Summary
Beskrivs här är ett protokoll för att karakterisera moduler av biologiskt synergistisk miRNAs och deras sammansättning i korta transgener, vilket möjliggör samtidig överuttryck för genterapi applikationer.
Abstract
MikroRNAs biologiska relevans i hälsa och sjukdom bygger i hög grad på specifika kombinationer av många samtidigt avreglerade miRNAs snarare än en enda miRNA-åtgärd. Karakteriseringen av dessa specifika miRNAs-moduler är ett grundläggande steg för att maximera deras användning i terapi. Detta är oerhört relevant eftersom deras kombinatoriska attribut kan utnyttjas praktiskt. Beskrivs här är en metod för att definiera en specifik miRNA signatur som är relevant för kontroll av onkogen kromatin repressorer i glioblastoma. Metoden definierar först en allmän grupp av miRNAs som avregleras i tumörer i jämförelse med normal vävnad. Analysen förfinas ytterligare genom differentiella odlingsförhållanden, vilket understryker en undergrupp av miRNAs som samuttrycks samtidigt under specifika cellulära tillstånd. Slutligen, miRNAs som uppfyller dessa filter kombineras till en konstgjord polycistronic transgener, som är baserad på en byggnadsställning av naturligt existerande miRNA kluster gener, sedan används för överuttryck av dessa miRNA moduler till mottagande celler.
Introduction
mirnas erbjuder en oöverträffad möjlighet att utveckla en bred genterapi metod för många sjukdomar1,2,3, inklusivecancer4,5. Detta är baserat på flera unika egenskaper hos dessa biologiska molekyler, inklusive deras lilla storlek6, Simple biogenes7, och naturlig tendens att fungera i förening8. Många sjukdomar kännetecknas av specifika miRNA uttrycksmönster, som ofta konvergera på regleringen av komplexa biologiska funktioner9. Syftet med denna metod är först att definiera en strategi för att identifiera grupper av miRNAs som är synergistiskt relevanta för specifika cellulära funktioner. Följaktligen ger det en strategi för återupprättandet av sådana miRNA kombinationer i nedströms studier och tillämpningar.
Denna metod möjliggör funktionell analys av flera mirnas på en gång, hävstångseffekt på deras samtidig inriktning av ett stort antal mRNA, således går igenom komplexa landskap av sjukdomar. Detta tillvägagångssätt har nyligen använts för att definiera en grupp av tre miRNAs som 1) är samtidigt nedreglerade i hjärncancer och 2) visar ett starkt Co-Expression mönster under neurala differentiering samt som svar på genotoxisk stress genom strålning eller en DNA-alkylerande medel. Det kombinatoriska omuttrycket av denna modul med tre miRNAs av den kluster metod som beskrivs nedan resulterar i djupgående ingrepp i cancercellernas biologi och kan lätt användas som en genterapi strategi för prekliniska studier10. Detta protokoll kan vara av särskilt intresse för dem som deltar i miRNA Research och dess translationella tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. karakterisering av funktionellt associerade miRNAs i glioblastoma
- Analys av brett differential miRNA uttryck i glioblastoma vs. Brain
- Bestäm först den mest signifikant avreglerade miRNAs i tumören. Detta kan åstadkommas med minst tre olika metoder:
- Gruvan cancer Genome Atlas, finns på https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, för sekvensering av data11.
- Utföra Microarray analys från en ny operativt preparat12.
- Använd tidigare publicerade datauppsättningar13.
Anmärkning: Oavsett vilken metod som väljs, ger utdata en bulk uppsättning miRNAs vars uttryck är statistiskt korrelerade (antingen direkt eller omvänt) med tumörbiologi. Denna första grupp utgör den pool av miRNAs som ytterligare analyseras för att identifiera en delmängd av miRNAs som visar de strängaste funktionella associationen genom att utföra en mer dynamisk analys av uttrycks förändringar, som diskuteras nedan.
- Bestäm först den mest signifikant avreglerade miRNAs i tumören. Detta kan åstadkommas med minst tre olika metoder:
- Tillståndsspecifik analys av miRNA-uttryck
- Induktion av celldifferentiering:
- Använd pre-coated Poly-D-lysin (PDL) plast rätter att gynna bildandet av en enskiktslager kultur. Lös PDL i vatten med en koncentration på 100 μg/mL för disk beläggning. Använd 1 mL lösning per 25 cm2 yta. Skölj 2x med PBS 6 h efter applicering av PDL-lösningen.
