניזם המודל החדש Caenorהאבודיטיס מודל היה נכס עצום בחקר הנוירונים, המעגלים העצביים ותפקידה בתגובות פיסיולוגיים והתנהגותיים, והזדקנות הקשורים נוירוניווניות חלות. התכונה הייחודית של הג היא שבעלי החיים שקופים, ומאפשרים שושלת היוחסין של כל התאים הסומאטיים הבוגרים להיות ממופים1. ג. אלגיה מקיימת גם כמות של נוירונים, המובילה לתחום המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שהבינה היטב2. השושלת הקבועה של התאים, תוחלת החיים הקצרה והשפע של כלים גנטיים בתפוקה גבוהה הזמינות עבור C. אלגיה הופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההזדקנות בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות.

הזדקנות הנוירונים והפרעות ניווניות הן מורכבות, וכל הפרעה יש חתימות פתולוגיים ייחודי הקשורים בו. עם זאת, עבור רבים מהפרעות אלה, כגון מחלת פרקינסון ואלצהיימר, תכונה נפוצה היא העומס הפרוגרסיבי של חלבונים misfolded3,4,5. בשתי מחלות אלה, חלבונים misfold לצבור בתוך התא כדי לגרום לרעילות, בסופו של דבר המוביל למוות התאים4,5. עבור הזדקנות נאותה של נוירונים, הומאוסטזיס של המיטומטר, יותר במיוחד הומאוסטזיס חלבון, חשוב, כמו רטבאליות ו dyshomeoאוסטזיס יכול להוביל נוירוניוון6,7,8. תאים מצוידים מנגנונים שונים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון, אחד להיות תגובת חלבון שפרש (upr) – מסלול קלאסי שבו אותות מן הרשתית רשתית פלזמית (ER) להפעיל אות תאיים מפלי, המוביל להמרה . תשובה9 לאורזה, מטזואים להציג תגובה דומה אובדן של הומאוסטזיס חלבון מיטוכונדריאלי, המכונה כביכול upr (uprmt)7,8. ג. אלגיה נראה האורגניזם הבזלי ביותר להיות מאומת ומוגדר היטב מסלולהר 7.

פונקציה/תפקוד של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות בתוך רשת גדולה יותר יכול להיות קשה להעריך בשל הקישוריות הפנימית שלהם ואת המורכבות3. עם זאת, יש לעיתים קרובות צורך ללמוד אוכלוסיות עצביים נפרדות בשל סוג תא מחלות ספציפיות עם פתווגיות מורכבות, כמו אלה הקשורים עם לקויי חלבון הומאוסטזיס הסלולר. בתוך C. אלאנים, אוכלוסיות נוירואליות מסוימות יכולות להיות מניפולציות גנטית המאפשרות התבוננות נתיישב בvivo. מערכת העצבים של C. אלגיה מורכבת בעיקר מנוירונים, עם אחוז קטן של תאים גליאל. ב תולעים דו-מיניים למבוגרים, ישנם כ 302 נוירונים, מחולק למעל 100 כיתות שונות2,10. נוירונים כגון cholinergic נוירונים להשתלט על הצמתים נוירוסקולריות, בעוד נוירונים דואמנרגיים מעורבים בעיקר תחושה10,11. כאשר הן פעילות מוטורית והן יכולות חישה לירידה עם הגיל, חשוב לפרט תובנות מכניסטיות על פגמים בנוירונים בודדים אלה11,12. ככזה, יש צורך בשיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד תאים שלמים של עניין למחקרים הבאים vivo ex.

כאן, אנו מתארים שיטה יעילה ממוטבת לבידוד מהיר של תאים עצביים ספציפיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מ -C. אלגיה. ניתן לבצע שיטת בידוד זו על תולעים, לקטינים או למבוגרים. בידוד של תאים מתולעי זחל פורסם בעבר על ידי ג'אנג ואח '13 ולא יידונו כאן. הערה חשובה כאן היא שכל התולעים צריכות להיות באותו שלב של החיים כדי למנוע העיכול של בעל החיים או זיהום מבעלי חיים בשלבי חיים שונים. באמצעות שיבושים אנזימטי ומכני של הקוטיקולה נמטודות, הגבוהה שלד חיצוני קולגן וחלבונים מבניים אחרים, מגוון רחב של תאים יכול להיות מבודד13,14. תאים לאחר מכן יכול להיות מבודד באמצעות cy, הזרמת לנסות או נוגדנים המסומנים חרוזים מגנטיים. בדרך כלל, רנ א מבודד באמצעות פנול ו guanidine isothiyanate שיטה כדי להבטיח את העשרת האוכלוסיה הרצויה של התאים15. עם טיפול הרבה תאים אלה מבודדים ניתן לשמור בבקבוקון תרבות או מרובת היטב צלחת. שיטה זו מייצגת כלי ייחודי ורב עוצמה במחקר של נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים חיים פונקציונלי עבור culturing נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ואיסוף של תולעים בגילאי לבידוד תאים

