Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.
Abstract
Durante o processo de envelhecimento, muitas células acumulam altos níveis de danos que levam à disfunção celular, que está subjacente a muitas condições geriátricas e patológicas. Os neurônios pós-mitóticos representam um tipo de célula principal afetado pelo envelhecimento. Embora existam vários modelos de mamíferos de envelhecimento neuronal, eles são desafiadores e caros para estabelecer. O lombriga Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para estudar o envelhecimento neuronal, como estes animais têm tempo curto, uma caixa de ferramentas genética robusta disponível, e sistema nervoso bem catalogado. O método aqui apresentado permite a isolação sem emenda de pilhas específicas baseadas na expressão de uma proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Linhas de animais transgênicas expressando GFP distintos, os promotores específicos do tipo celular são digeridos para remover a cutícula externa e suavemente interrompidas mecanicamente para produzir chorume contendo vários tipos de células. As células de interesse são então separadas de células não-alvo através de triagem de células ativadas por fluorescência, ou por anti-GFP-acoplado contas magnéticas. As pilhas isoladas podem então ser cultivadas por um tempo limitado ou ser usadas imediatamente para análises ex vivo Cell-specific tais como a análise transcricional pelo PCR quantitativo do tempo real. Assim, este protocolo permite a análise rápida e robusta de respostas Cell-specific dentro das populações neuronal diferentes em C. elegans.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, o modelo metazoários organismo Caenorhabditis elegans tem sido um trunfo tremendo no estudo de neurônios, circuitos neuronais e seu papel em respostas fisiológicas e comportamentais, e envelhecimento associado neurodegenerativa Doenças. Uma característica única de C. elegans é que os animais são transparentes, permitindo que a linhagem de todas as células somáticas adultas seja mapeada1. C. elegans também abriga a quantidade gerenciável de neurônios, levando à morfologia e conectividade do sistema nervoso sendo bem compreendido2. A linhagem de células invariantes, o tempo curto e a abundância de ferramentas genéticas de alta produtividade disponíveis para C. elegans fazem dele um organismo modelo ideal para o estudo do envelhecimento dentro de diferentes populações neuronais.
O envelhecimento dos neurônios e as desordens neurodegenerativas são complexos, e cada desordem tem as assinaturas patológicas originais associadas com ela. No entanto, para muitas dessas desordens, como a doença de Parkinson e de Alzheimer, uma característica comum é a carga progressiva de proteínas desdobradas3,4,5. Em ambas as doenças, as proteínas dobram e agregam dentro da célula para causar toxicidade, levando, em última análise, à morte celular4,5. Para o envelhecimento adequado dos neurônios, a homeostase das mitocôndrias, mais especificamente a homeostase proteica, é importante, pois as perturbações e a distonostase podem levar à neurodegeneração6,7,8. As pilhas são equipadas com os vários mecanismos para manter a homeostase da proteína, uma que é a resposta desdobrado da proteína (UPR) ― uma via clássica onde os sinais do retículo endoplasmático (er) ativam cascatas intracelular do sinal, conduzindo a um transcricional a resposta9. Semelhante a este UPRer, metazoários mostrar uma resposta semelhante à perda de homeostase da proteína mitocondrial, o chamado UPR mitocondrial (UPRMT)7,8. C. elegans parece ser o organismo mais basal para teruma via de elevação confirmada e bem definida do RCQ7.
A função/disfunção de populações neuronais específicas dentro de uma rede maior pode ser difícil de avaliar devido à sua conectividade intrínseca e complexidade3. No entanto, muitas vezes há a necessidade de estudar populações neuronais distintas devido a doenças específicas do tipo celular com patologias complexas, como as associadas à homeostase da proteína celular prejudicada. Em C. elegans, populações neuronais específicas podem ser geneticamente manipuladas permitindo a observação facile in vivo. O sistema nervoso de C. elegans consiste principalmente de neurônios, com uma pequena percentagem de células gliais. Em vermes hermafroditas adultos, existem aproximadamente 302 neurônios, subdivididos em mais de 100 classes diferentes2,10. Neurônios como os neurônios colinérgicos predominam nas junções neuromusculares, enquanto os neurônios dopaminérgicos estão principalmente envolvidos na sensação10,11. Como a atividade motora e as habilidades sensoriais diminuem com a idade, é importante detalhar insights mecanísticos sobre defeitos nesses neurônios individuais11,12. Como tal, há uma necessidade para um método simples e robusto isolar pilhas intactas do interesse para estudos ex vivo subseqüentes.