- Platta mänskliga neurala stamceller i lika mängder (100 000 celler/5 mL) antingen i stamceller medium (neurobasal medium + B27 tillägg + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytic differentiering medium (DMEM + 10% FBS), eller neuronala differentiering medium (neurobasal medium + B27 tillägg, + 2 μm retinoinsyra syra)14. Protokollet för oligodendrocyte differentiering kräver tillsats av IGF-1 (200 ng/ml) efter EGF/FGF avlägsnande14,15.
- Efter cellplätering, placera i inkubator för 1 vecka vid 37 ° c, 5% CO2.
- RNA-extraktion:
- Efter 7 dagar, ta bort cellerna från inkubatorn och ta bort mediet.
- Tvätta cellerna med PBS (5 mL). Tillsätt sedan 1 ml lysis reagens (se tabell över material) för att lysera cellerna och skrapa cellerna i 1,5 ml mikrofugrör tub med hjälp av en cell skrapa. Förvara rören som innehåller de lyserade cellerna i rumstemperatur (RT) i 5 min.
- Fortsätt till total RNA-isolering enligt tillverkarens anvisningar.
- miRNA uttrycks analys:
- Kvantifiera differential uttrycket för specifika miRNAs som identifierades i steg 1,1 bland de tre differentierings mönstren genom realtids PCR, med hjälp av TaqMan-sonder och efter tillverkarens protokoll för omvänd Transkription och PCR-förstärkning ( Figur 1).
- Induktion av celldifferentiering:
- Validering av miRNA-kluster av stressspecifika utmaningar
- Kultur G34 glioblastoma stamliknande celler i neurobasal medium + B27 tillägg + 20 ng/mL EGF/FGF. Börja med 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 låg infästnings kolv.
- Från 48 h efter plätering, tillsätt dubbla koncentrationer av DNA alkylerande medel temozolomid (TMZ) var 5 dagar, enligt följande:
- Börja med 5 μM i 5 dagar. Efter 5 dagar, ta bort mediet och Ersätt med färskt medium utan temozolomid, så att de överlevande cellerna att återhämta sig. Efter 48 h, tillsätt 10 μM TMZ och inkubera i ytterligare 5 dagar.
- Upprepa steg 1.3.2.1, fördubbling av TMZ-koncentrationen varje gång, tills en koncentration på minst 100 μM uppnåtts och cellerna blir resistenta mot läkemedlet10.
- I ett parallellt experiment, bestråla G34 celler enligt följande:
- Från 48 h efter plätering 1 x 106 celler i 5 ml i en 25 cm2 låg fästen kolv, bestråla celler med 2 Gy av energi (alla Irradiator ger fotonen utsläpp är acceptabelt). Återför cellerna till inkubatorn och stör ej. Efter 48 h, bestråla cellerna igen med ytterligare 2 Gy energi.
- Upprepa steg 1.3.3.1 4x tills totalt 10 Gy energi administreras.
- Returnera cellerna till inkubatorn och låt dem återhämta sig i färskt medium i minst 5 dagar före nedströms analys.
- Efter induktion av resistens, lyse celler med Lys reagens och extrahera totalt RNA enligt tillverkarens protokoll.
- Analysera uttrycket för de specifika miRNAs som identifierats i avsnitten 1.1-1.2 enligt beskrivningen i steg 1.2.1 (figur 2).
- Karaktärisering av funktionell konvergens av klustrade miRNAs
- Få den förväntade targetome för varje miRNAs definieras i avsnitten 1.2-1.3 erhålls med miRNA inriktning förutsägelse verktyg.
Anmärkning: Vi brukar tillgripa TargetScan, eftersom dess algoritm uppdateras regelbundet16. Ytterligare förutsägelse verktyg är miRanda17, mirdb18och Diana-mirpath19. Alla dessa program är gratis, webbaserade program.- Från den första sidan av Targetscan, Välj miRNA av intresse från den förifyllda nedrullningsbara menyn. Klicka på Skicka -knappen.
- Hämta den resulterande listan med mål som ett kalkylblad med hjälp av länken Hämta tabell (kompletterande figur 1).
- För att minska risken för falskt positiva förutsägelser, inkludera endast mål i kolumnen bevarade platser i efterföljande analyser. Dessutom kan ytterligare stränghet erhållas genom att använda ytterligare miRNA förutsägelse program (se ovan) och endast inklusive mål som är gemensamma för alla algoritmer.
- Klassificera de resulterande targetomes enligt Gene ontologi kategorier med hjälp av ToppGene Suite20 att utvärdera för berikning av vägar som är gemensamma för varje Mirna.
- Klistra in listan med mål som erhållits från steg 1.4.1 i fönstret "tränings genuppsättning", med HGNC-symbolen som Inmatningstyp. Klicka på skicka > Start. Programmet kommer att ge en output tabell som visar de mest betydelsefulla "go" kategorier för den angivna listan över gener (kompletterande figur 2).