הערה: הסבר להלן הוא הבידוד של נוירונים cholinergic מן הטרנסגניים unc-17:: מאמץ GFP (OH13083) שהתקבלו מן המרכז הגנטי caenorהאבודיטיס (cgc) מאגר המתח באוניברסיטת מינסוטה. זה הכרחי לשמור על התנאים סטרילי כדי למנוע זיהום של פטריות או חיידקים.

  1. הכינו וסנכרן תולעים דרך שיטת הלבנת כמתואר על ידי T. Stiernagle16. עבור ניסויים הזדקנות, לוחית תולעים על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות המכילות 25 μm פתרון מים של פלואורודיט (fudr) כדי להפחית את ייצור ביצים לעצור בקיעה ביצה. בדוק צלחות אגר באופן קבוע כדי למנוע זיהום או הבקיעה ביצה כמו זה יגרום תוצאות לא אמינות.
    הערה: עבור unc-17:: תאים gfp, בדרך כלל 3 100 mm x 15 מ"מ לוחות ngm משמשים כדי לבודד כמות מספקת של תאים של ריבית16.
  2. איסוף תולעים והכנת מאגרים לבידוד תאים.
    1. לאסוף תולעים בצינור 15 מ ל חרוט. לשטוף תולעים מלוחית עם 1.5 mL של M9 מאגר (1 מ"מ MgSO4, 85 Mm הנאקל, 42 mm Na2hpo4· 7H2O, 22 מ"מ KH2PO, pH 7.0) ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,600 x g. להיפטר supernatant ולשטוף תולעים עם 1 mL של מאגר M9. חזור על צנטריפוגה ולשטוף סך של חמש פעמים כדי להסיר את הזיהום E. coli ככל האפשר.
      הערה: הוספת אנטיביוטיקה (50 μg/mL), כגון אמפיצילין, בשלב זה יכול לעזור להפחית זיהום חיידקי.
    2. עבור שני דגימות, להכין 2 מ ל נתרן dodecyl סולפט dithiopol (SDS-DTT) מאגר לליזה: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 מ"מ HEPES (pH 8.0), ו 3% (w/v) סוכרוז.
    3. הכינו 15 מ ל של מאגר בידוד (118 מ"מ, 48 mM KCl, 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2, 25 מ"מ hepes [pH 7.3]) ולאחסן אותו על הקרח.
      הערה: מאגר הפירוק ומאגר הבידוד של ה-SDS-DTT חייבים להיות טריים לפני כל ניסוי.
  3. הפרעה לקוטיקולה ובידוד תא בודד
    1. בעלי חיים צנטריפוגה שנאספו בשלב 1.2.1 עבור 5 דקות ב 1,600 x g. הסר את כל supernatant ולהשעות תולעים ב 1 מ ל של M9 מדיה ולהעביר לצינור 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
    2. כדור גלולה תולעים עם צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 5 דקות.
    3. הוסף 200 μL של מאגר הליזה SDS-DTT לתולעים ו-דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תולעים צריך להיראות "winkled" לאורך הגוף אם מוצג תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: חשיפה ממושכת למאגר הליזה SDS-DTT עלולה לגרום למותם של תולעים, שניתן לנטר על-ידי התבוננות בתולעים. תולעים כי הם מתים יהיה האריך ולא תלתל.
