Summary
Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.
Abstract
MikroRNA'ların (miRNA'ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA'nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA'nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA'ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA'lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.
Introduction
miRNA'lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz1,2,3, kanser dahil4,5. Bu küçük boyutu6dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez7, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim8. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir9. Bu yöntemin amacı ilk olarak belirli hücresel fonksiyonlar için sinerjik olarak ilgili miRNA gruplarını tanımlamak için bir strateji tanımlamaktır. Sonuç olarak, bu tür miRNA kombinasyonlarının downstream çalışmalarda ve uygulamalarda yeniden kurulması için bir strateji sağlar.
Bu yöntem, birden fazla miRNA'nın aynı anda fonksiyonel analizini sağlar, çok sayıda mRNA'yı eşzamanlı olarak hedeflemelerinden yararlanarak hastalıkların karmaşık manzaralarını özetlemektedir. Bu yaklaşım son zamanlarda üç miRNA'lardan oluşan bir grubu tanımlamak için kullanılmıştır ki 1) aynı anda beyin kanserinde göz denir ve 2) sinirsel farklılaşma sırasında güçlü bir ko-ekspresyon paterni göstermek yanı sıra radyasyon veya bir genotoksik strese yanıt olarak DNA alkilleyici ajan. Üç miRNA'dan oluşan bu modülün, aşağıda açıklanan kümeleme yöntemi ile kombinatoryal yeniden ekspresyonu, kanser hücrelerinin biyolojisi ile derin bir girişimle sonuçlanır ve klinik öncesi çalışmalar için gen terapisi stratejisi olarak kolayca kullanılabilir10. Bu protokol miRNA araştırmave çeviri uygulamaları dahil olanlar için özel ilgi olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Glioblastoma'da Fonksiyonel İlişkili MiRNA'ların Karakterizasyonu
- Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi
- İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:
- Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için11.
- Taze bir operatif numuneden mikrodizi analizi yapın12.
- Daha önce yayımlanmış veri kümelerini kullanın13.
NOT: Hangi yöntem seçilirse seçilsin, çıktı, ekspresyonu tümör biyolojisi ile istatistiksel olarak ilişkili (doğrudan veya ters) miRNA'ların toplu kümesini sağlar. Bu ilk grup, aşağıda açıkıldığı gibi ifade değişikliklerinin daha dinamik bir çözümlemesi gerçekleştirerek en sıkı işlevsel ilişkilendirmeyi görüntüleyen bir miRNA alt kümesinin tanımlanması için daha fazla analiz edilen miRNA'lar havuzunu oluşturur.
- İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:
- Koşula özel miRNA ifade analizi
- Hücre farklılaşmasının indüksiyonu:
- Tek katmanlı bir kültürün oluşmasını sağlamak için önceden kaplanmış poli-D-lizin (PDL) plastik tabaklar kullanın. Bulaşık kaplaması için PDL'yi 100 μg/mL konsantrasyonda suda çözün. 25 cm2 yüzeyde 1 mL çözelti kullanın. PDL çözeltisi uygulamasından sonra PBS 6 h ile 2x durulayın.
- Eşit miktarlarda insan nöral kök hücreleri (100.000 hücre/5 mL) ya kök hücre orta (nörobazal orta + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF), astrositik farklılaşma ortamı (DMEM + 10% FBS) veya nöronal diferansiyasyon ortamı (nörobazal orta + B27 ek, + 2 μM retinoik asit)14. Oligodendrocyte farklılaşma protokolü IGF-1 eklenmesini gerektirir (200 ng / mL) EGF/ FGF kaldırmasonra 14,15.
- Hücre kaplamasonra, 37 °C, 5% CO21 hafta boyunca inkübatör yerleştirin.
- RNA çıkarma:
- 7 gün sonra, kuvözhücreleri çıkarın ve orta çıkarın.
- Hücreleri PBS (5 mL) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri lyse ve bir hücre kazıyıcı kullanarak 1,5 mL microfuge tüp içine hücreleri kazımak için lysis reaktif (Malzemeler Tablosubakınız) 1 mL ekleyin. Lysed hücreleri içeren tüpleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek toplam RNA yalıtımına devam edin.