- För att slutligen fastställa bidraget från varje miRNA till regleringen av en gemensam väg eller cellulära processen (i detta fall, kromatin förordning), kontrollera varje targetome erhållits i steg 1.4.1 mot hela listan över gener som är inblandade i den specifika cellulära processen ( dvs kromatin reglering), med hjälp av Venn diagramfunktion som finns i bioinformatik och evolutions genomik webbplats http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
Anmärkning: Detta program tillåter skärningspunkten mellan flera grupper på samma gång (figur 3). De specifika unika mål som tillhandahålls av varje miRNA är sedan kommenterade och valda för nedströms funktionella experiment.- På framsidan av programmet, ladda upp eller kopiera/klistra in listan om Target mRNAs för varje miRNA eller intresse i respektive fönster. Namnge varje lista med en unik identifierare.
- Klicka på Skicka. Programmet kommer att ge en visuell produktion av ett Venn diagram med antalet gener i varje sektor, samt en fullständig lista över mRNA för varje delmängd och skärningspunkter kombinationer.
- Få den förväntade targetome för varje miRNAs definieras i avsnitten 1.2-1.3 erhålls med miRNA inriktning förutsägelse verktyg.
2. montering av miRNA-moduler i ett Polycistronic transgena kluster
-
Beredning av transgen byggnadsställning baserad på miR-17-92 Cluster Locus
- Hämta nukleotidsekvensen för miR-17-92-klustret från Ensembl genomets webbläsare21. Välj den ~ 800 Base pair "Core" sekvens omfattar alla sex kodade Mirna hårnålar av Locus och minst 200-nukleotid kompletterande sekvenser både uppströms (5 ') och nedströms (3 ') av kärnan sekvens.
- Klistra in sekvensen ovan i något ord redigeringsprogram.
- Definiera sekvensen av var och en av de sex infödda hårnålar genom att hämta dem i miRBase22. Markera var och en av dessa sekvenser inom loppet av den tidigare identifierade "Core"-sekvensen. Alla sekvenser mellan varje hårnål representerar spacer sekvenser, som är viktiga för korrekt bearbetning av transgenen.
- Ta bort de infödda hårnål sekvenser från "kärna" sekvens, med undantag för 3-5 nukleotider på både 5 ' och 3 ' ändarna av varje hårnål, som kommer att fungera som en acceptor för de nya hårnålar.
-
Bygga en ny transgenens kodning flera miRNAs val
- Få hårnålsekvenser av miRNAs som är avsedda att överuttryckas i transgenen från miRBase. Observera noga de specifika nukleotider som är platser för mikroprocessor klyvning.
- Ersätt den borttagna hårnålar (steg 2.1.4) med hårnål sekvenser av önskad miRNAs erhållits i steg 2.2.1.
- Lägg till önskade begränsnings sekvenser på båda flanera regioner i transgenens att underlätta subkloning till leverans vektorer val. Kontrollera att de valda begränsnings sekvenserna inte finns i själva sekvensen.
- För negativa kontroller, Använd 20-nukleotid kodade sekvenser för att ersätta den naturliga 20-nukleotid sekvens av varje mogen miRNA. Generera dessa kodade sekvenser med hjälp av ett online-verktyg som https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Verifiering av transgenens tvådimensionella struktur
- Kopiera hela transgena sekvens i RNA-struktur förutsägelse programvara RNAweb Fold23.
- Använd standardprograminställningar och klicka på Fortsätt.
- Analysera den grafiska produktionen, särskilt för närvaron av väldefinierade hårnålar och förekomst av dubbelsträngade Stem strukturer minst 11 nukleotider proximalt till mikroprocessorn klyvning webbplats. Titta också efter frånvaron av förgrenade punkter inom hårnålsekvenserna (figur 4).
3. att erhålla transgener genom DNA-syntes
- Efter utformningen och i silico validering av chimär Mirna klustret, få arbeta sekvens med DNA-syntes från kommersiella leverantörer24 och fortsätta med nedströms kloning till vektorer och transgenens leverans. Vi har använt lentivirala vektorer för in vitro-leverans10 och Adeno-associerade virus (aavs) för in vivo intrakraniell leverans25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod tillät karakterisering av en modul av tre miRNAs som konsekvent är nedreglerade i hjärntumörer, som är co-uttryckt specifikt under neuronala differentiering (figur 1) och involverade i tumörens överlevnad svar efter behandling (figur 2). Detta åstadkoms genom att reglera en komplex onkogena kromatin repressiv väg. Detta Co-Expression-mönster föreslog en stark synergistisk aktivitet bland dessa tre miRNAs (figur 3). Följaktligen användes den andra delen av detta protokoll för att utforma en transgenens (figur 4) som samtidigt kunde sammanfatta uttrycket för de tre mirnas-cellerna i glioblastoma-celler, med utnyttjande av mirnas små och enkla biogenes. både in vitro och in vivo, med betydande inblandning i tumörbiologi och lovande translationell tillämplighet (figur 5A, B, C)10. Dessutom, det visades att transgena klustret är också funktionell i en bröstcancer modell (figur 5D, E).