    4. הוסף 800 μL של מאגר בידוד קר קרח ולערבב על ידי בעדינות מצליף צינור.
    5. התולעים גלולה עבור 1 דקות ב 13,000 x g ב 4 ° c, להסיר supernatant ולשטוף עם 1 מ ל של מאגר בידוד.
    6. חזור על שלב 1.3.5 למשך חמש פעמים, והסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם.
    7. הוסף 100 μL של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus (15 מ"ג/mL) (טבלה של חומרים) הומס בידוד לתוך הגלולה ואת הדגירה עבור 10 עד 15 דקות ב RT.
      הערה: כמו עם מאגר הליזה SDS-DTT, עיכול הפרוטאז המורחבת עלול לגרום למחשוף מוגזם של חלבונים לאורך קרום הפלזמה, מניעת בידוד של פני השטח החשופים של GFP באמצעות חרוזים מגנטיים.
    8. במהלך הדגירה עם תערובת פרוטאז, להחיל שיבוש מכני על ידי ליטוף דגימות למעלה ולמטה נגד החלק התחתון של שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL עם טיפ 200 μL מיקרופיפטה עבור ~ 60 ל-70 פעמים. שמור את העצה הפיפטה נגד הקיר של שפופרת המיקרוצנטריפוגה עם לחץ תמידי כדי לנתק כראוי את התאים.
    9. כדי לקבוע את השלב של עיכול, להסיר נפח קטן (~ 1-5 μL) של תערובת העיכול, לזרוק אותו על שקופית זכוכית ולבדוק את זה באמצעות מיקרוסקופ תרבות רקמה. אחרי 5-7 דקות של דגירה, שברי התולעת צריך להפחית את הקוטיקולה בעליל ואת שאיפה של תאים יהיה גלוי בקלות.
    10. לעצור את התגובה עם 900 μL של מסחרית זמין L-15 בינוני ליבוביץ ' s בתוספת 10% העובר סרום (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין (הריכוז הסופי ב-50 U/mL פניצילין 50 μg/mL סטרפטומיצין).
    11. גלולה חלקים מבודדים ותאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. לשטוף את התאים מפלטד עם 1 מ ל של מדיה קר L-15-בתוספת יותר פעמיים כדי להבטיח כי פסולת עודף וקוטיקולה יוסר.
    12. השהה מחדש תאים מסוימים ב-1 מ ל של L-15-מדיה שיושלם ולעזוב על הקרח 30 דקות. קח את השכבה העליונה, כ 700-כ 800 μL, לצינור מיקרוצנטריפוגה. שכבה זו מכילה תאים ללא פסולת תא וישמשו בבידוד של תאים מעניינים בהמשך.
    13. לאחר הוראות היצרן, השתמש במונה תאים אוטומטיים או בהימוציטומטר כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 μL של תאים מבודדים.