- miRNA ifade analizi:
- Gerçek zamanlı PCR ile üç farklılaşma deseni arasında 1.1 adımda tanımlanan belirli miRNA'ların diferansiyel ifadesini, TaqMan probları kullanarak ve ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyon için üreticinin protokollerini izleyerek ölçün ( Şekil 1).
- Hücre farklılaşmasının indüksiyonu:
- MiRNA kümelerinin strese özel zorluklara göre doğrulanması
- Kültür G34 glioblastoma nörobazal ortamda kök benzeri hücreler + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF. 25 cm2 düşük eki şişede 5 mL'lik 1 x 106 hücre ile başlayın.
- Kaplamadan sonra 48 saat başlayarak, dna alkilleyici ajan temozolomide (TMZ) her 5 günde bir iki katına ekleyin, aşağıdaki gibi:
- 5 gün boyunca 5 μM ile başlayın. 5 gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile değiştirin, hayatta kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için. 48 saat sonra, 10 μM TMZ ekleyin ve başka bir 5 gün kuluçka.
- Tekrar adım 1.3.2.1, en az 100 μM konsantrasyonu ulaşılır ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar, her zaman IKI katına TMZkonsantrasyonu 10.
- Paralel bir deneyde, G34 hücrelerini aşağıdaki gibi ışınla:
- 25 cm2 düşük ek şişede 5 mL'de 1 x 106 hücrenin kaplamadan 48 saat sonra başlayan hücrelere 2 Gy enerji ile ışınlanır (foton emisyonu sağlayan herhangi bir ışınlayıcı kabul edilebilir). Hücreleri kuvöze geri ver ve rahatsız etmeyin. 48 saat sonra, ek 2 Gy enerji ile hücreleri tekrar ışın.
- Toplam 10 Gy enerji verilene kadar 1.3.3.1 4x adımını tekrarlayın.
- Hücreleri kuvöze geri verin ve aşağı analizden önce en az 5 gün boyunca taze ortamda iyileşmelerine izin verin.
- Direnç indüksiyonundan sonra, lysis reaktifi kullanarak hücreleri lyse ve üreticinin protokolüne göre toplam RNA ayıklayın.
- 1.1-1.2 bölümlerinde tanımlanan belirli miRNA'ların ifadesini adım 1.2.1'de açıklandığı gibi analiz edin (Şekil 2).
- Kümelenmiş miRNA'ların işlevsel yakınsamasının karakterizasyonu
- miRNA hedefleme tahmin araçları kullanılarak elde edilen 1.2-1.3 bölümlerinde tanımlanan her bir miRNA'nın öngörülen targetome'sini elde edin.
NOT: Algoritması periyodik olarak16olarak güncelleştirilir gibi biz genellikle TargetScan başvurmak. Ek tahmin araçları miRanda17, miRDB18, ve DIANA-miRPath19vardır. Tüm bu programlar ücretsiz, web tabanlı uygulamalardır.- Targetscan'ın ön sayfasından, önceden doldurulan açılır menüden ilgi miRNA'sını seçin. Gönder düğmesini tıklatın.
- İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedefler listesini elektronik tablo olarak indirin (Ek Şekil 1).
- Yanlış pozitif tahminler olasılığını azaltmak için, alt akış analizlerinde yalnızca korunan siteler sütunundaki hedefleri içerir. Ayrıca, ek miRNA tahmin programları (yukarıya bakın) kullanılarak ve yalnızca tüm algoritmalarda ortak olan hedefler de dahil olmak üzere daha fazla sıkılık elde edilebilir.
- Elde edilen targetomeleri, her miRNA'da yaygın olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için ToppGene Suite20 kullanarak Gene Ontoloji kategorilerine göre sınıflandırın.
- Giriş türü olarak HGNC sembolü kullanılarak "Eğitim gen kümesi" penceresinde 1.4.1 adımdan elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Gönder > Başlat'ıtıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli "Git" kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlayacaktır(Ek Şekil 2).
- Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi (bu durumda, kromatin düzenleme) düzenlenmesi için her miRNA katkısını kurmak için, belirli hücresel süreç dahil genlerin tam listesi ne karşı adım 1.4.1 elde edilen her targetome kontrol ( yani, kromatin regülasyonu), Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan Venn diyagramı işlevini kullanarak http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
NOT: Bu program aynı anda birden fazla grubun kesişmesine izin verir (Şekil 3). Her miRNA tarafından sağlanan belirli benzersiz hedefler daha sonra açıklamalı ve downstream fonksiyonel deneyler için seçilir.- Programın ön sayfasında, her bir miRNA veya ilgili pencerelere ilgi için hedef mRNA'lar varsa listeyi yükleyin veya kopyalayın/yapıştırın. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.