Aqui, nós descrevemos um método eficaz aperfeiçoado para a isolação rápida de pilhas neuronal específicas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de isolamento pode ser realizado em larvas larvares, juvenis ou adultas. A isolação das pilhas dos sem-fins larval foi publicada previamente por Zhang et al.13 e não será discutida aqui. Uma nota importante aqui é que todos os vermes precisam estar no mesmo estágio de vida para evitar a digestão do animal ou a contaminação de animais em diferentes estágios de vida. Através do rompimento enzimático e mecânico da cutícula do nematódeo, um exoesqueleto alto em colágeno e outras proteínas estruturais, uma grande variedade de células pode ser isolada13,14. As pilhas podem então ser isoladas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos etiquetados anticorpo. Tipicamente, o RNA é isolado através de um método do isotiocianato do phenol e do guanidina para assegurar o enriquecimento da população desejada da pilha15. Com muito cuidado estas pilhas isoladas podem ser mantidas em um balão da cultura ou em um prato do multi-poço. Este método representa uma ferramenta única e poderosa no estudo de neurônios específicos e tem a capacidade de isolar células ao vivo e funcionais para uma maior cultura.
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Protocol
1. preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular
Nota: explicado abaixo é o isolamento de neurônios colinérgicos da linhagem transgênica UNC-17:: GFP (OH13083) obtida do repositório de estirpe Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na Universidade de Minnesota. É imperativo manter condições estéreis para evitar a contaminação de fungos ou bactérias.
- Prepare e sincronize os vermes através do método de branqueamento conforme descrito por T. Stiernagle16. Para experimentos de envelhecimento, vermes de placa em placas de meio de crescimento de nematoides (NGM) contendo 25 μM de solução de água de fluorodeoxiuridina (FuDR) para reduzir a produção de ovos e prender a eclosão de ovos. Inspecione as placas de agar regularmente para evitar contaminação ou incubação de ovos, pois isso causará resultados não confiáveis.
Nota: para as células UNC-17:: GFP, normalmente 3 100 mm x 15 mm ngm placas são utilizadas para isolar uma quantidade suficiente de células de juros16. - Colete worms e prepare buffers para isolamento de células.
- Colete vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7h2O, 22 mm KH2Po, pH 7,0) e centrifugador durante 5 min a 1.600 x g. Descarte o sobrenadante e lave os vermes com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover tanto quanto possível a contaminação de e. coli .
Nota: a adição de antibióticos (50 μg/mL), como a ampicilina, nesta etapa pode ajudar a reduzir a contaminação bacteriana. - Para duas amostras, preparar 2 ml de sódio Dodecil sulfato-dithiothreitol (SDS-DTT) tampão de Lise: 200 mm DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mm HEPES (pH 8,0), e 3% (w/v) sacarose.
- Prepare 15 mL de tampão de isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 25 mm hepes [pH 7,3]) e guarde-o no gelo.
Observação: o buffer de Lise SDS-DTT e o buffer de isolamento devem ser feitos de novo antes de cada experimento.
- Colete vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO4, 85 mm nacl, 42 mm na2HPO4· 7h2O, 22 mm KH2Po, pH 7,0) e centrifugador durante 5 min a 1.600 x g. Descarte o sobrenadante e lave os vermes com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover tanto quanto possível a contaminação de e. coli .
- Rompimento da cutícula e isolação da única pilha
- Centrifugar os animais recolhidos no passo 1.2.1 por 5 min a 1.600 x g. Remova todos os sobrenadantes e suspenda os vermes em 1 mL de mídia M9 e transfira para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Vermes da pelota com centrifugação em 1.600 x g por 5 min.
- Adicionar 200 μL de tampão de lise de SDS-DTT a vermes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Vermes devem parecer ser piscou ao longo do corpo, se visto um microscópio de luz.
Nota: a exposição prolongada ao tampão de Lise SDS-DTT pode resultar na morte de vermes, que podem ser monitorados observando-se vermes. Vermes que estão mortos vai alongar e não vai enrolar. - Adicione 800 μL de tampão de isolamento gelado e misture suavemente o tubo.