2. בידוד תאים של GFP-חיוביים באמצעות הזרמת cy, או חרוזים מגנטיים anti-GFP

הערה: קיימות שתי שיטות שניתן לפרוס כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים. השיטה הראשונה היא להשתמש במיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS), בעוד השיטה השנייה משתמשת נוגדן מעלה חרוזים מגנטיים לתאי הבריכה ביטוי בונה פלזמה קרום מקומי החלבונים. השיטה האחרונה מחייבת את הלוקליזציה של GFP על קרום פלזמה, ובכך להיות זמין לאינטראקציה עם הנוגדן מצמידים חרוז מגנטי.

  1. בידוד של תאים של GFP-חיוביים על ידי הזרמת cy,
    1. מתוך השעיית תא מבודד שנאסף בשלב 1.3.12, תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות תאים מסוימים ב-L-15-בינוני בינונית לצפיפות התא של לא יותר מ 6 x 106 תאים/mL כדי למנוע העמסת יתר של הזרימה cytometer.
    2. מיין תאים על-ידי ביטוי של GFP-חיוביים באמצעות cytometer זרימה המסוגל למיין דגימות. ניתן להשתמש בתאים GFP-שליליים כפקד עבור ניתוח ספציפי של סוג שאינו של תא.
      הערה: כפי שהוזכר לעיל, גישה חלופית לבידוד תאים GFP-חיוביים ניתן להשתמש אם החלבון GFP-מתויג של עניין מקומי לקרום פלזמה של התאים. במקרה זה, הפרוטוקול המתואר בסעיף 2.2 יכול להיות מועסק.
  2. בידוד תאים של GFP-חיוביים באמצעות חרוזי אנטי-GFP מגנטיים
    1. מתוך השעיית תא מבודד שנאסף בשלב 1.3.12, תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. למחוק supernatant ולהשעות תאים ב 485 μL של L-15-בינוני מדיום. הוסף 15 μL של ddH2O שטוף מראש α-gfp נוגדן מצמידים חרוזים מגנטיים לפתרון.
    2. התאים המגנטית עם החרוז מגנטי להשתהות ב 4 ° צ' עבור 1 h עם מפנה עדין מאוד . הפעלה מוגזמת תגרום נזק לתאים.
    3. לאחר דגירה, מדגם צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c, ולאחר מכן לשטוף את הגלולה 2x עם 1 מ ל של L-15-בינוני כדי להסיר תאים gfp-שליליים.
  3. הדים של תאים מבודדים
    1. הצלחת תאים מבודדים לתוך לוחית סטרילית 6-היטב מולטי.
      הערה: לוחיות אלה עשויות להיות מצופות באמצעות בוטנים לקטין כדי להגדיל את הקובץ המצורף לתא; עם זאת, אם יש להשתמש בתאים באופן מיידי, שלב זה עשוי להיות התעלמו.
    2. מניחים את הצלחת לתוך מיכל פלסטיק ותאי דגירה ב 20 ° c עם מחיקה לח או נייר רקמה רכה (להוסיף 50 μg/mL אמפיצילין כדי ddH2O כדי להבטיח שום גידול חיידקי על לנגב) כדי להוסיף לחות לתאים. אין להרוס בחממה2 שכונתיות, כמו co2 רמות מוגבה עלול לפגוע בתאים.

3. הדמיה פלואורסצנט של תאים מבודדים של GFP-חיוביים

  1. הפעל את הנורה פלורסנט של מיקרוסקופ הפוך עם החזקה הפלואורסצנטית ולאפשר לו להתחמם במשך כ 10 דקות.
  2. הסרת תרבות התא מהאינקובטור והגדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך עם החזקה מלאה. החלק את המסנן GFP לתוך החריצים מתחת לשלב המיקרוסקופ.
  3. הצג את התאים בהגדלה של 50x. תאים מבודדים בהצלחה GFP-חיוביים יהיה גלוי בקלות. צלם תמונות באמצעות המצלמה המצורפים למיקרוסקופ.

4. הפקת רנ א מתאים מבודדים

הערה: החילוץ של RNA צריך להתבצע מיד לאחר בידוד התא כדי להבטיח איכות גבוהה של חומר. בודד RNA ניתן להשתמש כדי לייצר cDNA והמדידה הבאה של רמות תעתיק על ידי PCR כמותי (qPCR). כל הצינורות, טיפים, וריאגנטים צריך להיות RNase-חינם, ומרחב העבודה צריך להיות אתנול משטף לפני החילוץ RNA.