- Gönder'itıklatın. Program, her sektördeki gen lerin sayısının yanı sıra her alt küme ve kesişme kombinasyonları için mRNA'ların tam listesini içeren bir Venn diyagramının görsel çıktısını sağlayacaktır.
- miRNA hedefleme tahmin araçları kullanılarak elde edilen 1.2-1.3 bölümlerinde tanımlanan her bir miRNA'nın öngörülen targetome'sini elde edin.
2. MiRNA Modüllerinin PoliksitRonik Transgenik Kümeye Montajı
-
MiR-17-92 küme lokusuna göre transgenik iskele hazırlanması
- Ensembl genomtarayıcı21miR-17-92 kümesinin nükleotit dizisini edinin. Locusun altı kodlanmış miRNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem yukarı (5') hem de aşağı akım (3') dizilerini kapsayan ~800 baz çifti "çekirdek" dizisini seçin.
- Yukarıdaki sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.
- MiRBase22'dealarak altı doğal saç tokasının her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış "çekirdek" dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler, transgenin doğru işlenmesi için önemli olan spacer dizilerini temsil eder.
- Her saç tokasının 5' ve 3' uçlarında 3-5 nükleotit hariç, "çekirdek" dizisinden doğal saç tokası dizilerini çıkarın.
-
Birden fazla miRNA'yı kodlayan yeni bir transgen oluşturma
- MiRBase'den transjende aşırı ifade edilmesi amaçlanan miRNA'ların saç tokası dizilerini edinin. Mikroişlemci bölünmesinin olduğu belirli nükleotitleri dikkatlice not edin.
- Çıkarılan saç tokalarını (adım 2.1.4) adım 2.2.1'de elde edilen istenilen miRNA'ların saç toka dizileri ile değiştirin.
- Transgenin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek, tercih edilen teslimat vektörlerine ikame etmeyi kolaylaştırın. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.
- Negatif kontroller için, her olgun miRNA'nın doğal 20 nükleotit dizisini değiştirmek için 20 nükleotit şifreli diziler kullanın. bu karışık dizileri https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence gibi çevrimiçi bir aracı kullanarak oluşturun.
-
Transgenin iki boyutlu yapısını doğrulama
- RNA yapı tahmin yazılım programı RNAweb Fold23içine tam transgenik sırasını kopyalayın.
- Standart program ayarlarını kullanarak Devam et'itıklatın.
- Özellikle iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı ve mikroişlemci dekolte bölgesine yakın en az 11 nükleotit li çift iplikli kök yapının varlığı için grafik çıktısını analiz edin. Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğuna bakın (Şekil 4).
3. DNA Sentezi ile Transgen elde edilmesi
- İmrital miRNA kümesinin tasarımı ndan ve silico doğrulamasından sonra, ticari satıcılardan DNA sentezi kullanarak çalışma sırasını elde edin24 ve aşağı akım klonlama ile vektörler ve transgen teslimi ile devam edin. İn vitro doğum için lentiviral vektörler10 ve in vivo intrakranial doğum için adeno-ilişkili virüsler (AAV) kullandık25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi (Şekil 3). Sonuç olarak, miRNA'ların küçük boyutu ve basit biyogenezinden yararlanarak, bu protokolün ikinci bölümü glioblastoma hücrelerindeki üç miRNA'nın ekspresyonunu eş zamanlı olarak özetleyebilecek bir transgen(Şekil 4)tasarlamak için kullanılmıştır. hem in vitro hem de in vivo, tümör biyolojisinde önemli girişim ve gelecek vaat eden çevirisel uygulanabilirlik(Şekil 5A,B,C)10. Ayrıca, transgenik kümenin meme kanseri modelinde de fonksiyonel olduğu gösterilmiştir (Şekil 5D,E).