Figur 1: karaktärisering av en funktionell miRNA-modul i glioblastom. A) vulkanområde som representerar den Differentiellt uttryckta mirnas i humana glioblastoma-prover (n = 516) jämfört med normal hjärna (n = 10) som erhållits från TCGA. I grönt är miRNAs med > 4-faldig skillnad. Den röda cirkeln representerar de 10 mest signifikant nedreglerade miRNAs i glioblastoma. (B) relativ uttryck av de 10 mirnas som valts i (a) under induktion av olika differentierings vägar i neurala stamceller, visar tydlig uppreglering av mir-124, mir-128, och miR-137 moduler under induktion av neurala differentiering. Medelvärde ± SD från tre biologiska replikat (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001; Students t-test, tvåsidiga). Denna siffra har modifierats med tillstånd från referens10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bekräftelse av miRNA-modulärens Co-Expression-mönster vid genotoxisk stress. Relativa uttrycket av de tre miRNAs definieras i figur 1 i flera glioblastoma celler och cellinjer (G62-mesenkymala; MGG4-proneural; U251, U87 Pro-neurala-liknande, och T98G mesenkymala-liknande glioblastoma cellinjer) efter induktion av resistens mot temozolomid (TMZ, rosa staplar) eller joniserande strålning (RT, gröna staplar). Rapporterade är medel med SD från två oberoende replikat. Denna siffra har modifierats med tillstånd från referens10. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av funktionell konvergens hos targetomes av co-uttryckte miRNAs. Venn diagram output från bioinformatik och evolutions genomik webbplats, samtidigt korsar targetome av märkta mirnas med mrnas utgör en go kategori av intresse (i detta fall, kromatin repressorer). mRNAs som unikt riktas mot enstaka miRNAs valdes för fortsatta funktionella studier i efterföljande led. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:2D-struktur för en konstruerad miRNA-sekvens som kodar för de tre miRNAs-klustret. Grafiska utdata från RNAweb Fold programmet. Notera närvaron av tre väldefinierade stam-loop strukturer som representerar hårnålar av varje respektive miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) kodade av Transgene. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tecken på transgen bearbetning och dess biologiska effekt nedströms. (A) relativ kvantifiering av Mirna-uttryck efter lentiviral medierad transduktion av G34 glioblastoma-celler med transgena Mirna-klustret (Cluster 3) eller negativ kontroll (Ctrl). Rapporteras är medel från tre oberoende experiment ± SD. (B) fluorescens mikroskopbilder av G34 glioblastoma sfärer som uttrycker negativ kontroll transgenens vs. Cluster 3 transgenens. Skalstapel = 100 μm. (C) in vivo tillväxt av intrakraniell Human G34 cell xenograft uttrycker antingen kontroll eller cluster 3 transgener. Skalstapel = 1 mm. Denna siffra har reproducerats med tillstånd10. (D) relativ kvantifiering av Mirna-uttryck efter lentiviral medierad TRANSDUKTION av MDA-MB-231 bröstcancerceller med transgena Mirna-klustret (kluster 3) eller negativ kontroll (Ctrl). (E) fluorescens mikroskopbilder av MDA-MB-231 bröstcancerceller uttrycker negativ kontroll transgenens vs. Cluster 3 transgenens. Skalstapel = 100 μm. Alla experiment utfördes i tre exemplar (* p < 0,05; * * p < 0,01; Students t-test, tvåsidiga, multipla jämförelser). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: TargetScan-arbetsflöde. (A) Startsida skärmdump, visar urvalsalternativ för Mirna sökning. Brepresentativa sökresultat för miR-137. Lista över målgener finns i vänsterspalten. Röd ruta betecknar gener med bevarad inriktning webbplatser (vilket tyder på högre förtroende för verklig inriktning). Vänligen klicka här för att se denna siffra. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande figur 2: arbetsflöde för ToppGene Suite. (A) Startsida skärmdump som visar sökrutan där listan över gener som ska analyseras infogas. (B) representativt sökresultat för miR-137 targetome, som visar de mest statistiskt signifikanta gen ontologi (go) kategorier. Vänligen klicka här för att se denna siffra. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll bygger på uppfattningen att miRNAs i stället för att fungera isolerat är biologiskt relevant genom att arbeta i grupper, och dessa grupper är transkriptionellt bestämda av specifika cellulära sammanhang26. För att motivera denna strategi från ett translationell perspektiv, ett uppföljnings protokoll som tillåter rekreation av denna multi-miRNA mönster i celler/vävnader introduceras. Detta är möjligheten, genom att ta fördel av den förhållandevis enkla biogenesen av mirnas, whereby erkännanden av den karakteristiska Mirna hårnål vid mikroprocessor är nödvändig och tillräcklig för korrekt Mirna som bearbetar27. Samtidigt, detta minimala krav tillåter användning av den genetiska ställningen av naturligt förekommande miRNA kluster som en ryggrad för uttrycket av önskade miRNA moduler, som finns inom korta DNA-sekvenser som kan monteras i någon leverans vektorer val. Det viktigaste kravet i detta protokoll är att bibehålla hårnålsstrukturen och tillräcklig längd på Stem-komponenten för att möjliggöra lämplig klyvning.