- Vermes de pellets por 1 min a 13.000 x g a 4 ° c, remover sobrenadante e lavar com 1 ml de tampão de isolamento.
- Repita o passo 1.3.5 para um total de cinco vezes, removendo cuidadosamente o buffer de isolamento de cada vez.
- Adicionar 100 μL de mistura de protease de Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela de materiais) dissolvido em tampão de isolamento para o pellet e incubar por 10 − 15 min em RT.
Nota: tal como com o tampão de Lise SDS-DTT, a digestão prolongada da protease pode resultar em uma clivagem excessiva de proteínas ao longo da membrana plasmática, impedindo a isolação da GFP exposta à superfície através de grânulos magnéticos. - Durante a incubação com mistura de protease, aplique o rompimento mecânico introduzindo amostras de pipetagem acima e para baixo de encontro à parte inferior do tubo do microcentrifugador de 1,5 mL com uma ponta da micropipeta de 200 μL para ~ 60 − 70 vezes. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo do microcentrifugador com pressão constante para desassociar corretamente pilhas.
- Para determinar o estágio da digestão, remova um volume pequeno (~ 1 − 5 μL) da mistura da digestão, deixe-o cair em uma corrediça de vidro e inspecione-o usando um microscópio da cultura do tecido. Após 5 − 7 min de incubação, os fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e uma pasta de células será prontamente visível.
- Reação de parada com 900 μL de meio L-15 de Leibovitz a frio disponível comercialmente suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) e penicilina-estreptomicina (concentração final em 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina).
- Fragmentos isolados de pellets e células por centrifugação por 5 min a 10.000 x g a 4 ° c. Lave as células peletizadas com 1 mL de mídia L-15-suplementada a frio duas vezes mais para garantir que o excesso de detritos e cutícula seja removido.
- Ressuscite células peletizadas em 1 mL de meios suplementados com L-15 e deixe no gelo por 30 min. Tome a camada superior, aproximadamente 700 − 800 μL, a um tubo do microcentrifugador. Esta camada contém células sem detritos celulares e será usada no isolamento subsequente de células de interesse.
- Seguindo as instruções do fabricante, use um contador de células automatizado ou hemocimetro para medir a densidade celular de 10 − 25 μL de células isoladas.
2. isolação de pilhas GFP-positivas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos do anti-GFP
Nota: existem dois métodos que podem ser implementados para isolar tipos de células específicas. O primeiro método é usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), enquanto o segundo método usa grânulos magnéticos conjugados por anticorpos para as células da piscina expressando proteínas distintas localizadas na membrana plasmática. O último método exige a localização do GFP à membrana de plasma, estando assim disponível para a interação com o grânulo magnético anticorpo-acoplado.
- Isolamento de células GFP-positivas por citometria de fluxo
- Da suspensão isolada da pilha coletada na etapa 1.3.12, as pilhas do centrifugador por 5 minutos em 10.000 x g em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e suspenda as células peletizadas em meio suplementado com L-15 a uma densidade celular não superior a 6 x 106 células/ml para evitar sobrecarregar o citometro de fluxo.
- Classifique as células pela expressão GFP-positive usando um citometro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como um controle para análise específica de tipo não celular.
Nota: como mencionado acima, uma aproximação alternativa para isolar pilhas GFP-positivas pode ser usada se a proteína GFP-etiquetada do interesse é localizada à membrana de plasma das pilhas. Neste caso, o protocolo descrito na seção 2,2 pode ser empregado.
- Isolação de pilhas GFP-positivas através dos grânulos magnéticos do anti-GFP
- Da suspensão isolada da pilha coletada na etapa 1.3.12, as pilhas do centrifugador por 5 minutos em 10.000 x g em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e suspenda as células em 485 μL de meio suplementado com L-15. Adicionar 15 μL de ddH2o pre-lavado α-GFP anticorpo-acoplado grânulos magnéticos à solução.
- Incubar as células com o cordão magnético a 4 ° c durante 1 h com giro muito suave. O torneamento excessivo danificará as células.
- Após a incubação, centrifugue a amostra por 5 min a 10.000 x g a 4 ° c, depois lave a pelota 2x com 1 ml de meio suplementado com L-15 para remover células GFP-negativas.