Şekil 1: Glioblastomada fonksiyonel bir miRNA modülünün karakterizasyonu. (A) İnsan glioblastom örneklerinde (n = 516) ve TCGA'dan alınan normal beyin (n = 10) ile farklı olarak ifade edilen miRNA'ları temsil eden volkan çizimi. Yeşil >4 kat fark ile miRNA'lar vardır. Kırmızı daire glioblastoma 10 en önemli downregulated miRNA'ları temsil eder. (B) Nöral kök hücrelerde farklı farklılaşma yollarının indüksiyonu sırasında (A)'da seçilen 10 miRNA'nın göreli ekspresyonu, nöral farklılaşma indüksiyonu sırasında miR-124, miR-128 ve miR-137 modüllerinin açık yukarı regülasyonunu gösterir. Ortalama ± Üç biyolojik kopyadan SD (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; Öğrencinin t-testi, iki kuyruklu). Bu rakam,10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Genotoksik stres sırasında miRNA modüllerinin ortak ifade desenlerinin doğrulanması. Multipl glioblastom hücreleri ve hücre hatlarında Şekil 1'de tanımlanan üç miRNA'nın göreli ekspresyonu (G62-mezenkimal; MGG4-proneural; U251, U87 pro-nöral benzeri, ve T98G mezenkimal benzeri glioblastoma hücre hatları) temozolomide direnç indüksiyon sonra (TMZ, pembe çubuklar) veya iyonlaştırıcı radyasyon (RT, yeşil çubuklar). Bildirilen iki bağımsız çoğaltmasSD ile anlamına gelir. Bu rakam,10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ortak ifade edilen miRNA'ların targetomlarının fonksiyonel yakınsamasının analizi. Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinden Venn diyagramı çıktısı, aynı anda etiketli miRNA'ların targetome'sini bir GO ilgi alanı oluşturan mRNA'larla (bu durumda kromatin represörleri) geçerek elde edilmiştir. tek miRNA'lar tarafından benzersiz olarak hedeflenen mRNA'lar daha ileri fonksiyonel çalışmalar için seçilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Üç miRNA kümesini kodlayan mühendislik miRNA dizisinin 2B yapısı. RNAweb Fold programından grafik çıktı. Transgen tarafından kodlanmış her bir miRNA'nın (miR-124, miR-128, miR-137) saç tokalarını temsil eden üç iyi tanımlanmış kök-döngü yapısının varlığına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Transgen işleme ve aşağı biyolojik etkisi nin kanıtı. (A) G34 glioblastoma hücrelerinin transgenik miRNA kümesi (Cluster 3) veya negatif kontrol (ctrl) ile lentiviral aracılı transdüksiyonundan sonra miRNA ekspresyonunun göreli niceliği. Rapor, negatif kontrol transgeni ve Küme 3 transgeni ifade eden G34 glioblastoma kürelerinin floresan mikroskobu resimleri ± SD. (B) Üç bağımsız deneyden elde edilen araçlardır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) İn vivo büyüme intrakranial insan G34 hücre ksenogreftleri ya kontrol ya da Küme 3 transgenes ifade. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam10izni ile çoğaltılmıştır. (D) MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin transgenik miRNA kümesi (Cluster 3) veya negatif kontrol (ctrl) ile lentiviral aracılı transdüksiyonundan sonra miRNA ekspresyonunun göreli nicel niceliği. (E) Negatif kontrol transgeni ve Cluster 3 transgene'yi ifade eden MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin floresan mikroskop görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Tüm deneyler triplicates (*p < 0.05; **p < 0.01; Öğrencinin t-testi, iki kuyruklu, birden fazla karşılaştırma). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: TargetScan iş akışı. (A) MiRNA araması için seçim seçeneklerini gösteren giriş sayfası ekran görüntüsü. (B) miR-137 için temsili arama sonuçları. Hedef genlerin listesi sol sütunda. Kırmızı kutu korunmuş hedefleme siteleri ile genleri gösterir (gerçek hedefleme daha yüksek güven düşündürmektedir). Bu rakamı görmek için lütfen buraya tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Şekil 2: ToppGene Suite iş akışı. (A) Analiz edilecek genlerin listesinin eklendiği arama kutusunu gösteren ana sayfa ekran görüntüsü. (B) MiR-137 targetome için temsili arama sonucu, en istatistiksel olarak anlamlı Gen Ontolojisi (GO) kategorilerini gösterir. Bu rakamı görmek için lütfen buraya tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, miRNA'ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır26. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA'ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece karakteristik miRNA saç tokasının mikroişlemci tarafından tanınması gerekli ve doğru miRNA işleme için yeterlidir27. Aynı zamanda, bu minimal gereksinim, herhangi bir teslimat vektörlerine sığdırılabilen kısa DNA dizileri içinde bulunan istenilen miRNA modüllerinin ifadesi için bir omurga olarak doğal olarak oluşan miRNA kümelerinin genetik iskelesinin kullanılmasını sağlar. seçim. Bu protokolün en önemli gereksinimi, saç tokası yapısının ve gövde bileşeninin yeterli uzunlukta olması ve uygun dekolteye izin vermektir.