Det finns två viktiga kritiska överväganden när det gäller genomförandet av detta protokoll. Den första punkten är den exakta bestämningen av de optimala miRNA-kombinationerna. Detta bestäms genom noggrann analys av inte bara miRNA uttrycket signatur av celler eller vävnader jämfört med kontroller, men också av alla samtidiga uttryck förändringar observeras som cellerna experimentellt manipuleras. När en uppsättning av miRNAs definieras, är det också grundläggande att förvissa sig om att den konstgjorda moduleringen av varje singularly inte ändrar uttryck av andra.
Den andra kritiska aspekten gäller byggandet av chimära sekvenser för att artificiellt recapitulate denna funktionella miRNA klustring. Det är grundläggande att följa de strukturella kraven i miRNA bearbetningsmaskiner, som är närvaron av en tillräckligt lång stam sekvens (mätning av minst 11 nukleotider) vid ursprunget för varje miRNA hårnål18, samt underhåll av original mellanrum sekvenser av den infödda miRNA Cluster ställningen. Enligt vår erfarenhet, uppfyller dessa två krav konsekvent har gett lämpliga RNA vikning (figur 4) och resulterade i framgångsrika multi-Mirna uttryck.
Den största begränsningen av denna teknik är det ändliga antalet miRNAs som kan klustras ihop till en funktionell Transgene. Vi har framgångsrikt konstruerat sekvenser som överuttrycker upp till sex olika miRNAs men observerade en viss minskning av bearbetnings effektiviteten när antalet hårnålar ökar. Hittills har den genetiska strukturen i miR-17-92 klustret använts, eftersom det är den som kodar det högsta antalet hårnål (sex) inom den kortaste DNA-sekvensen (~ 800 bas par)8. Eftersom det finns andra naturliga miRNA kluster, det förväntas att de också kan användas för detta ändamål28. Slutligen har det observerats att modifiering av mellanrum sekvenser bland hårnål minskar deras bearbetning, så det finns vissa begränsningar om i vilken utsträckning den inhemska strukturen kan ändras.
Den mest betydelsefulla och fördelaktiga aspekten av denna föreslagna metod är att den tillåter teknik av transgener som samtidigt kan överuttrycka flera önskade miRNAs främst med hjälp av en in silico metod, vilket begränsar behovet av långtråkig och tidskrävande molekylära klonings steg, som tidigare beskrivits29,30,31. Det beskrivna protokollet är lätt att utföra och kräver inte specialiserad utrustning eller kompetens.
Med hänsyn till miRNAs erkända betydelse för molekylärbiologi och deras potential i terapeutiska tillämpningar är detta protokoll av intresse för en stor publik av forskare. Detta tillvägagångssätt förväntas uppmuntra framtida studier som fokuserar på miRNAs kombinatoriska egenskaper och kommer att fungera som ett enkelt och robust verktyg för deras genomförande. Ännu viktigare är att dessa klustrade transgener utgör idealiska Cargos för genterapi vektorer. Bevis för framgångsrik in vivo leverans av en 3-miRNA kluster har redan erhållits via direkt intratumorala intrakraniell injektion av AAV vektorer (opublicerade data). Det är därför väntat att denna teknik kommer att avsevärt öka de translationella aspekterna av miRNA forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Harvey Cushing neuro onkologi laboratorium för stöd och konstruktiv kritik. Detta arbete stöddes av NINDS Grants K12NS80223 och K08NS101091 till P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