- Cultivo de células isoladas
- A placa isolou pilhas em uma placa multi-well estéril de 6 poços.
Nota: estas placas podem ser revestidas com o lectina do amendoim para aumentar o acessório da pilha; no entanto, se as células devem ser usadas imediatamente, esta etapa pode ser ignorada. - Coloque a placa em um recipiente plástico e incubar as células a 20 ° c com uma limpeza úmida ou papel de tecido mole (adicione 50 μg/mL de ampicilina a ddH2o para garantir que não haja crescimento bacteriano na limpeza) para adicionar umidade às células. Não incubar em uma incubadora do CO2 , porque os níveis elevados do co2 podem danificar as pilhas.
- A placa isolou pilhas em uma placa multi-well estéril de 6 poços.
3. imagem latente fluorescente de pilhas GFP-positivas isoladas
- Gire sobre a ampola fluorescente de um microscópio invertido com acessório da fluorescência e permita que aqueça acima por aproximadamente 10 minutos.
- Remova a cultura de pilha da incubadora e ajuste no estágio do microscópio invertido com acessório da florescência. Deslize o filtro GFP nas ranhuras o estágio do microscópio.
- Exiba as células com uma ampliação de 50x. Células GFP-positivas isoladas com sucesso serão prontamente visíveis. Tire fotos usando o acessório da câmera no microscópio.
4. extração de RNA de células isoladas
Nota: a extração de RNA deve ser realizada imediatamente após o isolamento celular para garantir a alta qualidade do material. O RNA isolado pode ser usado para produzir o cDNA e a medida subseqüente de níveis do Transcript pelo PCR quantitativo (qPCR). Todos os tubos, pontas, e reagentes devem ser RNase-livres, e o espaço de trabalho deve ser etanol-lavado antes da extração do RNA.
- A partir de células isoladas coletadas na etapa 2.1.2, as células centrífugas em um 1,5 ml estéril, RNase-Free microcentrífuga para 5 min em 10.000 x g a 4 ° c. Se as células são isoladas através de grânulos magnéticos, siga a coleção da pilha como indicado acima.
- Usando uma micropipeta, remova o sobrenadante do tubo de microcentrífuga centrifugada e adicione 100 μL de meio M9 para lavar o meio suplementado com L-15. Centrifugue as células 5 min a 10.000 x g a 4 ° c e retire o sobrenadante. Para garantir que todos os meios são removidos, repita para um total de três lavas cuidadosamente removendo sobrenadante cada vez.
- Adicionar 1 mL de fenol e solução de isotiocianato de guanidina (tabela de materiais) para as células e pipetar a suspensão para cima e para baixo com cuidado. Incubar a mistura em RT por 5 min.
- Após a incubação, adicionar 250 fenol e solução de isotiocianato de guanidina
- Centrifugue a solução durante 5 min a 10.000 x g a 25 ° c.
- Remova cuidadosamente o máximo da camada aquosa superior com uma micropipeta possível, sem perturbar as camadas orgânicas inferiores, e transfira a camada inferior para um novo tubo de microcentrífuga 1,5 mL RNase livre. Para o novo tubo, adicione 500 μL de isopropanol e misture invertendo o tubo. Incubar esta solução em RT por 5 min.
- Centrifugue o tubo a 14.000 x g durante 20 min a 25 ° c.
- Mantendo as amostras no gelo, remova o máximo de isopropanol possível com uma micropipeta e adicione suavemente 1 mL de etanol a 70% (v/v) em ddH2o RNase livre para o tubo. Certifique-se de não ejetar a solução diretamente na parte inferior do tubo; aplicar a mistura de etanol/água ao lado do tubo.
- Centrifugador a 10.000 x g durante 5 min a 25 ° c.
- Remova a maior parte do etanol e seque o ar no gelo por 3 − 5 min.
Nota: o etanol deve ser removido após esta etapa; no entanto, a inspeção cuidadosa da parte inferior do tubo é importante para garantir que nenhum etanol seja deixado. - Depois que o tubo é ar secado, adicione 15 − 20 μL de ddH RNase-livre2o e meça a concentração e a pureza do RNA usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nanômetro. A pureza da amostra deve ser medida como uma relação de 260 nm/280 nanômetro. Esta proporção deve ser de aproximadamente > 2.