Bu protokolün yürütülmesi ile ilgili iki önemli kritik hususlar vardır. İlk nokta, en uygun miRNA kombinasyonlarının doğru belirlenmesidir. Bu kontrollere göre sadece hücre veya dokuların miRNA ekspresyonu imzasının değil, aynı zamanda hücrelerin deneysel olarak manipüle edildiği eşzamanlı ifade değişikliklerinin dikkatli analizi ile belirlenir. Bir miRNA kümesi tanımlandıktan sonra, her birinin yapay modülasyonunun diğerlerinin ifadesini değiştirmediğini belirlemek de önemlidir.
İkinci kritik yönü yapay bu fonksiyonel miRNA kümeleme özetlemek için şimerik dizileri inşaat ile ilgilidir. Bu miRNA işleme mekanizmasının yapısal gereksinimlerine uymak için temel, hangi her miRNA saç toka18kökeninde uzun bir kök dizisi (en az 11 nükleotit ölçme) varlığı, hem de orijinal bakım yerli miRNA küme iskelesinin aralık dizileri. Deneyimlerimize göre, bu iki gereksinimin karşılanması sürekli olarak uygun RNA katlama(Şekil 4)ve başarılı multi-miRNA ekspresyonu ile sonuçlanmıştır.
Bu tekniğin en önemli sınırlaması, fonksiyonel bir transgende bir araya getirilebilen sonlu miRNA sayısıdır. Altı farklı miRNA'ya kadar aşırı ifade veren dizileri başarıyla tasarladık ancak saç tokalarının sayısı arttıkça işlem verimliliğinde bir miktar düşüş gözlemledik. Şimdiye kadar miR-17-92 kümesinin genetik yapısı kullanılmıştır, çünkü en kısa DNA dizisi içinde en yüksek saç tokası (altı) sayısını (~800 baz çifti)8. Diğer doğal miRNA kümeleri olduğu gibi, bu amaçla da kullanılabileceğini tahmin edilmektedir28. Son olarak, saç tokası arasındaki boşluk dizilerinin değiştirilmesinin işlemeyi azalttığı gözlenmiştir, bu nedenle yerel yapının ne ölçüde değiştirilebildiği konusunda bazı kısıtlamalar vardır.
Önerilen bu yöntemin en önemli ve avantajlı yönü, birden fazla istenilen miRNA'yı aynı anda aşırı eksprese edebilen transgenlerin mühendisliğinin esas olarak silico yaklaşımı yla, sıkıcı ve zaman alıcı moleküler klonlama adımları, daha önce açıklandığı gibi29,30,31. Açıklanan protokolün uygulanması kolaydır ve özel ekipman veya beceri gerektirmez.
MiRNA'ların moleküler biyolojideki bilinen önemi ve terapötik uygulamalardaki potansiyelleri göz önünde bulundurularak, bu protokol geniş bir araştırmacı kitlesinin ilgisini çekmaktadır. Bu yaklaşımın, miRNA'ların kombinarial özelliklerine odaklanan ve bunların yürütülmesi için basit ve sağlam bir araç olarak hizmet verecek gelecekteki çalışmaları teşvik etmesi beklenmektedir. Daha da önemlisi, bu kümelenmiş transgenler gen tedavisi vektörleri için ideal kargoları temsil eder. 3-miRNA kümesinin in vivo tesliminde başarılı olduğuna dair kanıtlar, AAV vektörlerinin (yayınlanmamış veriler) direkt intratümöral intrakraniyal enjeksiyonu ile elde edilmiştir. Bu nedenle bu tekniğin miRNA araştırmalarının çeviri yönlerini önemli ölçüde artıracağı tahmin edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.
Acknowledgments
Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