  1. מתאים מבודדים שנאספו בשלב 2.1.2, בתאי צנטריפוגה ב 1.5 mL סטרילי, RNase-מיקרוצנטריפוגה חינם tubefor 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c. אם התאים מבודדים באמצעות חרוזים מגנטיים, עקוב אחר אוסף התאים כאמור לעיל.
  2. באמצעות מיקרופיפטה, להסיר supernatant מצינור centrifuged מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 100 μL של M9 בינונית כדי לשטוף את L-15-בינוני. התאים צנטריפוגה 5 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c ולהסיר supernatant. כדי להבטיח את כל המדיה יוסרו, חזור על סך של שלוש שוטף בזהירות הסרת supernatant בכל פעם.
  3. הוסף 1 מ ל של פנול ו guanidine isothiocyanate פתרון (לוח חומרים) לתאים ופיפטה ההשעיה מעלה ומטה בזהירות. מודקון את התערובת ב RT עבור 5 דקות.
  4. לאחר הדגירה, להוסיף 250 פנול ו guanidine isothiyanate פתרון
  5. צנטריפוגה את הפתרון עבור 5 דקות ב 10,000 x g ב -25 ° c.
  6. בזהירות להסיר את החלק העליון של השכבה מימית עם מיקרופיפטה ככל האפשר, מבלי להפריע השכבות האורגניות התחתונות, ולהעביר את השכבה התחתונה לצינור חדש 1.5 mL RNase-מיקרוצנטריפוגה חינם. לצינור החדש, להוסיף 500 μL של איזופנול ולערבב על ידי היפוך הצינור. דגירה הפתרון הזה ב RT עבור 5 דקות.
  7. צנטריפוגה את הצינור ב 14,000 x g עבור 20 דקות ב 25 ° c.
  8. בעוד שמירה על הדגימות על קרח, להסיר כמו הרבה יותר איזופנול ככל האפשר עם מיקרופיפטה, ולהוסיף בעדינות 1 mL של 70% (v/v) אתנול ב RNase-חינם ddH2O לתוך השפופרת. הקפד לא להוציא את הפתרון ישירות על החלק התחתון של הצינור; להחיל תערובת אתנול/מים לצד הצינור.
  9. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ב 25 ° c.
  10. להסיר את רוב האתנול והאוויר יבש על הקרח עבור 3-5 דקות.
    הערה: יש להסיר את האתנול לאחר שלב זה; עם זאת, בדיקה זהירה של התחתון של הצינור חשוב כדי להבטיח שום אתנול לא נשאר.
  11. לאחר הצינור הוא מיובש באוויר, להוסיף 15 של20 μL של RNase-חינם ddH2O ולמדוד ריכוז RNA וטוהר באמצעות ספקטרוסקופיה ב 260 ננומטר גל. את טוהר המדגם יש למדוד כיחס 260 ננומטר/280 ננומטר. יחס זה אמור להיות בקירוב > 2.
    הערה: RNA מבודד יכול להיות קפוא ומאוחסן ב-20 ° c. זה, עם זאת, מועדף מאוד להשתמש ערכת סינתזה cDNA בהקדם האפשרי כדי להבטיח ייצור cDNA באיכות גבוהה. ה-PCR הכמותי יכול לעקוב אחר הוראות שסופקו על ידי יצרן הציקלהטרטרנר המשמש במעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד ספציפי של unc-17:: gfp-חיוביות cholinergic הנוירונים מתוך C. אלגיה עבור מחקרים עתידיים לשעבר vivo כגון סוג תא ספציפי ביטוי גנים פרופיל ובסופו של דבר למידה קצרת-טווח למדידות מהדק-אלקטרופיזיולוגיה.

איור 1 מציג unc-17:: gfp-חיובי cholinergic נוירונים בסביבה הרגילה שלהם. הגן ה -unc 17 מתבטא ברחבי הגוף והקודים של ה- C. אלגיה לשיגור ממברנה של אצטילכולין מולקולרית17. הביטוי של הגן הזה יכול להיות נצפתה בראש, באמצע הגוף, הנוירונים המוח והתחזיות העצב.

איור 2A מציג סקירה ציורית של הליך בידוד תא העצב המתואר בסעיף השיטות. שלב ראשון הוא לסנכרן. ולהתרבות עם התולעים בנוסף, איור 2B מראה מיקרוגרפים מייצגים של הנציגה של unc-17:: הנוירונים gfp-חיוביים לאחר בידוד, כמו גם שליטה שלילית בהתאמה מן N2 פראי בעלי חיים סוג. תאים מבודדים יכולים להישאר בחיים עד 3 ימים, כאשר יושלם עם L-15 בינוני של ליבוביץ ' ו 10% FBS.

איור 3 מראה נתונים מייצגים של qpcr מ-gfp המבטא נוירונים cholinergic, כמו גם בתאי השריר gfp-ביטוי. לאחר מיון מוצלח של תאים על ידי אחת השיטות, RNA היה מבודד באמצעות פנול ו guanidine isothiate שיטה לאחר אשר cDNA הופק באמצעות ערכת סינתזה. ביטוי של cholinergic נוירונים-גנים ספציפיים, tph-1 ו snb-1, טריפטופן הידרוקסילז ו המוביל שלפוחית סינפטית, בהתאמה, הוא גבוה ב -unc-17::התאים gfp מבודדים אך אינו נוכח myo-3::gfp תאים מבודדים. ההופכי הוא נכון עם הביטוי של תעתיק הרירן שרשרת כבד של myo-2. הביטוי של הגן האחרון מוגבל לתאי שריר מבודדים אך לא תאים cholinergic מבודדים.