Nota: o RNA isolado pode ser congelado e armazenado a-20 ° c. É, no entanto, altamente preferencial para usar um kit de síntese de cDNA o mais rapidamente possível para garantir a produção de cDNA de alta qualidade. O PCR quantitativo pode seguir usando as instruções fornecidas pelo fabricante do termociclador usado no laboratório.
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Representative Results
O protocolo descrito aqui permite o isolamento específico de UNC-17:: neurónios colinérgicos positivos do GFP da lombriga C. elegans para estudos ex vivo subsequentes, tais como perfil de expressão gênica específica do tipo celular e eventual cultivo de curto prazo para medições de eletrofisiologia de patch-Clamp.
A Figura 1 mostra os neurônios colinérgicos UNC-17:: GFP-positivos em seu ambiente normal. O gene UNC-17 é expresso ao longo do corpo C. elegans e códigos para um transportador de transmembrana de acetilcolina vesicular17. A expressão deste gene pode ser observada nos neurônios da cabeça, do midbody, e da cauda e nas projeções do neurônio.
A Figura 2a mostra um panorama pictórico do procedimento de isolamento do neurônio descrito na seção de métodos. A etapa um é sincronizar e cultura os sem-fins. Adicionalmente, a Figura 2b mostra micrografias de fluorescência representativas de UNC-17:: neurônios GFP-positivos após isolamento, bem como respectivo controle negativo de animais do tipo selvagem N2 não modificados. Células isoladas podem permanecer vivas até 3 dias, quando suplementados com o meio L-15 de Leibovitz e 10% FBS.
A Figura 3 mostra dados representativos de qPCR de GFP expressando neurônios colinérgicos, bem como células musculares expressando GFP. Após a triagem bem-sucedida das células por qualquer método, o RNA foi isolado por meio de um método de isotiocianato de fenol e guanidina, após o qual o cDNA foi produzido usando um kit de síntese. A expressão de genes Neuron-específicos colinérgicos, TPH-1 e SNB-1, um hidroxilase de triptofano e transportador de vesículas sinápticas, respectivamente, é elevada em UNC-17::GFP células isoladas, mas não está presente em Myo-3::GFP células isoladas. O inverso é verdadeiro com a expressão do transcrito muscular-específico da cadeia pesada do miosina de Myo-2. A expressão do último gene é limitada às pilhas de músculo isoladas mas não às pilhas colinérgicos isoladas.
Figura 1: imagem reconstruída de neurônios colinérgicos em animais transgênicos de tipo selvagem de um dia de idade expressando UNC-17:: repórter do GFP. A imagem foi montada de quatro imagens confocais separadas da fluorescência do mesmo sem-fim, cobrindo o comprimento do animal inteiro. A barra de escala de cada imagem individual é de 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fluxo de trabalho de isolamento celular e células expressando GFP representativas isoladas da cepa UNC-17::GFP. (A) representação de fluxo de trabalho esquemático para o isolamento de populações de células específicas enriquecidas em UNC-17:: GFP-expressando neurônios colinérgicos das respectivas cepas transgênicas C. elegans . (B) imagens de fluorescência representativas mostrando a presença de sinal de GFP no isolado UNC-17:: células positivas para GFP. Observe que a imagem mostra um único plano focal. Barra de escala = 10 μm. A figura 2B é reproduzida com a permissão do Journal of Cell Science e foi publicada pela Alemanha et al.12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de qPCR representativa de marcadores específicos de UNC-17-neurónios (TPH-1, UNC-47 e SNB-1) em animais inteiros versus UNC-17:: isolados de células de repórter GFP confirmando enriquecimento específico de colinérgico neurônios de interesse. Os controles negativos adicionais usados aqui eram Myo-3:: GFP que expressam o repórter-pilhas do músculo, que tinham sido isoladas seguindo o mesmo protocolo. Os dados mostram valores médios ± DP (n = 3 repetições biológicas). * p < 0, 5; * * p < 0, 1; p < 0, 1 por teste t pareado. Este número foi modificado de Germany et al.12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A lombriga C. elegans é um modelo bem estabelecido e poderoso para estudar a saúde neuronal e doença2. Com amplas ferramentas genéticas para manipular esses animais e a quantidade gerenciável de vários tipos de neurônio mapeados precisamente, uma grande quantidade de dados pode ser coletada com uma quantia relativamente pequena de material. Aqui, Delineamos um método otimizado para isolar neurônios distintos de animais inteiros. Interrompendo as proteínas da cutícula externa do verme, uma pasta de vários tipos de células pode ser isolada, incluindo neurônios e células musculares5. Estas células isoladas podem ser usadas em uma infinidade de experimentos únicos. A capacidade de usar qualquer célula de triagem através de citometria de fluxo ou de anticorpo-rotulados contas magnéticas permite uma técnica adaptativa dependente dos parâmetros de experimento específico. Extrair o RNA de um tipo específico da pilha de C. elegans igualmente permite um exame mais completo e uma compreensão mecanicista de vários processos celulares.