Figure 1
איור 1: תמונה משוחזרת של נוירונים cholinergic בעלי חיים בעלי סוג פראי בן יום בעלי הביטוי unc-17:: כתבת gfp. התמונה הורכבה מארבע תמונות שונות של קרינה פלואורסצנטית של אותה תולעת, המכסה את אורך החיה כולה. סרגל קנה המידה של כל תמונה בודדת הוא 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת העבודה של בידוד התא ונציג GFP ביטוי תאים מבודדים unc-17::מתח gfp. (א) תהליך העבודה הסכמטי התיאור לבידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות המועשרת ב -unc-17:: gfp-הביע cholinergic נוירונים מפני זנים מיוחדים של ה -C. אלגיה . (ב) מציג תמונות של קרינה פלואורסצנטית המציגה נוכחות של האות gfp ב-unc מבודד- 17:: תאים gfp-חיוביים. שים לב שהתמונה מציגה מטוס מוקד אחד. סרגל קנה מידה = 10 μm. איור 2B מועתק באישור מכתב העת למדעי התא ופורסם על ידי גרמניה ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח מייצג qPCR של הסמנים הספציפיים unc-17-תא (tph-1, unc-47 ו -snb-1) בבעלי חיים שלמים לעומת unc-17:: תא עיתונאי gfp מבודד המאשר העשרה ספציפית של cholinergic נוירונים. בעלי עניין פקדים שליליים נוספים המשמשים כאן היו myo-3:: gfp כתב-ביטוי תאי שריר, אשר היה מבודד בעקבות הפרוטוקול אותו. הצגת נתונים ערכים ± SD (n = 3 משכפל ביולוגי). * p < 0.05; * * p < 0.01; p < 0.001 על ידי לזווג t מבחן. דמות זו שונתה מגרמניה ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל התולעים העגולות הוא דגם מבוסס ועוצמתי לחקר בריאות ומחלות עצביים2. עם כלים גנטיים בשפע כדי לתמרן בעלי חיים אלה וכמות לניהול של סוגים שונים של נוירונים ממופה בדיוק, מידע רב ניתן לאסוף עם כמות קטנה יחסית של חומר. כאן, אנו מתווה שיטה ממוטבת כדי לבודד נוירונים שונים מחיות שלמות. על ידי שיבוש חלבונים החיצוני של התולעת קוטיקולה, שאיפה של סוגי תאים שונים ניתן לבודד, כולל נוירונים ותאי שרירי5. תאים מבודדים אלה ניתן להשתמש בהמון ניסויים ייחודיים. היכולת להשתמש או מיון התא באמצעות cy, שימוש באמצעות הנוגדן או מחרוזות מגנטי התווית מאפשר טכניקה מסתגלת תלוי הפרמטרים של ניסוי ספציפי. חילוץ RNA מסוג תא מסוים של C. אלגיה מאפשר גם בדיקה יסודית יותר והבנה מכניסטית של תהליכים סלולאריים שונים.

ישנם צעדים קריטיים שנדונו כאן אשר חייב להיות מקרוב: 1) הזדקנות וקצירת תולעים האכיל היטב מ 25 μM לוחות FuDR; 2) זמן בדגירה של SDS-DTT או טיפול עם תערובת פרוטאז; 3) מבחר של תאים GFP-חיוביים. ראשית, במהלך הזדקנות של תולעים, זה הכרחי להיות חרוץ כדי להבטיח כי כל הביצים הניח לא לבקוע, כמו זה יגרום גיל טרוגניות בתולעים שנאספו, גרימת שינויים משמעותיים בנתונים. הצעדים לשטוף כאשר קצירת תולעים לבידוד נחוצים גם כדי להבטיח כי כל בעלי חיים מתים או לא בוגרים לא ייאספו. שנית, דגירה מוגזמת של תולעים במאגר SDS-DTT יכול לגרום לפירוק בלתי רצוי של רכיבים סלולריים חשובים ורעילות לתולעים, מניעת בידוד של סוגי תאי היעד. שמירה על הכדאיות הסלולרית חיונית להפקת רנ א מוצלחת או לטווח קצר של תאים מבודדים. מכיוון שרוב התאים העצביים עדינים, הטיפול קשה מדי במהלך או מאגר SDS-DTT או הטיפול בתערובת פרוטאז יכול לגרום נזק מסיבי לתאים אלה. אם מסלול התגובה לחץ הוא היעד של הניסוי, התנאים של incubations עשוי להיות מעט שונה כמו כוח מאוד מוגבר של DTT עלול לגרום ביטוי משופר של הגנים מסוימים תגובת הלחץ. במקרה זה, חשוב לשטוף בהצלחה את כדורי התאים עם L-15-בינוני כדי לעצור את התגובה ובמהירות לספק מחדש את התאים עם חומרים מזינים. לבסוף, בחירה קפדנית של צעד הבחירה המתאים ביותר לסוג התא של הריבית תאפשר התאוששות מקסימלית של תאים אלה. באופן דומה, בהתחשב בהתאמה התאית של סמנים ספציפיים לסוג תא, עשויים לסייע לחוקרים לבחור את הגישה המיטבית להעשרת התאים. באמצעות הזרמת cy, לנסות להניב תרבות תא אחידה ומעשית יותר, בעוד שימוש בחרוזי אנטי-GFP מגנטיים הוא פחות זמן רב ועבודה אינטנסיבית.