Há etapas críticas aqui discutidas que devem ser seguidas de perto: 1) envelhecimento e colheita de vermes bem alimentados de placas de 25 μM FuDR; 2) tempo na incubação de SDS-DTT ou tratamento com mistura de protease; 3) seleção de células GFP-positivas. Primeiro, durante o envelhecimento dos vermes, é imperativo ser diligente para garantir que todos os ovos colocados não eclodirem, pois isso causará heterogeneidade etária nos vermes coletados, causando variabilidade significativa nos dados. As etapas da lavagem ao colher sem-fins para a isolação são igualmente necessárias assegurar-se de que todos os animais inoperantes ou imaturos não sejam recolhidos. Em segundo lugar, a incubação excessiva de vermes no tampão SDS-DTT pode causar desagregação indesejável de importantes componentes celulares e toxicidade para os vermes, impedindo o isolamento de tipos de células-alvo. Manter a viabilidade da pilha é essencial para a extração bem sucedida do RNA de ou de cultivo a curto prazo mais adicional de pilhas isoladas. Porque a maioria das células neuronais são delicados, tratamento excessivamente áspero durante o tampão SDS-DTT ou o tratamento de mistura de protease pode resultar em danos maciços a estas células. Se uma via de resposta ao estresse for o alvo do experimento, as condições das incubações podem ser ligeiramente alteradas, pois o poder altamente redutivo do TDT pode causar uma expressão aprimorada de certos genes de resposta ao estresse. Neste caso, é importante para lavar com sucesso as pelotas da pilha com o meio L-15-suplementado para travar a reação e para reabastecer rapidamente as pilhas com os nutrientes. Finalmente, escolher cuidadosamente qual etapa de seleção é mais apropriada para o tipo de célula de interesse permitirá a recuperação máxima dessas células. Do mesmo modo, considerar a localização celular de marcadores tipo-específicos da pilha pode ajudar investigadores a escolher a aproximação a mais óptima do enriquecimento de pilha. O uso de citometria de fluxo produzirá uma cultura celular mais homogênea e viável, enquanto o uso de grânulos magnéticos anti-GFP é menos demorado e trabalhoso.
É importante notar que o método descrito aqui tem algumas limitações. Primeiramente, a expressão robusta de GFP em tipos desejados da pilha deve ser verificada para assegurar o isolamento apropriado por FACS ou por grânulos magnéticos anticorpo-acoplados. Em segundo, mesmo a interrupção delicada da cutícula pode conduzir a um rendimento pobre ou mesmo à perda de determinadas pilhas da parede do corpo, ou a outras populações da pilha da baixo-abundância tais como os neurônios de dat-1 dopaminérgicos. Ao escolher tipos de células, o tipo de célula mais abundante geralmente pode fornecer um rendimento mais bem-sucedido. No entanto, este método pode ser usado para o isolamento de populações de células de tipo menos abundantes também.
Em síntese, o procedimento discutido neste artigo apresenta um método efetivo de extração e isolamento de tipos de células individuais a partir da lombriga C. elegans. O método é robusto o suficiente para permitir a extração de RNA, e subsequente perfil genético, e sensível o suficiente para permitir o cultivo das células isoladas. Embora a metodologia exata utilizada para isolar grupos específicos de células pode variar entre diferentes tipos de célula, o fluxo de trabalho descrito neste relatório é geralmente eficaz e pode ser aplicado a praticamente todos os tipos de células Worm.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Jennifer Fox e aos membros do laboratório Khalimonchuk por comentários perspicazes. Reconhecemos o apoio dos institutos nacionais de saúde (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
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