חשוב לציין כי השיטה המתוארת כאן יש כמה מגבלות. ראשית, ביטוי חזק של GFP בסוגי התא הרצוי צריך להיות מאומת כדי להבטיח בידוד מתאים על ידי FACS או נוגדן מצמידים חרוזים מגנטיים. שנית, אפילו הפרעה לקוטיקולה עדין יכול להוביל לתשואה ירודה או אפילו לאובדן של תאים מסוימים קיר הגוף, או אחרים נמוך-שפע אוכלוסיות התאים כגון נוירונים -1 הדואמנרגיים. בעת בחירת סוגי תאים, סוג התא שופע יותר יכול בדרך כלל לספק תשואה מוצלחת יותר. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה זו לבידוד של אוכלוסיות מסוג תאים פחות שופע גם כן.

לסיכום, ההליך הנדון במאמר זה מציג שיטה יעילה של הוצאה ובידוד של סוגי תאים בודדים מתוך התולעיםהעגולות. השיטה חזקה מספיק כדי לאפשר את החילוץ של RNA, ולאחר מכן פרופיל גנים, ורגיש מספיק כדי לאפשר טיפוח של תאים מבודדים. למרות שמתודולוגיה מדויקת המשמשת לבידוד קבוצות מסוימות של תאים עשויה להשתנות בין סוגי תאים שונים, זרימת העבודה המתוארת בדוח זה יעילה בדרך כלל וניתן להחילם על כל סוגי תאי התולעת באופן כמעט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לד ר ג'ניפר פוקס ולחברי מעבדת ח'אימונצ'וק להערות תובנה. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (R01 GM108975 כדי בסדר ו T32 GM107001-01A1 ל E.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Fisher Scientific 12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade VWR A0930
CaCl2 Sigma C5670
Chloroform Sigma 496189
Contess Automated Cell Counter Invitrogen Z359629
DTT USBiological D8070
Ethanol Decon Labs 2701
FBS Omega Scientific FB-02
Fluorodeoxyuridine Sigma F0503
HEPES Sigma H3375
Isopropanol VWR BDH1133
KCl Amresco O395
KH2PO4 USBiological P5110
Kimwipes Kimberly-Clark Professionals 7552
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
MgCl2 Sigma M8266
MgSO4 USBiological M2090
Na2HPO4·7H2O USBiological S5199
NaCl VWR X190
NaOCl (Bleach) Clorox
NaOH Amresco O583
Penicillin-Streptomicen Fisher Scientific 15140122
Peptone Y USBiological P3306
Pronase E Sigma 7433 protease mixture from Streptomyces griseus
SDS Amresco O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope Tritech Research
Sucrose USBiological S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit ThermoFisher 12594025
TRIzol Invitrogen 15596026 phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain Invitrogen T10Z82
α-GFP magnetic beads MBL D153-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
  3. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
  5. Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
  6. Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
  7. Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
  8. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
  9. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  10. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
  11. Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
  12. Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
  13. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
  14. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
  15. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
  16. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
  17. Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 150 C. אלגיה בידוד תאים נוירונים הזדקנות סמנים עצביים חלבון פלורסנט ירוק
בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא <em></em> העצב מתוך האלאנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Germany, E. M., Zahayko, N.,… More

Germany, E. M., Zahayko, N., Khalimonchuk, O. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (150), e60145, doi:10.3791/60145 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter